国家标准 GB/T29577一2013 腐烂茎线虫检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofDitylenehusdestruetorThorne 2013-07-19发布 2013-12-06实施国家质量监督检监检疫总局发布国家标准花管理委员会国家标准
GB/T29577一2013 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标准起草单位;北京出人境检验检疫局、深圳出人境检验检疫局本标准主要起草人:江丽辉、李一农、汪万春、李芳荣,赵汗青、吕玉峰、韩晶、龙海、高文娜、边勇
GB/T29577一2013 腐烂茎线虫检疫鉴定方法范围本标准规定了腐烂茎线虫(DiylenchusdesrucorThorne)的检疫鉴定方法本标准适用于蔬菜和花卉的块茎、鳞茎,球茎等根茎部分,其他寄主植物种子茎,叶及栽培介质中腐烂茎线虫的检疫和鉴定规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 sN/T1141一2002鳞球茎茎线虫检疫鉴定方法 sN/T1157进出境植物苗木检疫规程 SN/T1158进出境植物盆景检疫规程 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样腐烂茎线虫基本信息中文名胸烂茎线虫,马铃薯腐烂茎线虫英文名;potatorotnematode;tuberrotnematode 名:DitylenchusdestructorThorne1945 学腐烂茎线虫隶属于线虫门NematodaRudolphi,1808>Lankester,1877,侧尾腺纲Secernenteavonm Linstow ,1905,垫刃目TylenehidaThorne,l1949,粒线虫科Angunidaee" Nicol,1935(1926),茎线虫属 Disl 、Filipjev,1936 'e7ch.S 腐烂茎线虫主要通过寄主植物的块芭、鳞茎、球茎及栽培介质进行远距离传播腐烂茎线虫的其他信息参见附录A 方法原理采集疑似寄主植物材料进行线虫分离,用显微镜观察分离到的线虫,依据腐烂茎线虫的雌虫和雄虫的形态学特征进行形态学鉴定,双重PCR分子生物学检测方法是腐烂茎线虫的重要辅助鉴定手段仪器用具 5.1仪器生物显微镜(100×1000×)、体视显微镜(10×一80×,具透射光源),冰箱、电热恒温箱,PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、低速离心机(1000r/min~5000r/min),纯水仪 5.2用具改进型漏斗分离器、移液器(10AL、25L、100L、1000L);其他用具参见SN/T1141一2002中
GB/T29577一2013 的第3章所列的用具试剂 6 形态学鉴定用试剂参见SN/Tl141一2002中的第4章所列试剂 6.2分子检测试剂 WLB500mmol/I氯化钾、10mmol/LTris-盐酸、pH8.0、15nmmol/L，氯化镁、1.0mmol/L DTT,4.5%吐温20,蛋白酶K600mg/ml)、10×PCR缓冲液(一20笔保存,25mmol/L氯化钙溶液(- -2笔保存),dNTP(0mmdl/几.Tun酶(GsU/l一20C保存)GX载样缓肿液.TAE或T班电泳缓冲液、琼脂糖、,澳酚蓝载样缓冲液(6×TAE缓冲液.60%甘油,0.3%澳酚蓝;4C保存)澳化乙锭(EB,避光保存),DNAladdermarker(一20保存),DNA凝胶回收试剂盒(室温保存)、EcoRI酶 20C保存)、大肠杆菌DHH5a感受态细胞(一70保存),质粒提取试剂盒(室温保存) 现场检测检查对植物进行检查,注意植物地上部分是否有生长不良,叶色失绿,黄化,植株矮化等症状;块茎、鳞茎、球根等是否有干腐、变黑等症状收集上述有为害症状的可疑植物材料及其夹带的介质或土壤,做好记录,写上标签,带回实验室检验 7.2抽样应有针对性地抽取具有可疑症状的样品,分别用塑料袋装好,加贴标识;带回实验室后,打开袋口透气,适当保温,放在20C25C室内待检对于无可疑症状的样品则按要求随机拙样,具体抽样比例按照sN/T1157、SN/T1158和N/T2122 中的规定进行抽样实验室检验 8.1线虫分离采用两种方法进行分离;浅盘分离法按照SN/T1141一2002中B.2中对对线虫分离的要求进行改进型漏斗法参见附录B 8.2标本制作见SN/T1l41一2002中的附录C 8.3显微观察,描述和测计在显微镜下,对线虫进行形态观察、描述和测计 8.4分子生物学检测对形态特征观察可疑的线虫进行双重PCR分子生物学检测见附录C)
