国家标准 GB/T35880一2018 银耳菌种质量检验规程 Regulationsforqualityinspecetionoftremellaulture 2018-02-06发布 2018-09-01实施中华人民共利国国家质量监督检验检疙总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/35880一2018 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由中华全国供销合作总社提出本标准由全国银耳标准化工作组(SAC/SwG9)归口本标准起草单位:全国银耳标准化工作组、福建农林大学生命科学学院、古田县食用菌研发中心、古田县食用菌产业管理局本标准主要起草人:张琪辉、温志强、雷银清,余新敏,龚宽俊、金珊珊、彭冬祥、林铃
GB/35880一2018 银耳菌种质量检验规程范围本标准规定了银耳菌种质量检验的术语和定义、抽样、检验内容与方法、质量要求、判定规则本标准适用于银耳菌种质量的检验规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T29368银耳菌种生产技术规范 GB/T30989高通量基因测序技术规程 NY/T1284食用菌菌种中杂菌及害虫的检验术语和定义 GB/T29368界定的以及下列术语和定义适用于本文件为了便于使用,以下重复列出GB/T29368 中的一些术语和定义 3.1 银耳菌种tremellacuture 生长在适宜基质上具有结实性的银耳菌丝和香灰菌丝的混合培养物注包括银耳母种,银耳原种和银耳栽培种 3.2 银耳母种stockcutureoftremella 经混合培养或基内分离得到的具有结实性的银耳菌丝和香灰菌丝的混合培养物注1改写GB/T29368一2012,定义3.10 注2也称银耳一级种 3.3 oftreella 银耳原种motherspawn 由银耳母种移植、繁殖的培养物注;也称银耳二级种 3,4 银耳栽培种spawnoftremella 由银耳原种移植、繁殖的培养物注也称银耳三级种 3.5 银耳菌种真实性genuinenessoftremellacuture 同时含有银耳菌丝和香灰菌丝的菌种
GB/T35880一2018 3.6 银耳菌种活力 tremellacultureactivity 银耳菌种生长、繁殖、形成子实体的能力 3.7 白毛团myeelium pellet S 银耳菌丝与香灰菌丝混生在培养基表面形成的白色菌丝团 [GB/T29368一2012,定义3.4] 3.8 银耳菌丝体myeliumoftremella 由许多银耳菌丝联结在一起组成的营养体注:银耳菌丝颜色白至黄色,纤细,具分枝及分隔,锁状联合明显 3.9 香灰菌丝体myeeliumofcohabitantfngus 由许多香灰菌丝联结在一起组成的营养体注:香灰菌丝细长,呈羽毛状分枝,爬壁能力和分解纤维素能力强,能分泌黑色素,与银耳菌丝伴生 3.10 漆酶 lacease 含四个铜离子的多盼氧化酶,属于铜蓝氧化酶,以单体糖蛋白的形式存在注:漆酶存在于菌类、植物中,亦可存活于空气中,以其独特的催化特性,被广泛应用于生物检测抽样 4.1抽样方法采用随机抽样法银耳母种、银耳原种、银耳栽培种的抽样数量瓶、袋)分别以每批生产的菌种数量(以每天的生产数量为一批)为单位,按式(I)计算抽样数量 "一式中抽样数量; -每批数量 N 计算结果保留整数 4.2样品的运输与保藏条件样品在运输过程中容器内的温度应控制在18一23,湿度自然;待检样品应放置在18C 23C，湿度自然的环境中,24h内检测;保留样品应放置在18C一23C,湿度自然的环境中保藏备查保藏时间20天检验内容与方法 5 5.1仪器设备和试剂 5.1.1仪器设备 5.1.1.1放大镜:l0倍
GB/35880一2018 5.1.1.2体视显微镜50倍 5.1.1.3灭菌锅;最大温度可达126,最大压力可达0.155MPa 5.1.1.4恒温水浴锅:士1C 5.1.1.5高速冷冻离心机;转速可达10000r/min. 5.1.1.6超净工作台:洁净等级100级@>0.5m. 5.1.1.7PCR仪 5.1.1.8电泳仪;可电压6V600V,电流4mA400t mA 5.1.1.9凝胶成像系统 5.1.1.10紫外可见分光光度计 5.1.2试剂除非另有说明,所用试剂均为分析纯,水为符合GB/T6682规定的三级水 5.1.2.1三胫甲基氨基甲婉 5.1.2.2二水合乙二胺四乙酸钠 5.1.2.3盐酸 5.1.2.4氢氧化钠 5.1.2.5氯化钠 5.1.2.6三甲基祺化铵 5.1.27聚乙烁毗咯烧制 5.1.2.8氯仿 5.1.2.9异戊醇 5.1.2.10饱和盼 5.1.2.11乙醇 5.1.2.12核糖核酸酶(RNase酶) 5.1.2.13碉酸 5.1.2.14引物ITS4 5.1.2.15引物ITs5. 5.1.2.16PCR扩增缓冲液(10×,pH8.3). 5.1.2.17脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 5.1.2.18TaqDNA聚合酶(1.5U) 5.1.2.19核酸染料 5.1.2.20分子标记(DNAmarker):2000bp 5.1.2.21 琼脂糖 5.1.2.22重蒸水;应符合GB/T6682规定的二级水及以上标准 5.2感官检验母种,原种、栽培种感官检验内容和方法如表1所示
