白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分：套式PCR检测法

白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分：套式PCR检测法

国家标准 GB/T28630.2一2012 白斑综合征(wSD)诊断规程 第2部分套式PCR检测法 Diagn0sticprotocolsforwhitespotdisease Part2:NestedPCRmethod 2012-07-31发布 2012-11-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T28630.2一2012 前 言 GB/T28630(白斑综合征(wSD)诊断规程》分为五个部分 -第1部分:核酸探针斑点杂交检测法; 第2部分;套式PCR检测法; 第3部分:原位杂交检测法; 第4部分;组织病理学诊断法; 第5部分:新鲜组织的T-E染色法 本部分为GB/T28630的第2部分 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本部分由农业部提出 本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/Tc156)归口 本部分起草单位;水产科学研究院黄海水产研究所,农业部全国水产技术推广总站 本部分主要起草人;黄健、杨冰,陈爱平,宋晓玲,史成银、杨丛海、魏琦、刘莉
GB/T28630.2一2012 白斑综合征(wSD)诊断规程 第2部分:套式PCR检测法 警告;使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验,本标准并未指出所有可能的安全问题 使用者有责任采取适当的安全和健康措施,并保证符合国家有关法规规定的条件 范围 GB/T28630的本部分规定了白斑综合征病原的套式PCR检测方法所需试剂与材料、仪器设备、 操作步骤和结果判定 本部分适用于在对虾的各种样品、环境生物和饵料生物的各种样品,以及其他各种非生物样品中对 白斑综合征病原带毒情况的高灵敏度定性检测,以进行病原筛查和疾病的确诊 本部分单独使用时不适用于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有修改单)适用于本文件 GB/T28630.4一2012白斑综合征(wsD)诊断规程第4部分:组织病理学诊断法 原理 3.1白斑综合征的病原和病理学特征 见GB/T28630.4一2012的2.1 3.2技术原理 聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)是以待测样品的一段DNA作为模板,以与模板 两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物,在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下,利用依赖 DNA的DNA聚合酶的合成作用 经过数十次变性、退火和延伸的反应循环,使模板上介于两个引物 之间的DNA片段得到特异性地级数扩增,再通过电泳等手段检测到被特异性扩增的片段,从而可揭示 微量病毒DNA的存在 套式PCR是在第一步PCR扩增的产物内,再用一对引物进行第二步PCR扩 增 套式PCR可大大增加PCR检测的灵敏度和反应特异性 试剂和材料 4.1除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的化学试剂和蒸僧水或去离子水或相当纯度的水 4.2无水乙醇 4.3液体石蜡 4.4 含氧消毒剂医用品或水产药物 4.5琼脂糖:电泳级