GB/T29577一2013 形态学鉴定 9.1茎线虫属形态鉴定特征 g.1.1总则茎线虫属的雕虫和雄虫,其尾形非常相似,呈长圆锥形到近柱形,偶尔丝状,多数c'(尾长一肛门或泄殖腔处体宽)为47,寄主不形成虫壑 9.1.2雌虫体表特征 9.1.2.1 mm1.5mm，虫体一般较纤细,略弯曲,长0.6 表皮有很细的环纹,侧区有4一6条侧线 9.1.2.2内部特征口针细小,多数长度为7Am~114m;中食道球有或无瓣,偶尔无明显的中食道球,峡部与后食道腺之间无缢缩,后食道腺短或长,不覆盖、短覆盖或长覆盖肠 9.1.2.3生殖系统特征雌虫单生殖腺,前伸,卵巢短或长,有时伸达食道区或转折,卵母细胞一行至两行排列,子宫柱状部有四排细胞(每排四个细胞) 有后阴子宫囊,且与虫体中线垂直 9.1.3雄虫雄虫体表特征和消化系统特征与雌虫相似雄虫精巢不转折,精细胞大通常直径3m一5m). 交合伞延伸至尾长的1/43/4处,从不伸达尾顶端交合刺窄细,基部宽大,其上具特殊的突起 9.2腐烂茎线虫形态鉴定特征雌虫 9.2.1.1体表特征温热杀死固定后的虫体略呈弓形向腹弯曲,有细微的环纹,体宽约1m,侧线六条,在虫体两端渐减为两条;唇区低平,略缢缩,唇区框架进行程度较高,侧器孔位于侧唇片 9.2.1.2内部特征口针长度常约为10Am14Am,针锥常占口针长度的45%50%;口针基部球清晰、圆形,前表面向后斜中食道球纺锤形,肌肉发达,有瓣,食道狭部窄,神经环包围处开始膨大为棒状的食道腺体;食道腺延伸,从背面稍覆盖肠的前端一小段《偶尔缢缩);偶然亦能见到后食道腺分枝(叉) 排泄孔位于食道腺位置;半月体刚好在排泄孔前方
GB/T29577一2013 9.2.1.3生殖系统特征阴门清晰、横裂,位于虫体后部,成熟雌虫的阴唇略隆起,阴门裂与体轴线垂直,阴门宽度占4个体环卵巢发达,前伸,达食道腺基部,前端卵原细胞双行排列卵长椭圆形,长度约为体宽1.5倍后阴子宫囊大,延伸至阴距2/34/5 直肠和肛门明显,尾长约为肛门部体宽的3倍5倍尾锥形,稍向腹部弯曲,末端窄圆 9.2.2雄虫虫体比雌虫短而细,前部形态与雌虫相似,经热杀死后体直或向腹面弯曲成弓形尾比雌虫的尾部略窄,且木端尖;单精巢前伸,前端可达食道腺基部泄殖腔隆起,交合伞起始于交合刺前端水平处向后延伸达尾长3/4;交合刺成对,长2！ am一27um,向腹面弯曲,前端膨大具指状突;引带短、简单腐烂茎线虫形态特征图参见附录D. 测计值 9 表1列出了腐烂茎线虫雌虫和雄虫形态测计值表1腐烂茎线虫形态测计值 St 数据来源 T 条 mm m 8 雌虫 0.811.40 3035 10 15~20 7883 Thorne 1945 78 0.80~1.30 3440 12~16 7380 雄虫 194g 930 7390 雌虫 0,69~1,89 4一12 237 Goody 1952 雄虫 0.761.35 2450 41！ 1121 4084 231 4~12 7784 雕虫 0.69一l 一l.89 1849 1420 l013 Brzesk (1991 0.63~1.35 24一50 4一l1 11一21 1012 雄虫注: N 测计的线虫样本数目; 虫体体长(单位为m或mm,头端至尾蹦的长度,不包括尾尖突)5 S 口针长度(单位为am); 体长/最大体宽 -体长/虫体前端至食道腺与肠连接处的距离体长/尾长; 泄殖腔开口至精巢末端的距离×100/体长; 虫体前端至阴门的距离×100/体长 9.5腐烂茎线虫与两种近似种的区别表2列出了腐烂茎线虫与其他两种常见的茎线虫的形态区别对照
GB/T29577一2013 表2茎线虫属三种常见线虫的主要形态区别对照表别种目项腐烂茎线虫鳞球茎茎线虫蘑菇茎线虫 Dilylenchusdestructor D.dipsaci D.myceliophagus 侵染部位主要是地下部分,偶见地上部分地上和地下部分蘑菇菌丝寄生专化性高等植物和真菌专性寄生高等植物真菌是否产生线虫毛不产生产生不产生侧线数目食道与肠覆盖程度覆盖不覆盖覆盖交合刺有无指状突起有无不详锐尖尾部末端形状钝尖钝尖卵原细胞排列情况双行或多行单行单行卵的平均长度与虫体宽相近虫体宽的2倍~3倍约虫体宽的2倍后阴子宫囊与肛阴距比中食道球形状纺锤形纺锤形纺锤形 10 结果判定符合9.2中描述的形态特征的线虫,可鉴定为腐烂茎线虫;或者符合第9章形态特征的疑似线虫，经8.4中的分子生物学检测,采用通用引物扩增获得的PCR产物分别约为940bp(A型腐烂茎线虫和1100bp(B型腐烂茎线虫),经特异性引物扩增的特异性片段约为252bp(A型腐烂茎线虫)和 485bpB型腐烂茎线虫,阴性对照无产物时,也可判定检测的线虫是腐烂茎线虫 11 样品保存 11.1植物材料保存对已经检出带有腐烂茎线虫的植物材料、土壤或栽培介质等,经登记后,要保存在低温干燥、防鼠防虫处,并注明样品编号、截获日期、截获地点、截获人,寄主名称,运输工具名称,来源国等,样品需至少保存一年,有特殊要求可适当延长保存期 11.2线虫标本保存 11.2.1线虫样本的保存如果鉴定为腐烂茎线虫,经线虫固定液固定后置于有4%甲醛溶液的指形管内,在4C冰箱内长期保存,并标上样品编号、制作时间和制作人等相关信息
