伪狂犬病诊断方法

伪狂犬病诊断方法

国家标准 GB/T18641一2018 代替GB/T186412002 伪狂犬病诊断方法 Diugnwstiemethodfor”pseudorabies 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/T18641一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准代替GB/T18641一2002《伪狂犬病诊断技术》 与GB/T18641一2002相比,主要技术变化 如下: -增加了检测猪伪狂犬病病毒gB抗体的阻断ELISA方法; -增加了检测伪狂犬病病毒野毒gE-PCR方法 本标准由农业农村部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口 本标准起草单位;华中农业大学、动物卫生与流行病学中心 本标准主要起草人;何启盖、库旭钢,吴斌、陈品,方六荣、李晓成、姜雯、孟宪荣、范盛先、刘正飞 吴发兴、吴美洲陈焕春 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 GB/T186412002
GB/T18641一2018 引 言 伪狂犬病(Pseudorabies，Pr;Ajeszlky'、disease，AD)是由伪狂犬病病毒(Pseudornabiesvirus PrV)引起的一种多种动物共患传染病,可危害猪、牛,羊,犬、猫、家兔、小鼠、狐狸和浣熊等多种动物,呈 世界性分布 该病对养猪业的危害最为严重,病毒感染后,妊娠母猪出现流产、产死胎和木乃伊胎 15日龄内仔猪出现神经症状,致死率100%;断奶仔猪出现神经症状和呼吸道症状,致死率10% 20%;生长猪和育肥猪出现呼吸道症状,增重缓慢、饲料报酬低;种母猪发生返情和空怀,屡配不孕;公猪 出现睾丸炎性肿胀或萎缩,失去种用能力 除猪外,其他动物感染伪狂犬病病毒后,可出现体温升高、奇 痒和脑脊髓炎等临床症状,最终死亡,但呈散发形式 本标准规定的常规血清学技术可用于非免疫动物的诊断,血清流行病学调查和免疫动物抗体检测 其中,中和试验特异性强,是国际贸易中通用的法定方法,用于口岸进出口检疫;乳胶凝集试验简便快 速、敏感性高,适用于基层单位对该病的现场检测和筛查;酶联免疫吸附试验(ELISA)包括全病毒抗原 ELIsA(PV-ELISA)和gBELIsA方法,适用于实验室开展大批血请清样品抗体检测 本标准中的gE EL1SA鉴别诊断方法,可区分伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗免疫猪和自然感染猪,因此,可用于猪群 野毒感染的诊断和流行病学调查 本标准中规定的3种ELISA方法仅用于检测猪血清中的伪狂犬病 病毒抗体,不适用于检测其他动物血清中伪狂犬病病毒抗体 本标准规定的病原学诊断方法用于检测死亡和剖检动物的病料、流产胎儿组织(如扁桃体、肺脏和 脑组织等),活体动物的扁桃体、鼻拭子和公猪精液中的伪狂犬病病毒 其中,病毒分离鉴定限于有条件 的实验室使用,聚合酶链式反应具有快速和灵敏的特点,可同时检测大批样品,但需注意样品交叉污染 家兔接种试验需在有隔离和消毒条件的动物房中进行
GB/T18641一2018 伪狂犬病诊断方法 范围 本标准规定了伪狂犬病的血清中和试验、乳胶凝集试验、伪狂犬病病毒抗体ELISA(PrV-ELISA、 猪伪狂犬病gBELISA(阻断法)和gE-ELISA(阻断法)等抗体检测方法及病毒分离鉴定,聚合酶链式反 应和家兔接种试验等病原检测方法 本标准适用于猪、牛、羊,犬,猫及其他易感动物的伪狂犬病诊断、检疫,免疫抗体评估和流行病学调 查等 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 NY/T678猪伪狂犬病免疫酶试验方法 血清中和试验(采用固定病毒稀释血清法 3.1仪器 3.1.1二氧化碳培养箱 3.1.2生物安全柜 3.1.3微量移液器 3.2耗材 3.2.1细胞培养瓶 3.2.296孔细胞培养板 3.2.3吸管 3.2.4 移液器吸头 3.3试剂 3.3.1DMEM培养液(见附录A. 3.3.20.25%胰酶见附录A) 3.3.3PK-15细胞 3.3.4伪狂犬病阳性血清 3.3.5阴性血清 3.3.6伪狂犬病病毒(野毒株)