GB/T28630.2一2012 4.61kbDNAMarker:生化试剂 4.7Tris平衡酚(饱和酚);生化试剂 4.8TaqDNA聚合酶(5U/AlL):生化试剂,一20C保存 4.9l0×PCR缓冲液;生化试剂,无Mg'+,随TaqDNA聚合酶提供，-20C保存 4.10氯化镁溶液(25mmo nol/L)生化试剂，-20C保存 4.11dNTP生化试剂,含dATP,drTP,dGTP和dcTP各10mmolL的混合物，一20C保存 4.12 0mol/儿L引物F15'-ACTACTAAC'TTCAGCCTATCTAG-3',外侧正向引物,用来扩增 wssVDNA的1447p产 产物，一20保存 4.1310mol/L引物Rl:5'-TAATGcGGGTGTAATGTTcTTAcGA-3',外侧反向引物,用来扩增 WSSVDNA的1447bp产物，一20保存 4.14 Amol/儿引物F2;5'-GTAAcTGccccTTccATcTccA3',内侧正向引物,用来从第一步 10 PCR扩增的1447bp产物中再扩增出941bp的产物，一20C保存 4.1510pmal/儿引物R2;5'-TAcGGcAGcTGcTGcAccTTGT-3',内侧反向引物,用来从第一步 PR扩增的1447bp产物中再扩增出941p的产物，一20C保存 F3;5'-TGccTTATcAGcTNTcGATTGTAG=3',正向内参照引物,扩增十足 Amol1引物 4.1610 C保存 类动物DNA中848bp的片段，,一20 4.1710umol/L引物R35'-TTcAGNTTTGCAAcCATAcTTccC3',反向内参照引物,扩增十足 类动物DNA中848p的片段，一20C保存 4.1820mg/mL蛋白酶K,见附录A的规定 4.19TE缓冲液;见附录A的规定 4.20抽提缓冲液,见附录A的规定 10mol/1.乙酸铵;见附录A的规定 4.21 422盼-三叙甲檐-异皮醉(25;24;1),见附录A的规定 1×电泳缓冲液;见附录A的规定 24 6×载样缓冲液;见附录A的规定 10mg/mL澳化乙锭(EB)贮存液;见附录A的规定 25 42670%乙醉,见附录A的规定 4.27阳性对照为已知受ws9V感染且PR结果显示明显阳性结果的wssvDNA模板，一20 C 保存 4.28阴性对照为已知未受wSsV感染且PCR结果显示阴性结果的对虾组织DNA模板，一20 保存 4.29空白对照以无菌双蒸水为模板 5 器材和设备 5.1PCR仪 55. 2 电泳仪;输出直流电压0V600V 5.3水平电泳槽50ml 一500ml,带有5cm一20cm宽度的凝胶船及相应的样孔梳 3001 5.4紫外观察仪:可遮挡可见光干扰,在230nm" nm波长对凝胶发射紫外线,推荐带照相机架 5.5台式高速离心机;用于PCR前区对1.5mL 塑料微量离心管离心,转速可达12000r /min 以上 6 5. 手掌型离心机用于CR后区对0.2mL PCR管的离心，塑料转头,转速200o r/min一 4000r/min 7 5. 水浴锅
GB/T28630.2一2012 5.8普通冰箱:具冷藏箱,并带一18C以下冷冻箱体 5.9微量移液器;量程0.5AL~10AL5l40L、40L200l200l1000L各4支,应按 洁净区、样品区、扩增区和电泳区分为4套隔离使用 55. .10电炉或微波炉等其他加热设备;可满足10ml50mL.液体在三角烧瓶中加热20min. 5. 11三角烧瓶;容量100mL250mL 5. 12灭菌0.2mLPCR管:经高压燕汽灭菌，一次性使用 55 .13微量移液器枪头:与各种规格的微量移液器配套使用,经高压燕汽灭菌,并一次性使用 5. 14医用剪刀 5. .15医用子 5. 16玻璃研磨棒或塑料研磨棒;用于在1.5ml塑料离心管中研磨样品 5. .171.5mL塑料微量离心管;经高压蒸汽灭菌,一次性使用 55 18塑料或乳胶手套;一次性使用 19吸水纸 5. 操作步骤 6.1准备PCR的反应体系 6.1.1PCR反应体系的准备应在洁净区完成 6.1.2第一步PCR的反应体系中使用引物F1和R1,模板为抽提的样品DNA,其反应预混物见表1 表1100份第一步PCR的反应预混物所需试剂组成 剂 试 25aL体系 50L.体系 100aL体系 试剂终浓度 10×PCR缓冲液(无Mg+ 250AL 500l 1000AL 1×PCR缓冲液(无Mgt 氯化镁溶液(25mmol/L) 150Al 300Al 600l 1.5mmol/1 ANT? 50l 200"l 100AL 200Mmol/L 104mol/儿引物P 250L 00l 10004l 1mol/L 500 1000 10molL引物R1 250L lpmal儿 AL AL 灭菌双蒸水 1440Al 2880al 5760Al TaqDNA聚合酶(5U/aL) 40l 0.02U/l 0Al 20Al. 100份反应预混物总体积 2400ML 4800l 9600AL 注:25l.