水仙迟季黄化病毒检疫鉴定方法

国家标准 GB/T33115一2016 水仙迟季黄化病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofNareissuslateseason yelowsvirus 2016-10-13发布 2017-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T33115一2016 水仙迟季黄化病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了水仙迟季黄化病毒(Nareissslateseasonyelousvirus s)的检疫鉴定方法 本标准适用于可能携带水仙迟季黄化病毒的水仙及水仙产品检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2122 sN/T2964！植物病毒检测规 sSN/T3457植物病毒分子生物学检测规范 水仙迟季黄化病毒基本信息 中文名:水仙迟季黄化病毒 学名;Narcissuslate seasonyellosuirus,缩写:NL.sYv 分类地位;马铃薯Y病毒科(Poyiridae),马铃薯Y病毒属(Potyirus) 水仙迟季黄化病毒的其他信息参见附录A 方法原理 水仙迟季黄化病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据 仪器、用具及试剂 5.1仪器 高速冷冻离心机、电子天平,PCR仪、荧光PCR仪、水平电泳系统、一20C低温冰箱和一80C超低 温冰箱、凝胶成像分析系统,pHH计,微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台,酶标 仪等 5.2用具 酶联板、可调移液器(2.5AL10AL、20AL,100L,200L、1000AL)和可调移液器头、离心管,研 钵等 5.3试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定 PTA-ELISA检测
GB/T33115一2016 试剂见附录B;RT-PCR检测试剂见附录C;实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D. 抽样和样品制备 6.1 抽样 抽样方法按照SN/T2122中规定执行 6.2样品制备 分别按照有症和无症进行样品制备,具体方法按照sN/T2964和sN/T3457中规定执行 检测鉴定 7.1PrA-ELISA检测 以含NLsYV材料作为阳性对照,以不含NL.SYV的健康植物组织作阴性对照,同时以样品提取缓 冲液作为空白对照,具体操作见附录B. 7.2RT-PCR检测 以含NLsYV材料作为阳性对照,以不含NL.SYV的健康植物组织作阴性对照,同时以ddH,o代 替模板作为空白对照 分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作 见附录C 如采用商品化一步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行 7.3实时荧光RT-pPCR检测 以含NLsYV材料作为阳性对照,以不含NLsYV的健康植物组织作阴性对照,同时以ddH,O代 替模板作为空白对照 分别提取样品和对照的总RNA,进行实时荧光RT-PCR检测,具体操作见附录 D 如采用商品化一步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行 结果判定 样品检测时,检测流程及结果判定按下述原则进行: PTA-ELISA初步筛检,若检测结果为阴性,则判定样品不携带NLsYV;若检测结果为阳性 则采用RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法进行验证 -若验证结果为阳性，则判定样品携带NLsYV;若验证结果为阴性,则判定样品不携带 NLSYV 样品保存与结果记录 9.1样品保存 经检测确定携带NLsYV的样品应保存在适合的条件下以备复核 种苗、叶片等样品保存在 -80C冰箱中;做好登记和标记工作,保存期限至少6个月 9.2结果记录 记录包括样品来源、样品种类、检测时间、检测地点、检测方法和结果,检测人员签字 PTA-ELISA 检测应有酶联反应数值;RT-PCR检测应有电泳图片;实时荧光RT-PCR检测应有实时荧光结果图片
GB/T33115一2016 附录A 资料性附录 水仙迟季黄化病毒相关资料 A.1寄主范围 寄主范围较窄,已报道的寄主为水仙(NarcissustazetaL.) A.2病害症状 侵染水仙后引起叶片、花茎上出现窄长的褪绿条纹或椭圆状斑块等症状(参见图A.l) 图A.1NLSYV侵染水仙后引起的症状 A.3分布地区 主要分布于英国、荷兰、新西兰、等国家 A.4 传播途径 主要由桃蚜(Myeusersicae)传播 A.5粒体形态 病毒粒体为线条状,大小约750nm×12 2nm(参见图A.2) 注:引自http://www.dpvweb.net 图A.2NL.SsYV病毒粒体
GB/T33115一2016 A.6病毒基因组 正义单链RNA病毒,全长约9651bp
GB/T33115?2016 ? B 淶?? ?岶???(PIA-EL.IsA B.1? B.1.1?(pH9.6 1.59g" ?(NaCO. ?(NaHcO) 2.93g (NaN,) 0.2g ?900ml,HcIpH?9.6,??1L,4C档 B.1.2λ?(PBs.pH7.4) ?(NaCD) 8.0g (KH,PO 0.2g (NaHP(O .15g (KCI) 0.2g (NaN 0.2g 900ml??,NaOHHClpH?7.4,??1L. B.1.3PBST ?PBsм0.5ml-20 B.1.4???/????? 13.0g ??(Tris-HCI ?(Tris 2.0g (NaCD 9,0g 25.0mL -20(Tween-2D) ?? 50.0g ?1L,4C档 B.1.5pNPP)?(pH9.8 ??(MgCl 0.1g (NaN,) 0.2g [HIN(CH.CHoH).] 97.0mL 800ml?,HClpH?9.8,??1L,4档 B.1.6 ;???? ??;?lgG