GB/T18641一2018 3.4操作步骤 3.4.1病毒半数细胞培养物感染量(TcID.)的测定 3.4.1.1病毒培养和收获 将伪狂犬病病毒(野毒株)接种于长成单层的PK-15细胞,接种量为液体培养基的1/10体积,37C 培养,待出现病变后,将细胞培养物冻融,离心去除细胞碎片,收获病毒 3.4.1.2病毒效价测定 ~10-"稀释,每个病毒稀 3.4.121用DMEMM培养液将伪狂犬病稍毒作连续10倍稀释,即10',I0 释度取100L 加人96孔细胞培养板中 每个病毒稀释度接8个孔 3.4.1.2.2每孔加人100pL经0.25%胰酶消化的PK-15细胞悬液细胞含量以10个/ml左右为 宜) 设非接毒,加等量DMEM的正常细胞培养对照 3.4.1.2.3细胞96孔板置37C,5%CO培养箱中培养 3.4.1.2.4逐日观察接毒细胞的病变,观察4d~5d,记录每个病毒稀释度接种细胞的细胞病变(cPE) 孔数 在观察期内,未接种病毒的细胞应无CPE. 3.4.1.3TcID.计算 按照Reed-Muench法计算病毒的TCIDm(见附录B) 3.4.2血清中和抗体效价的测定 血清灭活 3.4.2.1 将无溶血、清亮的待检血清置于56C水浴,灭活30nin. 3.4.2.2血清稀释 在细胞培养板孔中加人50LDMEM培养液,随后在第1孔中加人待检血清50AL混匀后.用微 量移液器取出50L加至第2孔中,混匀后再取出50AL 加至第3孔中,依此类推,直至第10孔(将混 合液弃去50AL),血清稀释度即为1:2、1:4、1:811024,每份待检血清稀释度作4个重复 3.4.2.3加入病毒 将50L含200个TcD的病毒液加到不同稀释度的血清孔中,37C作用1h. 3.4.2.4接种细胞 每孔中加人100LPK-15细胞悬液(细胞含量以3×10个/ml5×10个/mL左右为宜),置 37C,5%cO培养箱中培养 3.4.2.5设立对照组 3.4.2.5.1病毒对照组 每次试验均应设病毒对照 将200TcD.,病毒液作10倍、100倍、1000倍稀释 每孔加人50L 不同稀释度的病毒液、,50ALDMEM培养液和100ALPK-15细胞悬液 每个稀释度病毒4个重复 3.4.2.5.2血清对照组 用已知中和效价的阳性血清、阴性血清与相同滴度的病毒孵化后,接种PK-15细胞;同时设正常培 养的细胞对照
GB/T18641一2018 3.4.2.6结果观察 逐日观察,记录病变和非病变的孔数,共观察4d5d 1000倍稀释病毒(0.2TCID)对照组不 引起细胞病变,100倍稀释病毒(2TCID..)对照组应有02孔细胞病变,10倍稀释病毒(20TCIDm)对 照组均应有细胞病变;阳性血清、阴性血清和正常细胞对照成立,待检血清对PK-15细胞应无毒性,测 定结果方有效,否则该试验不成立 3.4.2.7结果判定 按照ReedMueneh方法(见附录B)计算抗体效价,如血清中和效价>1:2,可判定为伪狂犬病抗 体阳性 乳胶凝集试验 4.1仪器 0AL50L微量移液器 4.2耗材 4.2.1移液器吸头 4.2.2洁净干燥载玻片 4.2.3洁净牙签 4.3试剂 4.3.1伪狂犬病病毒乳胶凝集抗原(使用前轻轻摇匀 4.3.2伪狂犬病阳性和阴性血清,稀释液(见附录C 4.4操作步骤 4.4.1对照试验 取等量的乳胶凝集试验抗原(约20AL)分别与阴性血清,阳性血清在洁净的玻片上混合,混合液直 径以不超过1.0cm为宜 如阴性血清与抗原混合后不出现凝集,而阳性血清与抗原混合后出现相当于 或高于50%凝集程度,则对照试验成立 4.4.2待检血清处理 待检血清不必经热灭活或其他方式灭活,但应清亮透明,无溶血 4.4.3待检血清的检测 将待检血清用稀释液倍比稀释后,各稀释度取15AL20AL.与等量胶乳凝集抗原在洁净干燥的载 min3 玻片上用牙签搅拌充分混合,混合液直径以不超过1.0cm为宜 静置,在1 min内观察混合液 的凝集现象 4.4.4判定标准 00%凝集程度:混合液透亮,凝集颗粒聚集在液滴的边缘 75%凝集程度:混合液透明,出现大的凝集颗粒
GB/T18641一2018 50%凝集程度:混合液略浑浊,凝集颗粒较细 25%凝集程度;混合液浑浊,有少量凝集颗粒 不凝集待检血清与抗原混合后,呈浑浊状态,无可见凝集颗粒 4.4.5结果判定 4.4.5.1待检血清倍比稀释后,分别与抗原混合,如出现50%凝集程度,该血清判为伪狂犬病抗体阳 性,否则判为抗体阴性 以出现50%凝集程度的血清最高稀释倍数为该血清的抗体效价 4.4.5.2本方法检测感染或免疫后产生的早期抗体lgM 当lgM消失后,本方法检测为阴性 此时 可用3.4.2“血清中和试验(适用于所有动物待检血清检测)”或5.2或5.3或5.4的“酶联免疫吸附试验 检测(仅适用于猪血清)”,可能出现以下3种结果: 任何一种方法为阴性,判为伪狂犬病抗体阴性; a b 任何一种方法为可疑,建议在间隔2周后再用血清中和试验或ELISA检测,如这两种方法均 为阴性或可疑,判为阴性; 血清中和试验和酶联免疫吸附试验均为阳性或某一种方法为阳性,判为伪狂犬病病毒抗体 阳性 5 酶联免疫吸附试验 5.1抗体检测项目分类 本试验包含检测猪伪狂犬病病毒抗体ELISA(PrV-ELISA),猪伪狂犬病病毒gB抗体ELISAgB ELISA)和猪伪狂犬病病毒gE抗体ELISAgE-ELISA)方法 这三种ELISA方法均只能用于猪血清 中伪狂犬病病毒不同抗体的检测,因为其他动物检测没有正式的阴、阳性判定标准 5.2Pr-ELISA 5.2.1仪器设备 5.2.1.1酶标仪 5.2.1.2恒温培养箱 5.2.1.3微量移液器 5.2.2耗材 5.2.2.1酶标板 5.2.2.2移液器吸头 5.2.2.3实验用水(本标准所用水应符合GB/T6682中二级水的规格) 5.2.3试剂 5.2.3.1抗原(纯化后灭活的伪狂犬病病毒 5.2.3.2酶标抗体(HRP标记兔抗猪lgG抗体). 