体系模板量laL/反应管;50l体系模板量2al/反应管;l00Al.体系模板量4l/反应管 6.1.3第二步PCR的反应体系中使用引物F2和R2,其反应预混物见表2 表2100份第二步CR的反应预混物所需试剂组成 试 剂 0L体系 试剂终浓度 25L体系 50L体系 10×PCR缓冲液(无Mg2+ 250Al 500L 1000Al 1×PCR缓冲液(无Mg是+ 氯化镁溶液(25mmol/1 150AL 300Al 600l 1.5mmol/L dNTP 50l 100Al 200Al 200mol/L 10mol/L引物F2 250l 500l 1000L lmol/L
GB/T28630.2一2012 表2(续 试 剂 25l体系 50l体系 100l体系 试剂终浓度 10mol/L引物R2 250从L 500Al 1000l 1mol/L 灭菌双蒸水 1290l 2580L 5160Al raqDNA聚合酶(5U/aL 0.02U/gl 40al 0Al 20AL 100份反应预混物总体积 4500AL 9000nL 2250l 注:25l.体系模板量2.5Al/反应管;50l.体系模板量5Al/反应管;100al体系模板量10L/反应管 按照所需的反应体系,根据近期工作量的需要,在洁净区分别配制好100份一1000份第一步 PCR和第二步PCR的无TaqDNA聚合酶的反应预混物,按10份/支100份/支对两步的无酶反应预 混物分别分装,冻存于一20C 6.1.5检测前,在洁净区取出所需份数的第一步PCR和第二步PCR的无酶预混物解冻,按比例分别 加人所需的Taq酶量,混匀即为完全的第一步CR和第二步PCR反应预混合物,再按1份/支将预混 合物分别分装到0.2mLPR管中,混匀 若PR仪没有热盖功能,则再于各管中加人50L液体石 蜡 将分装好的两步PCR的反应预混物同时带人样品区待用 6.2样品准备 样品的处理应在样品区完成 样品采集的要求见GB/T28630.！一2012中附录B的规定 《去掉幼虾眼. 活体或冰冻幼体、,仔虾及幼虾个体样品约5 100 活体或冰冻的成虾 mg mg 想、胃,游冰足或步足样品约5mg一100mg 活体或冰冻饵料生物样品约百n mg一100mg 池底表土样 品约500mg 将上述待检样品放人灭菌1.5mL微型离心管中,应避免各样品间的交叉污染 所有非一次性 min,经 使用的样品处理工具要经清洗,然后浸于新配制的有效氧含量为3.0×10-'的含氧消毒剂中5" 无PCR产物污染的自来水充分清洗再经蒸憎水淋洗后方可用于下一个样品 6.3DNA的提取 6.3.1样品DNA的提取应在样品区完成 6.3.2在样品剪碎后加人抽提缓冲液500L,用研磨棒充分研磨,37C温浴1h. 6.3. 3 加人2.5L.20mg/ml蛋白酶K,至终浓度1004g/mL,混匀后置于50C水浴3h,不时旋动 6.3. 将溶液冷却至室温,加人等体积平衡酚,颠倒混合10min,于10000r/min离心3nmin 分离 两相 水相移至新塑料微量离心管中,加人等体积酚-三氯甲烧-异戊醉,颠倒混合10min,于10000r/ min离心1min分离两相 水相移至一新灭菌微型离心管中,加人等体积三氯甲炕-异戊醉(24;1),颠倒混合10min,于 10000r/min 离心lmin分离两相 水相移至一新灭菌微型离心管中,加人100AL.10mol/儿L乙酸铵,混匀后,再加人两倍体积预冷 无水乙醉(一20C)混匀，-20C放置2h 10000r/min离心10min,弃上清 6.3.8用70%乙醇洗涤沉淀2次,每次10000 离心5" ,小心倾去上清,最后沉淀于室温 r/min min 晾干 沉淀晾干后加人100AL灭菌双蒸水溶解DNA