GB/T33115一2016 B.2操作步骤 B.2.1样品制备 称取0.5g1.0g待测样品,按1:10(质量:体积)比例加人包被缓冲液,用研钵研磨成浆， 8000g离心5min,上清液即为制备好的检测样品,保存于-20C冰箱 阴性对照,阳性对照作相应的 处理或按说明书进行 B.2.2 包被抗原 加人制备好的检测样品,同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照 每个处理至少设2个重复 100AL孔,37C孵育1h或4C冰箱孵育过夜,倒去酶联板孔中溶液,用PBST洗涤4次6次 B.2.3加病毒抗体 将病毒抗体按说明稀释至工作浓度,加人到酶联板的孔中,100L/孔,37C孵育1h,倒去酶联板 孔中溶液,用PBST洗涤4次6次 B.2.4加标抗体 将酶标抗体按说明将稀释至工作浓度,加人到酶联板的孔中,100aL/孔37C孵育1h,倒去酶联 板孔中溶液,用PBST洗涤4次6次 B.2.5加底物 将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/ml(现配现用),按100AL/孔,加人到酶联板 中,室温避光孵育 B.2.6吸光值的测定 阳性对照孔显色后,用酶联仪于405nm处读OD值 B.3结果判断 在满足阴性对照孔的OD值<0.15、阳性对照孔的OD值/阴性对照孔的OD值>510,孔的 重复性基本一致的质量要求后,样品oD值/阴性对照OD值>2,判为阳性 样品oD值/阴性对 照OD值在闵值附近,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验证 样品OD值/阴性对 照oD值一2,判为阴性
GB/T33115一2016 附 录c 规范性附录 RT-PCR检测 C.1试剂 C.1.1TRIzol裂解液 C.1.25×TBE缓冲液 Tris碱 54.0g 棚酸(H,BO. 27.5g 20 0.5mol/LEDTA(pH8.0) ml 补充蒸憎水至1L 用时加燕水稀释至0.5×TBE C.1.3三氧甲烧 C.1.4异丙醇 C.1.575%乙醇 c.1.6无水乙醇 c17RT缓冲液 c.18dNTp.10mmo/L. E M-MLVRT;200U/L c.1.10RNA酶抑制剂:40U/pL c.1.11TanDNA聚合酶 C.1.12PCR缓冲液 C.1.13MgCl;25mmol/L C.1.14引物序列: 根据已报道的NLSYV基因组序列设计1对用于特异性扩增的引物 NLSYVf;5'-CCACTTGAAGTCTATCACCA-3 NLSYVr:5'-CCAAACTAGCATCCTTGTGT-3" PCR产物大小938bp RT-PCR检测 总RN提取 C.2.1 取0.l些样品组织置于研钵中,加人1mLPEBsT缓冲液研磨,4C,10000！离心5min,取上清液 0oAl一20oAL)迅速转移至灭菌的1.5ml离心管巾,并加人lmLTRol试剂,剧烈振荡后,室温静 置5nmin;4C,12000越离心10min.取上清液;加人三氧甲烧300pAL.,剧烈振荡15、室温静置了min. 4C,1200是离心15mn,取上层水相;加人等体积的异两腺,艇倒混匀后室温下静置15mim.c 2000瓦离心10mim,弃上请液,加人1mL75%乙醉洗涤沉诧2次,每次4t,7500《离心3mim,弃 上清液;RNA沉淀干燥后,用20l40nlL经DEPc(焦碳酸二乙酯)处理过的ddH.O溶解,一20C保 存备用
GB/T33115一2016 C.2.2eDNA合成 在PCR管中加人2AL总RNA,ll下游引物NL.sYVr(10amol/L),ddH.O5Al,70C水浴 10min,迅速冰浴5min,再加人下列试剂;5×RT缓冲液2.5Al,dNTPs(10mmol/L)1Al、,M MLVRT(200U/AL)0.5AlL,RNA酶抑制剂(40U/L.)0.5AL 42C水浴60min,70C水浴10min,自 然冷却至室温，一-20C保存备用 C.2.3PCR扩增 PCR反应体系见表C.1,每个反应设置2个重复 PCR反应条件:94C预变性3min,然后94C变性30s,56退火45s、72C延伸1 min ,35个循 环,最后一个循环结束后72C继续延伸10 min 表C.1PCR反应体系 名称 加样量/L cDNA 3.0 0.5 TuDNA聚合牌GU/aL dNTPs10mmol/L 0.5 10×PCR缓冲液(不含Mg+ 2.5 25mmol/L.MgCl 2.0 NLSYVf10Mmol/L 1.0 NLSYVr(l0mol/L l.0 ddH.o 14.5 总体积 25.0 C.2.4阴性对照、阳性对照和空白对照的设置 C.2.4.1阴性对照:不含病毒的健康植物组织 C.2.4.2阳性对照:含有NLsYV材料 C.2.4.3空白对照:ddH.O C.2.5琼脂糖凝胶电泳 制备l.5%的琼脂糖凝胶,对CR产物进行电泳，电泳结束后,在澳化乙链(EB,浓度为 从8/mL)游液染色10min,再在凝胶成像系统中观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带,拍照并 0.5 做记录 c.2.6结果判断 如果阴性对照和空白对照无特异性扩增,阳性对照在938bp大小处有扩增条带,待测样品出现与 阳性对照一致的扩增条带,则判定为阳性 如果阴性对照和空白对照无特异性扩增,阳性对照在938bp大小处有扩增条带,待测样品未出现 与阳性对照一致的扩增条带,则判定为阴性
GB/T33115一2016 附 录 D 规范性附录 实时荧光RI-PCR检测 D.1试剂 核酸提取、反转录试剂同c.1 D.2引物及探针 实时荧光RT-PCR检测引物及探针见表D.1 表D.1实时荧光R-PCR检测引物及探针 名称 序列5'-3' TTCCTCTGAAACCAATCATTGAAC 上游引物NISYVf 下游引物NISYVr CAATATACGCTTCAGCACCGTTA 探针NLSYV-Probe FAM-CGCCAAACCAACACTCAGGCAAATAATGBHQ D.3 总RNA提取 方法同C.2.1 D.4cDNA合成 方法同c.2.2 D.5实时荧光PCR反应 实时荧光rcR反应体系见表D2,每个反应设置2个重复 反应程序:95C30s;95C5s,60C34s,共40个循环 表D.2实时荧光PCR反应体系 名称 加样量/AL 2×PremixExTag 12.5 NL.sYV(10Amol/L) 0.5 NLSYVr(104ol/1L) 0.5 NLSYV-Probe(10mol/L 0.75 cDNAN 2.0 ddH.O 8.75 总体积 25.0
GB/T33115一2016 D.6阴性对照、阳性对照和空白对照的设置 D.6.1阴性对照;不含病毒的健康植物组织 D.6.2阳性对照含有NLsYV材料 D.6.3空白对照:ddH.O. D.7结果判定 在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值<30并出现典型扩增曲线的条 件下 待测样品的ct值>40时,判定NI.sYV阴性; 待测样品的ct值<35时,判定NI.sYV阳性; 待测样品的3540时,判定NL.sYv 阴性;如果重新测试的Ct值一40,则判定NLsYV阳性 10o