5.2.3.3阴性血清 5.2.3.4阳性血清 5.2.3.5待检血清 5.2.3.6洗涤液(配制方法见附录C). 5.2.3.7抗原包被液(配制方法见附录C)
GB/T18641一2018 5.2.3.8封闭液(配制方法见附录C). 5.2.3.9四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(配制方法见附录C) 5.2.3.10终止液(配制方法见附录C) 5.2.3.11样品稀释液(配制方法见附录C) 5.2.4操作步骤 5.2.4.1包被 用包被液将抗原稀释到工作浓度后加人酶标板孔内,每孔100L,37C作用1h后置4C冰箱 过夜 5.2.4.2洗涤 弃去孔内液体,用洗涤液洗3次,每次3nmin,用吸水纸拍干 5.2.4.3封闭 各孔中加人封闭液100AL,37笔作用1h 按5.2.4.2步骤洗涤 如等效采用商品化试剂盒,可省去5.2.4.1一5.2.4.3步骤 5.2.4.4加入待检血清和阴性、阳性血清对照 待检血清用稀释液进行1:40倍稀释,加人抗原孔中,每孔100nL;同时将阴性血清对照和阳性血 2 清对照各加人3个抗原孔中,分别标记为Ai,A.,A，和A、A、A，孔 37C作用1h,重复5.2.4 步骤 5.2.4.5加入酶标抗体 用样品稀释液将酶标抗体按工作浓度稀释,每孔加人100pL,37C作用1h,重复5.2.4.2步骤 5.2.4.6加入底物 每孔加人100ALTMB溶液,室温避光显色25min 5.2.4.7 终止反应 每孔加人50终止液终止反应 5.2.4.8读取吸光度值(oD.0 在酶标仪上于490nm波长条件下,测定吸光度值 5.2.4.9结果判定 5.2.4.9.1按式(1)计算血清检测值与阳性对照血清检测值之比(S/P)值 SCx一NC s/P PC一NC 式中: 样品A; SCx NC A,OD,w十A,OD,十A,ODm/3;
GB/T18641一2018 PC A,ODm十A,ODn十A.ODm)/3 5.2.4.9.2如果s/P>0.5,则判为抗体阳性 5.2.4.9.3如果S/P<0.5,则判为抗体阴性 5.3猪伪狂犬病病毒gB-EL.ISsA阻断法》 5.3.1仪器 5.3.1.1酶标仪 5.3.1.2恒温培养箱 5.3.1.3微量移液器 5.3.2耗材 5.3.2.1 酶标板 5.3.2.2移液器吸头 5.3.2.3实验用水(本标准所用水应符合GB/T6682中二级水的规格) 5.3.3试剂 5.3.3.1猪伪狂犬病病毒gB重组蛋白为抗原的ELIsA包被板 5.3.3.2辣根过氧化物酶(HIRP)标记的抗猪伪狂犬病病毒gB单克隆抗体 5.3.3.3阴性血清 5.3.34阳性血清 5.3.3.5待检血清 5.3.3.6四甲基联苯胺(TMB)底物溶液 5.3.3.7洗涤液 5.3.3.8终止液(配制方法见附录C) 5.3.4操作步骤 5.3.4.1稀释待检血清 用样品稀释液将待检血清、阴性对照、阳性对照作1:1倍稀释(即100AL血清加100AL稀释液) 其中阴性对照、阳性对照各做2个重复,分别标记为Ai,A，和B、,B 5.3.4.2血清孵育 将稀释血清100AL加人抗原孔中,18C一26C作用1h 5.3.4.3洗涤 甩掉板孔中的溶液,每孔加300AL洗涤液,洗涤3次 5.3.4.4加入酶标抗体 加人辣根过氧化物酶标记的抗猪伪狂犬病病毒gB单克隆抗体,室温(18C26)作用20min, 洗涤3次 5.3.4.5加入底物 每孔加人100LTMB底物溶液,室温避光显色15min