GB/T28630.2一2012 6.3.10若DNA样品应保存,建议溶解于100LTE缓冲液中并保存于-20C 6.4DNA提取质量及体质监控 参照表1的PCR反应预混物体系,引物使用104mol/L引物F3和10umol/L引物R3按 6.4.1 6.5.1.5程序进行样品提取质量及反应体系监控 6.5套式CR操作 6.5.1第一步CR 6.5.1.1 以下一个步骤的操作应在样品区完成 对每份样品用单独的枪头定量吸取待测模板,待测模板除抽提的样品DNA外,同时设阳性 6.5.1.2 对照、阴性对照和以无菌双蒸水为模板的对照 分别将各模板溶液加到各支已加有第一步PCR反应预 混物的0.2mlPCR管的管盖上,盖严管盖 6.5.1.3以下两个步骤的操作只能在扩增区完成 逐一快速取 6.5.1.4将PCR管带人扩增区,放人90C预热的PCR仪中,预热反应预混合物2min 出CR管在手掌型离心机上离心1一2.立即放同预热的CR仪上 盖上R仪的盖子 6.5.1.5按以下程序进行扩增;944min,551min、722min,1个循环;941min55 nmin、722min,39个循环;72延伸5nmin 4C保温 o 第二步CR 6.5.2.1在进行6.5.1.4步的同时,将已准备好的第二步PCR反应预混物的反应管带人扩增区 6.5.2.2在扩增区,根据所选取的反应体系的总体积,分别从第一步的各CR管中取相应体积的模 板,加到第二步PCR预混物各管的管盖上 应小心操作,防止各样品间交叉污染 6.5.2.3将第二步的各PCR管放人90C预热的CR仪中,预热反应预混合物2min 逐一快速取出 PCR管在手掌型离心机上离心1s一2s,立即放回预热的PCR仪上 盖上PCR仪的盖子 按照与第 一步PCR相同的扩增循环的程序进行扩增 扩增完毕的PCR管只能在电泳区打开 6.6CR产物的分析 6.6.1琼脂糖凝胶的制作 6.6.1.1在电泳区用1×电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶,建议于三角烧瓶中配制,在电炉上或微 波炉中加热至溶液完全透明为避免煮沸时液体外溢,胶液体积应少于容器体积的1/4) 待溶液冷却 至60C左右,加人10mg/mL潦化乙锭(EB,有毒)至终浓度0.54g/mL,摇匀 6.6.1.2将凝胶液缓缓倒人设置好样孔杭和防漏条/套的水平放置的凝胶船,胶液厚度0.6c cm 样孔梳底部水平深人凝胶层约0.3cm~0.5cm,并距凝胶底部0.2cm,以免穿透 0.8cm 待凝胶完全凝固后,小心拔掉样孔梳,去掉防漏条/套,即可用于电泳 6.6.1. 3 6.6. 电泳 6.6.2.1将制备好的琼脂糖凝胶连同凝胶船一起装人水平电泳槽,加样孔朝负极,加人1×电泳缓冲 2 液至没过胶面约1mm mm的深度 6.6.2.2 将10L第二步和第二步rR反应产物分别与2AL6×载样缓冲液混匀后加人到加样孔 中 同时至少设一个泳道加人5L1kbDNAMarker的载样混合物 6.6.2.3盖上电泳槽并通电,使DNA由阴极向阳极移动 在1V/em~5V/em的电压下电泳约1h， 当载样缓冲液中的澳酚蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/22/3处时停止电泳,将凝胶置于紫外 观察仪上观察或照相
GB/T28630.2一2012 6.6.3相对分子质量计算 6.6.3.1测定Marker的每条区带到加样孔的迁移距离(即泳动率),将各区带相对分子质量的对数值 对其泳动率作图,各点的排列应该接近是一条下降的直线,画出其趋势线,求出相对分子质量计算的回 归方程 6.6.3.2测量各样品泳道出现的条带的泳动率,利用Marker所得出的相对分子质量计算的回归方 程,计算各条带的泳动率 6.6.3.3由于凝胶在电泳时,其中的温度和电场的不均一性,以及电泳时所加样品的离子强度或DNA 浓度的差异,相同相对分子质量的DNA片段在凝胶中的泳动率会有所差异,各条带相对分子质量的实 际测量的结果允许有1%3%的误差 6.6.4后处理 观察完毕的凝胶和污染有PCR产物或EB的一次性用品和溶液应立即按附录B的规定处理 结果判定 十足类生物样品,DNA提取质M及反应体系监控中,样品在848p处会有一条特定条带 7.1 7.2被检生物样品;第一步PCR,阳性对照在1447bp处有条带,阴性对照和无菌水为模板设立的空 白对照无任何条带;第二步PCR,阳性对照在941bp处有条带,阴性对照和空白对照无任何条带 检测 样品第一步PCR后在1447bp处有条带或第二步CR后在941bp处有条带均可判为阳性 检测样 品第一步PCR后在1447bp处无条带且第二步PCR后在941bp处无条带可判为阴性 白斑综合征(wsD)套式PCR检测产物序列参见附录c 条带的亮暗表示PCR产物数量的多少,但并不对应于模板的量的多少 样品的电泳结果参照阳 性对照和阴性对照组进行判读 阳性结果表明样品中存在wssVDNA 对活虾和敏感宿主阳性表明已受到wssV感染;对虾产 