GB/T35880一2018 表1母种、原种,栽培种感官检验内容和方法检验内容菌种级别检验方法菌丝体外观菌种容器外观母种菌种瓶和标签的完整性;菌种瓶塞白毛团、香灰菌、子实体生长用眼睛观察、鼻闻、手触摸,必要盖)的松紧度、干燥度.清洁度、气状态原种时用放大镜或体视显微镜观察味,杂菌、害虫和其他污染物栽培种白毛团、香灰菌生长状态 5.3杂菌及害虫检验母种,原种、栽培种的杂菌及害虫检验按照NY/T1284的规定进行 5.4真实性检验 5.4.1DNA的提取母种,原种,栽培种DNA的提取,按照附录A的方法进行也可以采用DNA提取试剂盒进行,要求得到的DNA浓度不低于50ng/ALl.7GB/35880一2018 用放大镜观察,培养物表面没有光滑,润湿的黏稠物;菌种瓶塞盖)处或培养基面没有与正常 a 颜色不同的霉菌斑点,没有害虫的卵,幼虫、蛹或成虫; b 用显微镜观察,培养物没有不同粗细菌丝或异样袍子存在,没有害虫的卵、幼虫、蛹或成虫 NA培养液清澈无浑浊,PDA培养的菌种菌丝生长速度、菌落特征、袍子特征与正常菌种 -致 6.3真实性母种、原种,栽培种真实性应符合以下规定 ITS序列分析过程中,电泳结果同时出现535bp和910bp两条片段，且测序结果满足其中 535bp的片段序列和银耳的ITS序列相似性达98%以上;其中910bp的片段序列和香灰菌的IIS序列相似性达99%以上银耳和香灰菌的IIS序列参见附录D; b 银耳菌种同时含有银耳ITS标记和香灰菌ITS标记 6.4漆酶活力母种.原种、栽培种的漆读酶话力应符合表3的规定表3母种、原种、栽培种漆酶的酶活力指标菌种级别母种原种栽培种 >5.56 >1.39 酶活力/U/L >2.78 判定规则 7.1合格菌种感官,真实性、杂菌及害虫.活力均符合要求的为合格菌种 7.2不合格菌种感官、真实性、杂菌及害虫、活力若有一项不符合要求即为不合格菌种
GB/T35880一2018 附录 A 规范性附录) DNA提取方法溶液配制 A.1 A.1.11.0mol/LpH8.0的Tris-lHCI 称取三胫甲基氨基甲炕(Tris)121.14g,用800mL蒸水溶解,然后用1.0mol/L 的HCl溶液调节pH到8.0,再用燕憎水定容至1000 mL A.1.20.5mol/LpH8.0的EDTA溶液称取二水合乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na2H.O)186.lg,用800mL蒸圜水溶解,然后用1.0mol/几的NaOH溶液调节pH到8.0,再用燕僧水定容至1000mL A.1.3提取缓冲液(SDEB) 称取氯化钠0.585g,量取1mol/儿pH8.0的Tris-HCl溶液25ml,0.5mol/L.pH8.0的EDTA溶液10ml,用蒸僧水溶解定容至100mL,灭菌冷却后待用 A.1.42xCTAB缓冲液称取十六烧基三甲基嗅化铵(CTAB)2.0g、氯化钠8.2g、聚乙烯毗咯烧酮1.0g,量取1nmol/L pH8.0的Iris-HCl溶液10ml,0.5mol/IpH8.0的EDTA溶液4mL,用蒸僧水溶解定容至100mL 灭菌冷却后待用 A.1.5TE缓冲液量取的p8.0的1.0mol/几TrisHcl溶液1.0mL与pH8.0的0.5mol几EDTA溶液0.2mL混合后,用重蒸水定容至100mL A.1.65×TBE缓冲液称取Tris54.0g,棚酸27.5g,用20mL0.,5mol/LpH8.0的EDTA溶液溶解后用蒸水定容至 1000ml A.2DNA提取 DNA提取按照以下步骤进行: 称取白毛团0.1g一0.2g放人研钵中,加液氮研磨至粉状后转移到2ml离心管中,往离心管 a 中加人400Al提取缓冲液(SDEB),涡旋震荡,必要时用手弹离心管使粉末充分溶于SDEB 往离心管中加人2×CTAB缓冲液400L b 在通风厨中,往离心管中加人饱和酚250AL和氯仿:异戊醇=24;1的溶液250L,室温涡 c 旋5min:; d13000 r/min,4C条件下离心5min;