GB/T29577一2013 11.2.2玻片标本和实验数据的保存经杀死固定后的线虫,可制作成线虫永久玻片标本,保存相关的特征描述及测量数据、绘图或照片同时,应保存相关分子生物学鉴定的文件化试验结果,如;鉴定结果所依据的凝胶照片
GB/T29577?2013 ?A ?? ??? A.1? EPPO;?????,,???,??? ?,,?,???,,??(??,? ?,??,,? :?й(,,?,,,,?,,??,? ?,??????? ;?? :?ī(???ɡ??? ɡ???????) :? ;?(??,??,??????), Σ) A.2Χ ???Χ?,?????120??4070 A.2.1? ??Σ??;(SolanumtuberosumL.,β(Irisspp. TuliagesnerianL.Hyacinhusorientalis)?Gladiolushybridus Hort.(D;hliainnataNeotopterisspp.,(Belaulgaris)?(Daucus arotaspp.Satius),?Petroselinumcrispum,?TrioliumpratenseL.? TrifoliumrepensLinn.?TrifoliumhybridumL.(Aliumcea)(Alium orrum?(ApiumgrazeolensL.,?(CucumissativusL.,?CucurbitaepoL., [Gyeinema.rLMerr.]??CicerarieiunL.Arachihyogaea? Medicugosatiua),?(ViciaJabLinn.,?(Helianthusannws),(Rheumspp., (Mumulusspp.,Iomoeabaakasl.am.),Solanumlycoersicum),?Nicoti anatabacumL.SaccharumoffcenarumL.,(HordeumuulgareС(Triticumaesti un A.2.2 ????,?????,?Agwricsspp.), Aer7ariaspp.,?Armilariasp.,?Brytisspp.),?ùCepMaosy/wriumn spp.)(Cyindlrwarmspp.),ù(Apergiusspp.),(Fwuriusp.),ù(Pernieili wspp.,Phomaspp.,(Pyr rhueasp.)?ù(Tihdlrapp.),?Mwr
GB/T29577一2013 ticillium .)等 spPp. A.3危害症状腐烂茎线虫是一种迁移性植物内寄生线虫腐烂茎线虫主要侵染植物的地下部分,极少危害植物的地上部分引起茎的矮化、增厚和分叉,引起叶的矮化、卷曲和失绿(如在马铃薯上) 线虫通过寄主的旬匐茎或块茎的皮孔和薯眼进人,早期的症状是表皮下面有一小的白色斑点,去皮后肉眼可见此后随着侵染部位的扩大,融合成淡褐色病变,病变部位含有干的颗粒状组织,在表皮下可见随着侵染的发展,组织变干、皱缩,表皮龟裂,变博内部组织逐渐变黑,通常有真菌、细菌、辅类等其他生物的次生侵染,该线虫则在病组织和健康组织交界处聚集有病的块茎在贮藏期皱缩,表现干腐症状危害甘薯块茎的症状与危害马铃薯块根的症状相似被侵染的大丽菊球茎亦表现相似的症状鸢尾和郁金香受侵染通常从基部开始,渐渐向上扩展至肉质的鳞茎,导致灰白色至黑色的病变;严重时根系变黑,叶片发育差,叶尖成黄色 A.4生物学腐烂茎线虫的发育和繁殖温度为5C一34C,最适温度为20C一27C,在20C一24C条件下完成生活史需要20d~26d 该线虫仅可在土壤中作短距离移动,不能远距离自然传播,灌溉水也可携带线虫在田间传播主要随被污染了的植物材料及其他寄主植物的种子,植物组织和地下器官(球茎、鳞茎,根茎等)作远距离的传播、扩散,受该线虫污染了的土壤是另一传播途径
GB/T29577一2013 B 附录资料性附录腐烂茎线虫分离方法改进型漏斗法分离腐烂茎线虫,融合了浅盘法和传统漏斗法各自的优点,在提高漏斗法分离效率的同时,又解决了浅盘法一定要使用套筛而使植物组织等杂物经常堵塞400目筛的筛孔的问题改进型漏斗法分离装置,由一只较大并类似于贝曼漏斗的玻璃或有机玻璃作为外壳，上部装置则与浅盘装置相似(见图B.1) 将线虫滤纸或12层卫生纸平放在筛盘筛网上,用水淋湿滤纸边缘与筛盘结合部分;将待分离线虫的样品放置其上;从筛盘下部的空隙中将水注人分离器中,以淹没供分离的材料为止;在约15C~25C下放置24h48h后,打开止水夹,用离心管接取约5mL的水样;静置20min左右或1500r/min离心 3min,吸去离心管内上层清液后,即获得浓度较高的线虫水悬浮液样品线虫滤纸箭微座乳胶管止水火图B.1改进型漏斗法分离线虫装置示意图