品和其他产品阳性表明曾受到wSsV感染或受到wssV污染 7.6电泳结果分析和问题排除方法见表3 表3电泳结果分析 试验结果 结果判读及原因分析 问题排除 十足类动物样品 DNA提取质量及体系监控反应中样品在 848bp处有条带 被检生物样品 第 -步CR,阳性对照在1447bp处有条 带,阴性对照和无菌水为模板设立的空白对 RR反应正常,结果有效 照无任何条带; 第二步PCR,阳性对照在941bp处有条 带,阴性对照和空白对照无任何条带 阳性样品第一步PCR后在1447bp处有条 带或第二步CR后在941p处有条带 阴性样品第一步PCR后在1477bp处无条 带且第二步PCR后在941bp处无条带
GB/T28630.2一2012 表3(续 试验结果 结果判读及原因分析 问题排除 阳性对照有条带,但Marker没有影像 Marker失效或量太少 更换Marker或增加其加样量 Marker有影像,但十足类动物样品在 检查并更换PCR反应所用试剂 PCR反应失败 848bp处无条带 以及CR程序是否正确 清洗微量移液器,只能用PCR后 微量移液器污染 区的微量移液器跑电泳 试剂污染 更换试剂 清洁实验室及仪器设备,参见附 阴性对照组在1447bp或941bp处有条 环境污染 录B 带出现 禁止从PCR后区到PCR前区的 操作污染 交流,禁止从电泳区到R操作区 的交流,加强操作隔离,参见附录B 检查提取DNA所用试剂情况 DNA抛取失败 重新试验 用OD/OD比值来确定 其 DNA不纯致使PCR抑制物正常比值应在1.6一1.8之间,若低 介" 于1.6则表示杂质过多 应重新提 取DA 阳性对照和阴性对照组正常,但十足类动 物样品中无任何条带(包括无848bp条带 模板太少,第一步的产物被过 增加第一步PCR的模板浓度,不 度稀释 稀释第二步的模板 用电泳检查第一步PCR产物,若 可见1447bp条带,则记录该样品 第一步PCR产物过浓 为阳性;若无条带,稀释样品或第 二步PCR模板后再次做第二 步CR 做好热启动操作 样品先要加 未注意热启动操作,使PCR到P(CR管盖上,反应预混物预热 出现非特异性扩增 后,短暂离心(数秒)以混人样品 迅速放回预热PCR仪中 Marker正常,但阳性对照、阴性对照和样 确认预混物制备的准确性、试剂 品出现较多杂带或明显的弥散区 酶活性变化,dNTP浓度变化 质量,对不同批次的孵重新测定最 或Mg浓度差异 佳Mg牛离子浓度 检查PR仪是否存在复性温度 温度控制异常 过低的情况
GB/T28630.2一2012 表3(续 试验结果 结果判读及原因分析 问题排除 紫外观察仪故障 检查紫外观察仪 减少EB"用量,将凝胶置于清水 背景发红太亮 中30min 后再观察结果 凝胶上无影像,包括DNAMarker 凝胶片太厚 重新制作琼脂糖凝胶片 电极颠倒或电沫时间过长 重新加样电泳 EB分解失效 重新配置潦化乙锭(EB) 潦化乙锭(EB)有毒,试剂的操作和废弃物的处理按附录B的规定
GB/T28630.2一2012 附录A 规范性附录 试剂配方 A.11mol/LTrisHCIplH8.0 Tris 121.1g 800ml 水 溶解后加人约42mlL浓盐酸调pH接近8.0,冷却至室温,再用2.5mol/几盐酸调整pH至8.0. 1000mL 加水定容至 分装后,高压燕汽灭菌,室温贮存 A.20.5mol/LEDrApH8.0) 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2H,O) 18.6g" 80mL 水 磁力搅拌,用2.5mol/几氢氧化钠调节溶液pH值至8.0,完全溶解,定容至100ml. 高压蒸气灭菌,室温贮存 A.3TE缓冲液p8.0 10 1mol/LTrisHClpH8.0) ml 0.5nmol/L EDTApH8.0) 2ml 加水定容至 l000ml 高压蒸气灭菌,4C贮存 A.41mg/mL胰RNA 胰RNA酶 10mg 10ml TE缓冲液pHH8.0 溶解后,于100C加热15min,缓慢冷却至室温,分装100AL/管，一20C贮存 A.510"%SDs SDs(十二炕基硫酸钠 10g 水 90ml 加热至68C助溶,加人几滴浓盐酸调节溶液的pH至7.2,加水定容至100mL 室温贮存 若溶液有结晶形成,用前加热融解即可 sDS微细晶粒易于扩散，称量时要戴面罩,称量完毕后要清除残留在称量工作台区和天平上 的SDS.
