国家标准 GB/T28073一2011 南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法 Deteetioandidentificatioofarabis0saicvirIs 2011-12-30发布 2012-06-01实施国家质量监督检监检疫总局发布国家标准花管理委员会国家标准
GB/T28073一2011 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标淮起草单位厦门出人境检验检疫局、上海出人境检验检疫局、检验检疫科学研究院、福建出人境检验检疫局本标准主要起草人:廖富荣、于翠、张永江、陈红运、林石明陈青、黄蓬英、沈建国、吴媛
GB/T28073一2011 南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法范围本标准规定了南芥菜花叶病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法本标准适用于植物种子、鳞球茎、苗木和组培苗等植物及其产品中南芥菜花叶病毒的检测与鉴定南芥菜花叶病毒基本信息中文名;南芥菜花叶病毒英文名;arabismosaie viruS 异名;arabismosaienepovirus;hopnettleheadvirus(啤酒花荨麻病病毒);rhubarbmosaicvirus(大黄花叶病毒);raspberryyellowdwarfvirus(悬钩子黄矮病毒);ashringandlinepatternviurs(白腊树环线状病毒);rhabarber-mosailk-virus(大黄花叶病毒);forsythiayellownetvirus(连翘黄网状病毒); jasmineyellowblotchvirus(茉莉黄斑病毒) 英文缩写:ArMv 属豇豆花叶病毒科Comoviridae,线虫传多面体病毒属Neoirus. 南芥菜花叶病毒的其他信息参见附录A 方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAsELISA)、反转录和体外DNA扩增技术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行检测鉴定主要仪器设备本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备: 微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平(感量;0.001g)、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪,水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽,pH计等和各种量程的可调移液器(1000AL,200aL 100L、20l、l0pL2L) 检测与鉴定 DAS-ELISA检测把0.5其一1.0只样品充分研磨或在液氮中研磨,按110比例加人样品提取缓冲液,转移到了ml 离心管中,8o00r/min离心5min,上清液作为DASELISA的检测提取液设置阴性对照,阳性对照和空白对照,阴性对照的种类和材料(如;种子或叶片)应该尽量与所检测样品类型相一致具体操作过程见附录B 注;提取液在3h内使用,否则保存在4C中
GB/r28073一2011 5.2RT-CR检测分别提取检测样品的总RNA,然后用RT-PCR检测用健康的植物组织作阴性对照,用感染 ArMV的植物组织作阳性对照,用超纯水作空白对照具体操作过程见附录C 5.3实时荧光RT-PCR检测分别提取检测样品的总RNA,反转录合成cDNNA后用实时荧光PCR检测用健康的植物组织作阴性对照,用感染ArMV的植物组织作阳性对照,用超纯水作空白对照具体操作过程见附录D. 5.4序列测定将R产物回收后,进行克隆,测序,或者直接测序,测序可由生物公司完成把测序所得到的核苷酸序列与已知的ArMV相应序列进行比对,如果翻译后氨基酸序列与已知的ArMV相应序列同源性大于75%则判定为ArMV序列,小于75%则判定为非ArMIV序列洼;序列比对可利用NCcBI网站上的BL.AST软件进行,网址为http://www.ncbhi.nlm.nmih.gov/BL.AsT/ 结果判定与报告结果判定当产生以下检测结果时,则判定为检出ArMV: -当DAsELISA检测,RT-PCR检测,实时荧光RT-PCR检测,其中有两种方法检测结果呈阳性时，判定为检出ArMV; -当RTCR检测结果呈阳性,测定的序列为AnMV序列,则判定为检出ArMv 6.2结果记录与保存记录各项实验数据,包括样品种类,来源,检测时间,地点、方法和结果等血清学检测结果保存吸光值的数据报告,RT-PCR检测结果保存电泳照片,实时荧光RT-PCR检测结果保存采集的数据,序列测定结果保存测序报告图
GB/T28073一2011 附录A 资料性附录南芥菜花叶病毒简介 A.1分布欧洲;奥地利白俄罗斯、比利时、保加利亚、塞浦路斯、捷克共和国、丹麦,芬兰、法国、德国,匈牙利、爱尔兰,意大利、拉脱维亚,立陶宛、卢森堡公国、摩尔多瓦,荷兰,挪威波兰,罗马尼亚、俄罗斯,斯洛伐克、斯洛文尼亚、瑞典、瑞士,英国、乌克兰和南斯拉夫亚洲:日本,哈萨克斯坦、土耳其,伊朗非洲;南非北美洲:加拿大,美国大洋洲:澳大利亚、新西兰 A.2形态特征该病毒属线虫传多面体病毒,病毒粒体为等轴对称二十面体,直径约30nm,为双分体病毒，含有两条相对分子质量分别为2.4×10和1.4×I0的单链RNA 超速离心后分为T(53s),M(93s)和 B(126S)三个组分该病毒具有一个外壳蛋白,相对分子质量为54kDa A.3寄主范围及症状 ArMV可侵染174属215种植物主要为害的作物有大麻(Caunabissatiua),啤酒花(Humulu upulus),黄瓜(Cucumissativus)、西葫芦(Cucurbitaeo)、莴苣(Lactucasatiu、草莓(Fragaia ,葡萄(Vitisvini/era)、香石竹(Dianthuscaryohylus)、水仙(Narcissustazetta、蔷薇 