GB/T29577一2013 c 附录规范性附录双重CR分子生物学检测流程 C.1DNA提取 C.1.1洗涤线虫用线虫挑针挑取腐烂茎线虫若干条,放人去离子水中洗涤3次,备用 C.1.2切割线虫在洁净的载玻片上加20L去离子水挑人10条经过洗涤的线虫,用解剖刀将每条线虫切成3一4段" 用移液器将含有切开虫体的去离子水10L转移至灭过菌的200AL的离心管中 c.1.3NA提取在上述管中加人8ALwLB和2L蛋白酶K溶液，于一20C冷冻30nin以上,转人RR仪.65C条件下保温1h一2h,95C条件下保温10min,使蛋白酶失活取出后于13000r/nmin离心1nmin,取其上清液用于PCR扩增或者于一20C保存备用 C.2CR检测 C.2.1引物 C.2.1.1通用引物 rDNAl:5’-TTGATTAcGTcCcTGccCTTT-3’; rDNA25'-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG=3” C.2.1.2特异性引物 DdSl:5'-TCGTAGATCGATGAAGAACGC-3'; DdS2:5'-AT'TATCTCGAGTGGGAGCGC-3’ Ddl:5'-TTGTGTT'TGCTGGTGCGCT'TGT-3'; DdL2:5'-GAGTGAGAGCGATGTCAACAT'TG3’ c.2.1.3内标 D3A5'-GACCCGTcTTGAAACACGGA-3’; D3B,5’-TcGGAAGGAAcCAGCTACTA-3” C.2.2rNA-IIs区的PCR扩增选取通用引物rDNA1和rDNA2,用来PCR扩增腐烂茎线虫rDNA中的5.8S,ITS1和ITS2全序列以及18S,28S部分序列反应体系:5ALl0XPCR缓冲液(含Mg+离子),4L.dNTP,2条引物各1.5ML(20mol/L),2U Tuq以及5l.DN八粗提上清液,最后加去离子水补足s0pl 10
GB/T29577一2013 PCR扩增条件:95C预变性4 94C变性45s,50C退火30s,72C延伸2min,共35个循环 min 72C保温10min;于4C保存 C.2.3电泳取5AlL扩增产物,加1Al.6×载样缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上电泳,然后用凝胶成像仪观察 C.2.4测序 y,转化到大肠选用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化P(CR扩增产物,将其连接到pGEMT ea s 杆菌DH5感受态细胞;用质粒提取试剂盒提取重组质粒后,经EcoRI酶切和PCR检测后,进行双向测序 c.3特异性引物双重PCR扩增检测 c.3.1A型特异性引物的检测 c.3.1.1A型特异性引物CR扩增反应体系;取灭菌的离心管,依次加人25L.10×PCR缓冲液(含Mg”离子),2LdaNTP,引物 DsI,Dus2各0.7L(20ml/L.),UTu酶以及了LDNA粗提上清液作模板,最后加去离子水补足25aL,设阴性对照 PCR反应条件;94C预变性2min;94C变性30s,55C退火30s,72延伸45s,共35个循环 72C保温8min;于4保存电泳检查;取5L扩增产物,加1L6×载样缓冲液在2.0%琼脂糖凝胶上电泳,然后用凝胶成像仪观察 c.3.1.2A型特异性引物双重CR扩增反应体系;取灭菌的Eppendo管,依次加人25L.10XPR缓冲液(含Mg”离子).2L.dNTP 引物D3A、,D3B,Dds1,DdsS2(浓度均为20mol/L)各0.5L,l1UTaq酶以及3LDNA粗提上清液，最后加去离子水补足25L;扩增程序及电泳检查同C.3.1 c.3.2B型特异性引物的检测分别作B型特异性引物的PCR扩增,双重PCR扩增,方法步骤同c.3.1,将引物Dds1和Dds2换成DdL1和Ddl.2即可 1
GB/T29577?2013 ?D ??) ??? ????D.1?D.2. ?: ? B ??; C ?潻?; D ?; E ?; F ?в; G ?档 1973 ?;?Hooper ?D.1???? 12
GB/I29577?2013 ?: ??; A B ??; C,D,E ?; F ???; G ?β -?潻ɡ?? H,I -; ??; ??? ?:?,2006 ?D.21000???????? 13