GB/T28630.2?2012 A.6?? 1mL 1mol/LTrisHClpH8.0) 20 0.5mol/LEDTA(pHH8.0) n 2m 1mg/mLRNA? 10%SDS 5ml 100m ? ,档 A.720 )mg/ml?k 20 ?K mg ? 1ml ????(0.25mL/),?20c±档 A.810mo/L 77g ? 30ml ?100mL,0.45um??4C档 -?-?(25:24:1) Tris? 50mlL ?? 48mlL 2ml 0.01mol11TrisHcl(pH8.0) 100mL ?,?????,4C棬1?á A.1050?? Tris 242g 57.1mL 0.5mol/LEDTA(pH8.0) 100mL 1000 ? ml 档 A.111?? 20m 50?? 1000mL ? 10o
GB/T28630.2?2012 A.126? 40g 100m ??, 0.25g ?,4C档 A.130.5mol/LKMnO. KMnO 79 g ??, 1000ml. 档 A.142.5mol/ 246.35m 500ml?м?(37%HCI ??,? 1000mL 档 A.152.5mol/L 100g ?700mL?,? 1000ml ???,?,档 A.1610mg/ml??(EB)? 廯?(EB) 10mg ? 1ml С?????±???С ????ж?,???,?,????,??? ,μ?B A.1770"%? ?? 70ml ?30mL., 100mL ?,档 11
GB/T28630.2一2012 附 录B 规范性附录 CR实验室要求和化学药品及仪器设备操作安全注意事项 B.1CR实验室分区 PCR前和PCR及PCR后的工作范围应分区成为相互隔离的实验室,所需试剂、仪器、实验室各种 用品、工作服等均应独立使用 长期从事常规性PCR检测工作的人员也应进行专门分工 专用于进行套式CR检测的实验室应分为四个隔离的区域(房间),包括洁净区、样品区、扩增区、 洁净区和样品区属于PCR前区,扩增区和电泳区属于PCR后区 其中洁净区专用于配制和 电泳区 分装PCR所用试剂,不应接触任何样品;样品区专用于进行样品的处理和第一步PCR的加样,不应接 触任何PCR产物;扩增区专用于进行PCR循环和第二步PCR的加样,不应暴露第二步PCR产物， 由 于暴露第一步PCR产物也可能造成严重污染,应对扩增区经常进行产物污染的消除处理;电泳区专用 于PCR产物的检测 只允许从洁净区一样品区一扩增区一电泳区的单向物流,同时PCR后区应尽可 能避免各步PCR产物的污染 应定期对专门从事PCR的实验室各区的产物污染程度进行测试评估,并有针对性地进行消除产物 污染的处理 B.2含PCR反应产物的材料 PCR反应产物的不当处理会造成实验室的严重污染,含PCR反应产物的用品,如枪头,离心管、,凝 胶和手套等应用3.0×10-浓度的含氧消毒剂溶液处理后,再以塑料袋密封包装后丢弃,含有PCR反 应产物的溶液应加人含氯消毒剂达3.0×10-的浓度,，经处理10min以上后方可直接倒人下水道口 可能沾污PCR反应产物的衣物,桌椅、拖把、扫帚、垃圾桶等严禁带人PCR前区 应保存的PCR产物 只能密封保存在PCR后区 B.3澳化乙锭 溴化乙锭为致癌物,有中度毒性,可通过皮肤或粘膜吸收,对环境有污染,应按照以下方法来进行操 作或处理 B.3.1澳化乙锭浓溶液的净化处理 加人足量的水使澳化乙锭的浓度降低至0.5mg/mL以下 加人1倍体积的0.5mol/L高缸酸钾 小心混匀后再加1倍体积的2.5mol/1盐酸 小心混匀,于室温放置数小时 加人1倍体积的 2.5mol/1氢氧化纳,小心混匀后可丢弃该溶液 0.5nmol/L高孟酸钾、2.5nmol/L盐酸、2.5mol/1氢氧化钠按附录A的规定配制 B.3.2澳化乙锭稀溶液的净化处理 每1ml熔液中加人I0mx粉状活性炭 于窒昌放置1h,不时摇动 用whauml号谴纸过 滤溶液,丢弃滤液 用塑料袋封装滤纸和活性炭,作为有害废物处理 12