水仙迟季黄化病毒检疫鉴定方法GB/T33115-2016

引言

水仙迟季黄化病毒是一种常见的植物病毒，主要危害水仙属植物，会导致水仙叶片黄化、萎缩、变形等症状，给园艺生产带来很大的损失。因此，对于患有水仙迟季黄化病毒的植物进行及时的检测和鉴定至关重要。

检疫鉴定方法

GB/T33115-2016《水仙迟季黄化病毒检疫鉴定方法》是我国针对水仙迟季黄化病毒检测和鉴定制定的标准。

具体的检测方法如下：

1. 采样：将叶片、茎、根等植物样品采集后，用无菌水或生理盐水清洗干净并晾干。
2. 提取RNA：将准备好的植物样品粉碎后，加入TRIzol试剂（或其他RNA提取试剂），按照说明书进行RNA提取。
3. RT-PCR扩增：使用特异性引物进行RT-PCR扩增，并进行相应的电泳分析。
4. ELISA鉴定：利用水仙迟季黄化病毒的抗体进行ELISA鉴定。
5. PCR-RFLP分析：对于RT-PCR扩增产物阴性样品，可以使用PCR-RFLP进行进一步确认。

通过上述的检测和鉴定方法，可以快速、准确地检测出患有水仙迟季黄化病毒的植物，并避免其在种植过程中造成更大的危害。

结论

水仙迟季黄化病毒是一种常见的植物病毒，其检测和鉴定对于园艺生产具有重要意义。GB/T33115-2016标准中提供了一系列的检测和鉴定方法，可以帮助我们快速、准确地检测出患有该病毒的植物。

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2022/10/1 18:09:17 现行