GB/T18641一2018 5.3.4.6终止反应 每孔加人50终止液,终止反应 5.3.4.7读取吸光度值(oDn 在酶标仪上于650nm波长条件下测定吸光度值 5.3.4.8结果计算和判定 5.3.4.8.1对照组中,阴性血清平均OD值减去阳性血清平均OD值之差大于0.30时,试验有效 5.3.4.8.2按式(2)计算待检血清样品OD与阴性对照血清OD之比(s/N)值 SC S/N NC 式中: SC 样品oDn; NC A,OD,0十A.ODn/2 5.3.4.8.3当S/N>0.70时,判为猪伪狂犬病病毒(gB)抗体阴性 5.3.4.8.4当s/N<0.60时,判为猪伪狂犬病病毒(gB)抗体阳性 5.3.4.8.5当s/N值为0.60~0.70时,判为猪伪狂犬病病毒gB)抗体可疑 可于9d~14d后再采 血,重复检测,如仍为可疑,可判为阴性 5.4猪伪狂犬病病毒gE-ELISA阻断法 按照NY/T678中“gE-ELIsA”的操作方法进行 5.4.1仪器 5.4.1.1酶标仪 5.4.1.2恒温培养箱 5.4.1.3微量移液器 5.4.2耗材 酶标板 5.4.2.1 5.4.2.2移液器吸头 5.4.2.3实验用水(本标准所用水应符合GB/T6682中二级水的规格> 5.4.3试剂 5.43.1猪伪狂犬病病毒gE重组蛋白为抗原的ELISA包被板 5.4.3.2辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗猪伪狂犬病病毒gE单克隆抗体 5.4.3.3阴性血清， 5.4.3.4阳性血清 5.4.3.5待检血清 四甲基联苯胺(TMB)底物浴液 5.4.3.6 5.4.3.7洗涤液 5.4.3.8终止液(配制方法见附录C).
GB/T18641一2018 5.4.4操作步骤 5.4.4.1 稀释待检血清 用样品稀释液将待检血清、阴性血清、阳性血清作1:1倍稀释即1004L 血清加100L稀释液) 其中阴性血清、阳性血清等分别做2个重复,分别标记为A、A 和B,B 5.4.4.2血清孵育 将稀释血清100L 加人抗原孔中,18C26C作用1h 5.4.4.3洗涤 甩掉板孔中的溶液,每孔加3004L洗涤液,洗涤3次 5.4.4.4加入酶标抗体 加人辣根过氧化物酶标记的抗猪伪狂犬病病毒gE单克隆抗体,室温(18C一26C)作用20min 洗涤3次 5.4.4.5加入底物 每孔加人100AlTMB底物溶液,室温避光显色15min 5.4.4.6终止反应 每孔加人50终止液终止反应 5.4.4.7读取吸光度值(oDn 在酶标仪上于650nm波长条件下测定吸光度值 5.4.4.8结果计算和判定 5.4.4.8.1对照组中,阴性血清平均OD值减去阳性血清平均OD值之差大于0.30时,试验有效 5.4.4.8.2按式(3)计算待检血清样品oD与阴性对照血清OD.之比(s/N)值: SC S/N 3 NC 式中 sCx 样品An; NC AOD0十A.ODm)/2 5.4.4.8.3当s/N>0.70时,判为猪伪狂犬病病毒(gE)抗体阴性 5.4.4.8.4当s/N<0.60时,判为猪伪狂犬病病毒(gE)抗体阳性 5.4.4.8.5当S/N值为0.60~0.70时,判为猪伪狂犬病病毒gE)抗体可疑 可于9d~14d后再采 血,重复检测,如仍为可疑,判为阳性 6 病毒分离鉴定 6.1仪器 6.1.1高速冷冻离心机
GB/T18641一2018 6.1.2组织匀浆器(或研钵). 6.1.3生物安全柜 6.1.4微量移液器 6.2耗材 6.2.1直径为0,45m滤膜的滤器 6.2.2细胞培养瓶 6.2.3吸管 6.2.4移液器吸头 6.3试剂 6.3.1DMEM培养基和0.25%胰酶溶液(见附录A) 6.3.2磷酸盐缓冲液 6.3.3仓鼠肾细胞系(BHK-21)或猪肾细胞系(PK-15)细胞 6.3.4牛血清 6.3.5青霉素 6.3.6链霉素 6.4操作步骤 6.4.1病料采集 对死亡病畜或活体送检处死的动物,采集脑组织(应含有三叉神经节)、肺脏和扁桃体等组织,2 8C冷藏条件下运输送检 6.4.2样品处理 待检组织(可等体积混样或单独处理)剪碎并匀浆后,与DMEM制成1:5悬剂,反复冻融3次 10000×离心10min后,取上清液加双抗(青霉素溶液终浓度为300IU/mL、链霉素终浓度为 1004g/mL)过夜或4C处理4h,再经孔径为0.454m滤膜过滤，-80C保存作为接种材料 6.4.3病料接种细胞 将病料滤液接种至已长成单层的BHK-21细胞(或PK-15细胞),接种量为所加培养液量的1/10 37C恒温箱中吸附1h,加人含10%犊牛血清血清要求无支原体污染,预先经56C水浴灭活30min 后使用)的DMEM培养液,置37,5%CO培养箱中培养,逐日观察细胞病变 6.4.4结果判定 接种后36h一72h,如细胞出现变圆、拉网、脱落等现象,可初步判定阳性(病料中含有伪狂犬病病 毒) 如第一次接种未出现细胞病变,应将细胞培养物冻融后,按6.4.3盲传3代,如仍无细胞病变,判为 阴性(病料中无伪狂犬病病毒) 6.4.5病毒鉴定 将出现细胞病变的细胞培养物,用已知的伪狂犬病毒阳性血清做病毒中和试验鉴定病毒,用聚合酶 链式反应(第7章)或家兔感染试验(第8章)进一步鉴定