腐烂茎线虫检疫鉴定方法GB/T29577-2013

腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor Thorne）是一种重要的植物有害生物，对多种经济作物造成危害。为了保障我国作物生产和出口贸易安全，GB/T29577-2013《植物病理学检疫鉴定腐烂茎线虫检疫鉴定方法》应运而生。

GB/T29577-2013适用于对各类植物及其组织、土壤等样品中的腐烂茎线虫进行检疫鉴定。下面将对该标准的主要内容进行介绍。

一、样品采集与处理

样品应从植株受害部位取样，包括根、茎、叶、果实等。如果样品来自土壤，应在植株根系周围采集土样。样品采集前应先浇透水，以便更好地挖掘根部样品。

对于不同类型的样品，处理方法也有所不同。茎、叶、果实等植物组织样品需要进行表面消毒处理，而土壤样品则需要筛选、过筛、沉淀等步骤。

二、检疫鉴定方法

腐烂茎线虫的检疫鉴定主要包括形态学特征观察和分子生物学鉴定两个方面。

1. 形态学特征观察

腐烂茎线虫在显微镜下呈现出典型的形态学特征，如体长、前端口器结构、尾部形态等。通过对这些特征的观察和比对，可以初步判断样品中是否存在腐烂茎线虫。

2. 分子生物学鉴定

分子生物学技术已经成为植物检疫鉴定的重要手段之一。GB/T29577-2013标准规定了PCR扩增和序列分析等鉴定方法的具体步骤和条件。

三、结论

GB/T29577-2013《植物病理学检疫鉴定腐烂茎线虫检疫鉴定方法》提供了一套操作规范和技术要求，为我国腐烂茎线虫检疫工作的开展提供了有力的支撑。在实际应用中，需要根据样品类型和鉴定目的选择合适的检疫鉴定方法，并按照标准规范进行操作，以确保检测结果的准确性和可靠性。