a717aSS (Rosamultilora),草木犀(Melilotussuaveolens),郁金香(Tuliagesneriana),芹菜(Apiumgraeo ens),薄荷(Menthaspiperita)、丁香(Syringaoblata)、大豆(Glycinema.r),甜菜(Betaulgaris)、马铃薯(Solanumtuberosm),烟草(Nicotianatabacum),番茄(Lycobericonesculentumn),菜豆(Phaseolus uulgaris)、豇豆(Vignaunguiculala、蚕豆(Viciaaba、豌豆(Pisumscatwum、甜瓜(Cucumis melo),花椰菜BrassicaoleraceaL.var botrytis)、菠菜Spinaciaoleracea、胡萝卜Daucus carota)等 ArMV引起的最常见症状是叶片斑驳和脱落、植株矮化、严重畸型,耳突症状随着寄主植物、病毒的分离物,栽培条件,季节和年份的不同而改变有时候ArMV的侵染是隐症的,并不会在寄主植物上表现症状在鉴别寄主上产生的症状: 昆诺蔡(Chenopoadiumquinoa)和览色藜(C.amaranticolor)接种叶上形成褪绿的局部斑点,然后形成系统性斑驳 b 黄瓜(C.salivs);接种的子叶上产生褪绿的局部斑点,以及系统性脉带或黄色斑点; e)菜豆(P.wlgaris);产生坏死的局部枯斑,系统性坏死和畸型; d 矮牵牛(Pet yida):产生局部坏死斑点或小的坏死环和系统性环斑,以及线状斑或 etuniahybr 明脉
GB/r28073一2011 然而,并不是所有株系能够产生这些明显区别的症状,如啤酒花株系(ArMV-H)就不能产生这些明显的症状另外,ArMV经常与草莓潜隐环斑病毒(strawberylatentringspotvirus s,SLRV)等病毒混合侵染,从而产生更加复杂的症状因此,使用鉴别寄主进行鉴定时,还需结合其他方法,如DAS ELISA等 A.4传播途径 ArMV主要通过汁液摩擦接种,种苗传播也很普遍，也可通过介体线虫传播通过种子传播的寄主:莴苣(L.satiua)、松草莓(F.ananassa)、大豆(G ma.r),甜菜(B.vulgar 1r”is Var ， saccharifera),番茄L.esculentum)等通过块茎传插的寄主:马铃薯(s.tabersm)等 neriana、百合(Liliwmbroteni 通过鳞球茎传播的寄主,水仙(N. taxetta、郁金香Tulip gesr var.coleheseri)等 asa)、啤酒花(H.lupulus)、香石竹通过苗木传播的寄主;葡萄(V inijfera),草莓(F.anana 2.urywphyla),酱散(R. D. nuli/lora)等传播介体主要为异尾剑线虫(Xiphinemadiversicaudatum) A.5血清学特性 ArMV具有很强的免疫原性,提纯的病毒免疫兔子后,可以制备出高质量的抗血清 ArMV抗血清与烟草环斑病毒(tobaccoringspotvirus,TRsV)、番茄环斑病毒(tomatoringspotvirus,ToRsV)抗血清之间无交叉反应,与健康寄主和常见的自然寄主蛋白也无反应 A.6线虫传多面体病毒属区分种的标准线虫传多面体病毒属区分种的标准是 a)外壳蛋白(Coatprotein,CP)的氨基酸序列同源性小于75%; 聚合蛋白酶的氨基酸序列同源性小于75% b e)在可能的成分间没有假重组; d)抗原反应有差异; 不同的介体种类 e
GB/T28073一2011 附录 B 规范性附录 DAS-EL.IsA检测操作步骤 B.1DAS-ELISA所采用的试剂 B.1.1包被缓冲液(pl19.6) 碳酸钠(Na.,cO. 1.59g 碳酸氢钠(NaHCO. 2.93g 0.20g 叠氮化钠(NaN, 加人900mL蒸僧水溶解,用HCl调节pH值到9.6,然后加水至1L. B.1.2磷酸盐缓冲液(PBs,pHH7.4 8.0 氯化钠NaCI g 0.2 磷酸二氢钾KHPO g 磷酸氢二钠(NaHPO 1.15g 氧化钾(KCD 0.2 g 叠氮化钠NaN, 0.2g 加人900mL蒸僧水溶解,用NaOH或HCl调节pH值到7.4,然后加水至1L B.1.3PBs1 ween-20. 每升PBS中加人0.5ml的Tw B.1.4样品提取缓冲液(p7.4 4) PBST十2%PVP(PVP40聚乙烯基毗咯炕酮 B.1.5酶标抗体稀释缓冲液 PBST+2%PVP+0.2%卵白蛋白 B.1.6底物缓冲液二乙醉醇胶 97ml 蒸憎水 600ml 叠氮化钠NaN, 0.2g 用HCl调整pH至9.8,然后加H.0到1L 注缓冲液可以储存在4C一10C中至少2个月,使用前回温至室温 B.2操作步骤 B.2.1包被根据检测试剂盒说明,用包被缓冲液稀释ArMV抗体(如1;200),在微孔板中每孔加人100L包
GB/r28073一2011 被抗体溶液在室温下孵育2h一4h或4C下包被过夜 B.2.2捕获抗原倒去孔中的抗体包被溶液,用PBST洗4次5次(可在洗板机上完成) 加人100AL检测样品提取液到酶标板的孔中,每个样品至少2个重复并设置阳性和阴性对照在室温下孵育2h或4下过夜 B.2.3加入酶标抗体根据试剂盒说明用酶标抗体缓冲液稀释相应的酶标抗体(如l:200) 倒去孔中的检测样品提取液,用PBST洗4次5次孔(可在洗板机上完成) 每孔加人100L酶标抗体溶液在室温下孵育 2h B.2.4加底物用底物缓冲液把对硝基苯磷酸二钠盐(pNPP)配制1mg/mL的底物溶液倒去酶标抗体溶液,用 PBST洗4次一5次或在洗板机上完成每孔加人100L新鲜配制的底物溶液室温下避光放置 30min一60min,至阳性对照孔明显显色 B.2.5吸光值的测定用酶标仪在405nm处读取吸光值 B.3结果判定通过酶标仪上405nm的OD值来判定对照孔的OD值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应该在质量控制范围内,即:缓冲液孔和阴性对照孔的OD值<0.15,当阴性对照孔的OD值<0.05时,按0.05计算阳性对照有明显的颜色反应;孔的重复性基本一致在满足了该要求后,结果判断如下 -样品OD值/阴性对照OD值明显>2,判为阳性; 样品OD值/阴性对照OD值明显<2,判为阴性; -样品OD值/阴性对照OD值在值附近,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验证