GB/T18641一2018 聚合酶链式反应 7.1仪器 7.1.1组织匀浆机(或研钵) 7.1.2高速冷冻离心机 7.1.3生物安全柜 PCR仪 凝胶成像系统 1s 71水游锅" 分析天平 17 7.1.8微量移液器 7.2耗材 7.21移液器吸头 7.2.2EP管 7.2.3PCR反应管 7.3试剂 7.3.1DNA提取试剂盒 7.3.2琼脂糖 7.3.3TEN缓冲液(见附录A》 7.3.4澳化乙锭(EB)(见附录A)或新型核酸染料(EB替代物》 7.4引物序列 7.4.1伪狂犬病病毒D基因检测 引物序列:上游引物Pl:5'-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3',下游引物P2:5'-GTCCACG ccccGcTTGAAGcT3' 扩增靶序列是伪狂犬病病毒D基因434一650间的片段,扩增产物大小 217bp 可用于检测伪狂犬病病毒,但不能区分猪伪狂犬病基因缺失活疫苗株和野毒株 7.4.2伪狂犬病病毒gE基因检测 引物序列:上游引物P3;5'-TTTGGATCCATGCGGccCTTTCTG3',下游引物P4;5'-TTT GAATTcTTACGACACGGCGTCGCA-3',扩增靶序列是伪狂犬病病毒E基因79446nt间的片 段.扩增产物大小为368bp,能区分猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗株和野毒株 7.5操作步骤 7.5.1样品的采集 对于病死或剖杀的动物,取脑组织(含三叉神经节)扁桃体等组织;对于待检活猪,用灭菌棉签伸人 猪鼻腔中(以棉签棉花部分全部插人鼻腔为准),同一方向转动3次,获取鼻黏液,即为鼻拭子;用扁桃体 取样器采集成年种猪扁桃体;采集公猪精液(检测前需用灭菌PBS做10倍稀释) 4C8笔冷藏条件 下运输送检 10
GB/T18641一2018 7.5.2样品处理与模板制备 组织病料用组织匀浆器或研钵处理后,按1:5比例用TEN缓冲液(见附录A.3)充分混悬,收集于 离心管内,反复冻融3次,10000X离心10min;鼻拭子样品,则加人1ml TEN缓冲液涡旋10 min 后挤压棉签,混悬液10000×g离心5min ,取上清液;精液样品,先用PBS做10倍稀释,方可用于核酸 提取 取组织或鼻拭子样品的上清液或稀释好的精液,按DNA试剂盒说明书提取DNA模板，-20C贮 存备用 7.5.3聚合酶链式反应(PCR)的操作程序 7.5.3.1扩增伪狂犬病D基因CR反应体系 总体积25.0L,MIX12.5!L,引物P1、P2各1.0L(104mol/L),H.O5.5L,DNA模板5.0AL 扩增条件为:94C预变性5min;94C30s,65C30s,72C30s,35个循环后72延伸10min. 7.5.3.2扩增伪狂犬病g基因PCR反应体系 总体积25.0AL,MIX12.5"L,引物P3,P4各1.0AL(10Amol/儿L),Hl,05.5AL,DNA模板5.0AL 扩增条件为:94C预变性5min;94C30s,60C30s72C30s,35个循环后72C延伸10min 7.5.4PCR产物的检测与判定 7.5.4.1将8L10MLPCR扩增产物加人含有澳化乙锭(EB)或新型核酸染料(作为EB替代物)的 1%琼脂糖凝胶的各电泳孔中(设阳性和阴性样品扩增对照孔),电泳后,在凝胶成像系统或紫外光下观 察结果 .5.4.2当阳性对照和被检样品的扩增产物大小为217bp(必要时需要测序,目的序列参见附录D),可 判定为伪狂犬病病毒阳性,但不能区分gE基因缺失疫苗毒株和野毒株 7.5.4.3当阳性对照和被检样品的扩增产物大小为368bp(必要时需要测序,目的序列参见附录D),可 判定被检样品为伪狂犬病病毒野毒阳性 如不出现该扩增产物,但满足7.5.4.2中的阳性结果,判定被 检样品为gE基因缺失疫苗毒株,否则,判为扩增反应失败 家兔感染试验 8.1试验目的及生物安全要求 本法用于疑似伪狂犬病患病动物组织检测和分离病毒的鉴定 要求在有良好隔离条件和消毒措施 的动物房实施,试验结束后要对场地和用具实施彻底消毒 8.2家兔的选择 选择健康成年家兔至少4只),经血清中和试验或胶乳凝集试验证实为伪狂犬病病毒抗体阴性 8.3病料的采集处理及接种 无菌采集病猪扁桃体或患病动物脑组织(含有三叉神经节),用生理盐水或PBS液制成20%~30% 匀浆液,反复冻融3次后10000×从离心l0min,取1ml2ml.上清液颈部皮下接种家兔(2只);如 接种物为疑似伪狂犬病病毒的细胞培养物,则取1ml2ml,同样皮下接种家兔(2只) 同时设立接 种等量生理盐水或PBS或培养基的对照家兔 1