GB/35880一2018 吸取650AL上清液,转移到1.5mL离心管中; ee fD 往上清液中加人455AL(0.7倍体积)的异丙醇,上下颠倒混匀; 130001 ,4条件下离心10min:; r/min， g h倒掉上清液,13000r/min,4丫条件下离心10s,用200AL移液枪将离心管中残余的上清液弃除; 往离心管沉淀中加人70%乙醇900!L,用手指弹离心管使白色沉淀悬浮; 13000r/min,4C条件下离心10min; 用1ml移液枪吸取上清液弃除; k 13000r/min,4条件下离心10s,用200AL的移液枪将离心管中残余的上清液弃除; 在通风厨中,打开离心管盖子,放在96孔板上,让96孔板板面与通风厨台面成直角,放置 m 10min; n)往离心管中加人50Al1004l.含有RNase酶的TE缓冲液，55C水浴30mim; o 将溶解后的DNA暂存于冰上,分别采用超微量分光光度计和1%1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量
GB/T35880一2018 附录 B 规范性附录) rS序列分析 B.1Is引物引物选用ITS基因间隔序列4(ITS4)和ITS-基因间隔序列5(ITS5),引物序列为:ITS4:5'-TcC TcCGCTTATTGATATGC-3';ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3' B.2IIs反应体系和条件 B.2.1PCR反应体系(25L) PCR反应的总体积为25L,含有2.5L10×PCR反应缓冲液,0.2mmol/L.dNTP,引物4mol/L 心 ng一50ng模板DNA,1.5UTaq酶,双蒸无菌水补充体积到25L 按上述比例将反应液各组分加人0.2mPCR管中,混匀,放人PCR仪中,进行PCR扩增 B.2.2PCR反应条件 PCR扩增仪上进行以下循环:94C预变性5min,然后94C变性45s,55退火45s,72延伸 min，扩增35个循环,最后72C延伸10min,4C保存 B.3测序分析 PCR产物经1%1.5%琼脂糖检测后进行单一片段回收,对回收产物按照GB/T30989方法进行测序,测序结果在DNAman软件中同附录D中银耳和香灰菌的标准序列进行双链比对
GB/35880一2018 录附 C 规范性附录漆酶活力测定方法溶液准备 C.1 c.1.10.1mol/L邻苯二酚溶液称取邻苯二(cH.O.Mr=10.1)11些用蒸憎水溶解并定容至1000ml C.1.20.1mol/L.pH4.5的醋酸-醋酸钠(HHAc-NaAc)缓冲液称取醋酸钠4.1g,用蒸馏水溶解,再用冰醋酸调节pH至4.5,定容至500mL c.1.31mmol/L的2'-联氨-双-3-乙基苯并嚏陛琳-6-磺酸(ABIs)溶液称取0.0274迟ABTS用pH4.5醋酸钠缓冲液定容至50mL c.1.4粗酶液把银耳菌种里的子实体去除,然后将上层2em的菌种用拌种器打碎搅拌均匀;取搅拌后的菌种 5.0g，加人25ml燕溜水并搅匀,浸提2h,在4C下10000r/nmin离心10min后所得上清液即为粗酶液设置3一5个重复 C.2 测定步骤在5mL试管中分别加人0.1mol/LpH4.5的HAe-NaAc缓冲液2.7ml、1mmol/L的2'-联氨双-3-乙基苯并嚷陛咻-6-磺酸(ABTS)溶液0.2ml、粗酶液100L,28C水浴保温30min,室温下用紫外分光光度计,在420nm波长测量反应液的OD值,设置3个5个重复,最终结果取平均值以沸水煮101 灭活的粗酶液为对照 min C.3 结果计算将C.2中测得的OD值代人式(C.1)计算得到漆酶活力 10° AOD V》大漆酶活力(U/L)-× C.1 式中: V 反应体系的总体积,单位为毫升(ml); V 粗酶液的体积,单位为毫升(mL); AOD 反应前后OD值变化 A 反应时间,单位为秒(s); 420nm处ABTS摩尔吸光系数为36000L”mol'cm 结果保留2位小数
GB/T35880一2018 附录 D 资料性附录) 银耳和香灰菌的IIs序列 D.1银耳的IIS序列 TcCTcCGcTTATTGATATG GGCCAG AGTGCAAAAGTAAAGGG GTGAAACCACTAACGC GGTcAGAAAcccCAGGG GGGGGcGCGGTCCGATGTGCACAGGTGTTTGGAAGGGcCTcGTGGcCccGGTGTAATCTCAA ATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCC D.2香灰菌的IIS序列 TCcTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTAATCCGAGGTCAA AGCGGTCCTACTCGGCG CTGCACTAACCGTACCCC GAAGGATGGGTAGCACTCAGGCACCTCCCCAGCAGAACCCCCCCT'TAGGGGAGCCCTGTGG GTAGGCTAAAGCGGTACGCCGGAGGAAACATAGGTAGGTTCACAAAGGGTTGGAGTTTTT GATAAcTCAGTAATGATccCTcCGCTGGTTCAcCAAcGGAGAccTTGTTACGAcTTTTACT TCC 10
GB/35880一2018 考文参献 [1]NY/T1846一2010食用菌菌种检验规程 [[2]DB35/T1203一2011银耳栽培种质量检验规程