GB/T28073一2011 附录c 规范性附录 RI-CR检测操作步骤 C.1主要试剂 C.1.1RNA提取试剂 TRlzolreagent、三氯甲婉,异丙醉、70%乙醉 C.1.2反转录试剂 MEMIV反转录酶(200U/L),5×反应缓冲液(250mmol/LTis-HClpH8.325C,375mnmol/LKCl、 15mmol/LMgCl,50mmol/1DTT),dNTP混合液(各10mmol/L),RNaselnhibitor(40U/L. C.1.3CR试剂 10×PCR缓冲液(含15mmol/儿的Mg'+)、TaqDNA聚合酶,dNTP混合液(各10mmol/L). C.2引物序列 ArMV的特异性引物及其序列见表C.1,位于RNA2的CP基因上,预计扩增产物大小为370bp 引物可由有关生物公司合成和纯化表C.1RT-PCR的引物和序列引物名称引物序列在D10086"上的位置 ArM 5'-TTGGCAG(cGGATTGGGAG;TT-3 1201139 ArM2 5’-ATTG(GTTCcAGTT(GTTAGTGAC-3'” 1468~1489 注也可以采用ArMV其他特异性引物在GenBank上的基因序列登录号 c.3总NA的提取 lrege充分研磨,宝温放置了min;1200！离心取0.0G着一0.1区检测样品,加人 mlTRIzol 5min,取上清液到另一离心管中;加人三氧甲婉200aL,充分振荡15s,室温放置3min;12000g,！离心15mim取上层水相加人另一离心管中,加人0.5ml.异丙醇,1200g4笔,离心10min,弃去上清液;加人1mL70%乙醇洗涤;RNA沉淀干燥后,加经过焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的超纯水40L 溶解即可注本方法是根据TRIolreagent方法提取总RNA,在保证总RNA质量的情况下,也可以采用其他总RNA提取方法
GB/r28073一2011 C.4eDNA合成在3L.的总RNA中加人1AL的ArM2引物(104mol/儿L),于95的水浴中7min,然后迅速冰浴5min 继续加人5×RT缓冲液2.5ALdNTP混合物(10mmol/1)0.5Al,M-MLV反转录酶 200U/AL)0.5AL,RNasin0.5AL、经DEPC处理的ddH,(O4.5AL 然后37C水浴1h,95C水浴 10min. ,自然冷却至室温，一20C冰箱中保存 C.5PCR扩增以上述合成的cDNA为模板,进行R扩增在PR的薄壁管中分别加人以下试剂(25L体 mmol/L的Mg+)2.5AL、TuqDNA聚合酶(2.5U/L)0.5AL,dNTP 系):10×PCR缓冲液(含20nr 混合物(每种各含10mmolL)0.5L、ArM1引物(10Amol/L)1.0L、ArM2引物(10Amol/L 1.0l,cDNA3.0ML,ddH,O16.5Al 反应条件;94C预变性3min,然后94C变性30s,56退火30s、72延伸1min,进行35个循环,最后一个循环结束后72C继续延伸7min c.6琼脂糖凝胶电泳 RTPCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析每个样品取5L的RTPCR产物与1L的6×上样缓冲液混合均匀,并加到置于0.5×TBE缓冲液的1.5%琼脂糖凝胶孔中,然后在120V下电泳电泳结束后,放人装有0.5g/aL的澳化乙锭(EB)溶液的容器中染色,然后在清水中清洗后,在凝胶成像系统中观察,拍照,并保存照片结果判定在阴性对照没有产生条带、阳性对照产生约370bp的预期大小条带情况下,如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带,则判定为阳性;否则判定为阴性
GB/T28073一2011 附录D 规范性附录实时荧光RI-PCR方法 D.1引物及探针序列本方法的引物及探针序列见表D.1,扩增区域在ArMV基因组RNA2的CP基因上,扩增长度 100bp 其中ArM3为正向引物,ArM4为反向引物,探针5'-端标记报告荧光染料6-carboxy luorescent(FAM),3’-端标记淬灭荧光染料tetra-methylear-boxyrhodamine(TAMRA). 注:探针也可以用其他荧光染料标记实时荧光RT-CR的引物和探针序列表D.1 引物名称引物序列在AM238665上的位置心 ArM3 5'-CACTGTAGCCCTTGGAGATAATCCC-3’ ArM4 5'-GCCTTCCAGGTCCCACATTAACTTT-3’ 98~121 ArM-Probe 5'-(FAM)CTCACATGATAGCTTGTCATGGACTCC(TAMRA)-3 51一77 在GenBank上的基因序列登录号 D.2总RNA的提取总RNA提取见C.3 D.3实时荧光RT-CR检测反转录合成cDNA见C.4,然后进行实时荧光PCR检测在25AlL的反应体系中加人:12.5Al 的2×Pre remixExTaq,1.0L引物ArM3(10Amol/L),1.0L引物ArM4(10mol/L),Taqman探针 ArMProbe(I0wmol/L)0.5A.0.了AL的RoxRedlereneDye.a.0l合成的cdNA,超纯水a.5山. 使用实时数据采集模式,反应条件为:95C预变性10min,然后95C15s,60C40s共40个循环注:也可采用其他公司的试剂盒,各种试剂的量根据具体情况进行调整 D.4结果判定在阳性对照C值<34,阴性对照和空白对照的C值>40前提下 -如果检测样品的Ct值<35时,则判定为阳性; -如果检测样品的Ct值之40时,则判定为阴性 -如果35