GB/T18641一2018 8.4结果观察和判定 8.4.1伪狂犬病病毒阳性 接种后24h48h,家兔在注射部位出现奇痒,表现为家兔舔(啃)咬注射局部,导致皮肤溃烂;呼吸 困难、尖叫、四肢麻痹、痉挛等症状,病程2d5d,最终死亡 对照家兔无任何临床症状,健活 可初步 判定病料或细胞培养物中含有伪狂犬病病毒 8.4.2伪狂犬病病毒阴性 在接种后1周,病料悬液或细胞培养物接种家兔不出现任何症状,健活;同时,对照家兔无任何临床 症状,健活 可判定病料(或细胞培养物)中不含伪狂犬病病毒 O 综合判定 当5.4.4.8结果阳性,可判定为猪伪狂犬病野毒感染抗体阳性;当7.5.4.2结果为阳性,可判定为伪 狂犬稍野毒病原阳性 其余各项结果为阳性,可判断为伪狂犬精病毒感染(或免疫)阳性,但无法区分是 疫苗毒株还是野毒株所致 12
GB/T18641一2018 录 附 A 规范性附录 细胞培养和PCR反应常用溶液配制 DMEM培养液配制 A.1 A.1.1量取去离子水950mL,置于一定的容器中 A.1.2将10.0gDMEM粉剂加于15C30C的去离子水中,边加边搅拌 A.1.3每1000ml培养液加3.7只碳酸氢钠(NaHcO.) A.1.4加水至1000mL,用1mol/儿LNaOH或HCI调pH值至6.97.0,在过滤前应盖紧容器瓶塞 A.1.5用0.22m的微孔滤膜正压过滤除菌 4C保存备用 A.20.25%胰酶溶液配制 胰蛋白酶250.00mg加人100mLHanks液中,充分溶解后,用0.22Am的微孔滤膜正压过滤除 菌，一20C保存 A.3TEN缓冲液配制 依次称量下列成分,充分混合溶解,即可 三胫甲基氨基甲烧-盐酸(Tris-HCI)(pH8.0 1210,.00mg(10mmol/I 372.00 mmol/I 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0) mg(1.0" 1000mL 三蒸水 A.4澳化乙锭溶液配制 1.0 溴化乙锭 g 100m 三蒸水 用磁力搅拌器搅拌数小时以确保其奔解,然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中,室温保存 注，澳化乙锭是强诱变剂,并有中度毒性,使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套,称量染料时要戴面跟 建议 采用EB替代物作为本反应扩增产物的显色剂， 13
GB/T18641一2018 附 录 B 规范性附录) 病毒半数细胞培养感染量(D.m)和血清中和抗体(NA)的计算按eed-Mueneh法 B.1病毒半数细胞培养感染量ICID.n TCID指在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡cytopathiceffect,CPE)所需的病毒量 B.2ICID.计算方法 B.2.1距离比的计算 按式(B.1)计算距离比(D): 50% D一 (B.1 一Dx 式中 高于50%病变百分数， Cx 低于50%病变百分数 Dx B.2.2IcID的计算 按式(B.2)计算TCID -lgTcID，一Ex十Fx B.2 式中 高于50%病变率所对应的最高稀释度的对数 Ex 距离比×(低于50%病变率所对应的最低稀释度的对数与高于50%病变率所对应的最高 Fx 稀释度的对数之差). B.2.3ICID.计算方法示例 接种后细胞病变累计的计算方法数据演示见表B.1 表B.1接种后细胞病变累计的计算方法数据演示 细胞病变 累计孔数 出现细胞病变 细胞孔数 病毒稀释度 出现细胞病 不出现细胞 出现细胞 不出现细 百分数/% 变孔数 病变孔数 病变 胞病变 51 5 51/51100 l0 10-" 43 43 43/43)100 35 10- 35 35/35)100 27 10- 27 27/27)100 10- 19 19 19/19)100 10 ll/13)84.6 14
GB/T18641一2018 表B.1续 累计孔数 细胞病变 出现细胞病变 细胞孔数 病毒稀释度 出现细胞病 出现细胞 不出现细 不出现细胞 百分数/% 变孔数 病变孔数 病变 胞病变 10” (5/11)45, ll 10 13 14 1/14)7. 10 21 21 0/21)0 从表B.1可见,该病毒的TcID.在10-(84.600)和10-'(45.400)之间,首先按式(B.1)计算距 离比 84.6一50 =0.88 距离比- 84.6一45.4 将式(B.1)计算的距离比数值带人式(B.2)计算TCD0 -lgTCIDm=一6十0,88×(一1)=一6.88 所以:TCID.m=10-有,/0.1ml B.3血清中和抗体(NA)计算方法 B.3.1距离比的计算 按式(B.3)计算距离比(D): 50% B.3 D= Cx一Dx 式中 -高于50%保护率的百分数; 低于50%保护率的百分数 DX B.3.2中和抗体的计算 按式(B.4)计算中和抗体(NA): lgNA=Ex十Fx (B.4 式中: 高于50%保护率所对应的最高血清稀释度的对数 Ex Fx 一距离比×低于50%保护率所对应的最低稀释度的对数与高于50%保护率所对应的最高 稀释度的对数之差) B.3.3血清中和抗体效价计算方法示例 接种后细胞病变累计的计算方法示例见表B.2 15