银耳菌种质量检验规程GB/T35880-2018解读

1. 规程制定背景

为了规范银耳菌种质量的检验工作，保障产品质量和消费者权益，国家质量监督检验检疫总局于2018年发布了《银耳菌种质量检验规程GB/T35880-2018》。该规程制定的目的是为了使银耳菌种质量的检验与评价更加科学、准确、可靠。

2. 适用范围

该规程适用于银耳菌的种质量检验和评价，涉及到银耳菌的生产企业、检验机构以及消费者等相关方面。

3. 术语和定义

在规程中，对于银耳菌相关的术语和定义进行了明确定义，以统一理解。

4. 质量指标

规程对银耳菌的质量指标进行了详细的说明，主要包括外观、色泽、气味、湿度、灰分、蛋白质含量、总糖含量、营养成分等方面。这些指标是衡量银耳菌种质量的重要依据。

5. 检验方法

为了保证银耳菌种质量检验的准确性和可靠性，规程对银耳菌的检验方法进行了详细的介绍。主要包括外观检查、显微镜检查、化学分析、微生物学检查等多种方法。

6. 质量控制

该规程还对银耳菌种质量检验过程中的质量控制进行了规定，包括样品的采集、贮存和运输，以及实验室设备和环境的控制等方面。

总之，银耳菌种质量检验规程GB/T35880-2018的发布，将有助于推进银耳菌质量的提升和规范化，为消费者提供更加安全、健康的产品。