南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法GB/T28073-2011

南芥菜花是十字花科蔬菜中的一种，并且是我国重要的蔬菜之一。然而，南芥菜花叶病毒的侵袭给南芥菜花的生产和贸易造成了很大的威胁。因此，建立有效的南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法变得非常必要。

什么是南芥菜花叶病毒？

南芥菜花叶病毒属于病毒学上的单股正链RNA病毒，是由烟草花叶病毒科（Tobamoviridae）的花斑花叶病毒属（Tobamovirus）引起的一种植物病毒，可感染南芥菜花等十字花科蔬菜。该病毒主要通过种子、衣领组织、叶子和茎部相互接触而传播。

GB/T28073-2011检疫鉴定方法

GB/T28073-2011《南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法》是由中国国家标准化管理委员会于2011年发布的国家标准，主要适用于对进出口种子、苗木、果实、蔬菜等进行检测，以确保其不含南芥菜花叶病毒。

该标准规定了南芥菜花叶病毒检测的样品制备、检测方法、结果判断等方面的要求。其中，样品制备包括植物材料的采集、处理和提取RNA等步骤；检测方法包括RT-PCR法和ELISA法两种，其中RT-PCR法灵敏度高、具有较强的特异性，并且能够检测到多个南芥菜花叶病毒亚型。

总结

南芥菜花叶病毒是影响南芥菜花种植和贸易的重要因素，GB/T28073-2011标准提供了一种可靠的检测方法，可以对进出口的蔬菜、果实、苗木和种子进行检测。健全的南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法有利于保障我国南芥菜花产业的稳定发展。