GB/T18641一2018 表B.2接种后细胞病变累计的计算方法数据演示 累计 血清稀释度 CPE孔数 无CPE孔数 CPE孔数 保护率 '% 无CPE孔数 0a)y ;410 100 1,2 1:16(10 83 1:64(10-1 40 1:256(10-4 ;1024(10 从表B.2可见,该血清的稀释度在10-1=(83)和10-1s(40)之间,首先按式(B.3)计算距离比 83一50 =0,7 83一4 将按式(B.3)计算的距离比数值按式(B.4)计算中和抗体效价 =一1.2十0.7×(一0.6)=一1.66 -1.G6的反对数=1/46 即1:46稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE 16
GB/T18641一2018 录 附 C 规范性附录 酶联免疫吸附试验有关溶液的配制 洗涤液 C.1 洗涤液为含0.05%吐温-20(Tween-20)pH7.4的磷酸盐缓冲液,配制方法如下 将下列试剂依次加至容积为1000mL容器中,充分溶解即成 氯化钠(NaCI) 8.0g 氯化钾(KCI 0.2g 十二水合磷酸氢二钠(NagHPO12H.O) 2.9g 磷酸二氢钾(KH,PO. 0.2g ween-20 0.5 吐温-20(Tw ml 加蒸僧水定容至 000ml C.2抗原包被液 包被液为25mmo nol/LpH9.6碳酸盐冲液,配制方法如下: 1.59 碳酸钠(NaaCO. g 2.93g 碳酸氢钠(NaHCO. 1000mL 加蒸僧水定容至 C.3封闭液 在100ml洗涤液中加人0.lg牛血清白蛋白(EBSA)即可 C.4 底物溶液 pH5.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液 C.4.1 将下列试剂依次加人1000ml体积的容器中,充分溶解即成 十二水合磷酸氢二钠NaHPO12H.O) 71.6g 无水柠檬酸(c,H.O. 19.2g 加蒸溜水定容至 1000mL C.4.20.75%H,o. 取30%H.O1.25ml.,加人蒸僧水,使总体积达到50ml C.4.3四甲基联苯胺(TMB)母液 一0笔保存 取200.00mgTMB溶解于100ml无水乙醇中 17
GB/T18641?2018 C.4.4?(?) 9.5mL 0.1mol/LpH5.0-λ? 0.5ml TMB?? 0.75%H.O. 42Al ???,???á C.5?? ???2mol/L(HsO.),? 22.2ml ?(H,SO 177.8mL ? C.6??? ????0.1mol/L.pH7.4λ?,? ?μ??1000mL 8.02 ?(NaCI 8 0.20 (KCI g ??(NaHPO12H,O) 3.87 g KH.PO 0.16 ? 1000ml ?,?,0.10g(NaN)(??0.1g/L) 18
GB/T18641一2018 附 录 D 资料性附录 伪狂犬病病毒gD基因和gE基因的PCR扩增序列 D.1伪狂犬病病毒CR目的D基因扩增产物DNA序列 CAGGAGGAcGAGCTGGGGcTGCTCATGGTGGCCccGGGGcGGTTCAACGAGGGCCAGT AccGGcGccTGGTGTccGTcGAcGGCGTGAACATcCcTCAccGACTTCATGGTGGCGCTCCcc GAGGGGcCAAGAGTGccCGTTcCGccCGcGTGGACCAGCACcGCACGTACAAGTTcGGCGcGTG CTGGAGCGAcGACAGCTTCAAGcGGGGCGTGGACA D.2伪狂犬病病毒CR目的E基因扩增产物DNA序列 CCACCGAGGCCCCGAGCCTCTCCGCCGAGACGA CCTCGGCCGAGGTCTGGGACGACCTCTCCACCGAGGCcGACGACGATGAcCCTCAAcCGGCGAC CCGGCCCATCTGGTGAACGTGTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCGACGG CGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGACGTTCCTGCCCGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGTCG

伪狂犬病诊断方法GB/T18641-2018介绍

伪狂犬病是一种由于犬科动物感染引起的疾病，与狂犬病病原体相似，但两者不同。为了提高伪狂犬病的诊断准确率和防治工作的有效性，国家于2018年发布了《伪狂犬病诊断方法GB/T18641-2018》标准，该标准规范了伪狂犬病的诊断方法和相关技术要求。

该标准主要包括临床症状、病理变化、实验室检测方法等方面的内容。其中，实验室检测方法是诊断伪狂犬病最关键的环节之一。

根据该标准，对于疑似伪狂犬病患犬，需采集血清和脑组织样本进行实验室检测。标准规定了采集、保存、运输等方面的要求，并且明确指出了实验室检测方法的操作步骤和技术参数。

其中，主要包括固相吸附法、免疫荧光法、酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法。同时，还需对脑组织进行病理学检测，包括组织学检测、抗原检测、核酸检测等方法。

此外，标准还对检测结果的解释和判断做出了详细说明，并提供了防控和治疗建议，为疫情的防治提供了重要的技术支撑。

总之，《伪狂犬病诊断方法GB/T18641-2018》标准的发布，有助于提高伪狂犬病的诊断准确率，促进伪狂犬病的早期发现和有效管理，为保障公共卫生安全和动物健康作出了重要贡献。

伪狂犬病诊断方法的相关资料

和伪狂犬病诊断方法类似的标准

GB/T35911-2018

伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法

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GB/T18641-2018

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2022/8/10 16:05:02 现行