GB/T28630.2一2012 B.3.3澳化乙锭固体的操作 应避免吸人或食人嗅化乙锭的固体或粉尘 操作人员要穿戴实验服及手套,如果不慎沾到皮肤,立 即用大量清水冲洗 B.4酚、三氯甲院等有毒害有机溶剂 有强腐蚀性,操作时要穿戴实验服及手套 应避免吸人或食人 直接的皮肤接触应立即用大量清 水冲洗 B.5电泳 电泳时会产生100V一600V的直流电压,同时电极处会产生大量的微小气泡 应盖好电泳槽上 盖以避纪气池炸裂导致R产物的污染和有番试剂的挥发 避免接触电极及液面以防触电 B.6紫外线 长时间暴露于紫外线下会对眼睛及皮肤造成严重伤害,因此在使用紫外观察仪时应穿上实验服、护 目镜及防护面罩 13
GB/T28630.2一2012 附 录 c 资料性附录 白斑综合征(wSD)套式CR检测产物序列 1 GrcGACAGAC卫AcTAACTTCAccCTATCTAGTAAAACAAGCrAAAAGATcGAcGGAGrT cccrccC'ccrcAccccccrcrcAcccarccmcecArcaA9 61GAcCCAGcCT 121TCcCATACAAAGTCATCTTTCATGGACAACATCAAATTGCACATGACTGATACTCAATGC 181T'cTcAAGAAcATGAacGArrGAGAAAcrrGGGAAGaTArGGGGAcGAaTAcGcc 241ATGrcccacAaGcAAAArrGTAAcrcccccTrccArcrccaccAcAcr"T里acTcccrcA pccOmmC 301GA里AAcGAGCAcrGGTATccTc" cccccGcccAGAaGrcrccArGGAAGAA 361ATTAGAcccAcAccc里ArcAcGccAAcAAGcTTATAGrGAcAAAcArTAcGrGArGAAc 421ATGTcCAAGATcGATCAGAGTAACAGGTCTTCcCrcCTTAAGAAGGrrAGcGAATGG 481ACTGAAArGAGAATGAACrCCAACTTTAATGGAACATrGAAcCArCAAGACTcGccCrC 541TCCAACTCTGGCATGACAACGGCAGGAGTCAAcCTcGAcGTTATTGTCAAAcCAAATAAT 601GCAAGAAGTGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGcCAGCAcGTGTGCACcGccGAcGcC 661AAGGGAACTGTCGCTTCAGCCATGcCAGcCGTCTTcCAGGCAAccGAGGAAAcGGTAAC 721GAArcTGAAcTGAccAGAAGcrcrcccAAcGAAcAGATAcArccAAAAGAGCACAATG 781AacGcrCAAAcrGrcGrGTrGc里AArGT"TGGAacAAcCTArcGccGATcT"rGGAAAG 841GTrATcGrGAAcGAAcTGcc CGGCAcCATCGCTGAATGTACCAGAAAGcGTATATGAA 901AACAcCAAcGAAATGATrGATAGAcTaGGcrcrGAcGacccrTcAAArcTAA里AA里AAT" 961cGaGGAG里AGAAcAArcGATrArGAAGATAGcGAAACAAcArcCAACAATGGrcccGmc 1021crcATcrcAGAcccArGAAGAATGccGTcTATcACACACTAATTccGGcAAGcGCAGc 1081cccccGGAAAArG里AccArrcGccrcArGccccAGcGGcc 1141cTGrcAAaGGcAGA里ac ATTCG酒AGAAAAGAACGCCGAA AAGGTGCAGCAGCTGCcGTA 1201rccrcrAcCATrcrccrC ACTCTTCGTAAGCAT'TTGGCTCGAGTTTTC 1261GAAGcCACcTAAGCAAGAAcrGArGcT GAATrcAAGGA里ArccrcAAcGATArcGAE 1321cGTAATATTcTrcrGAcTATAcTAAcrGrccaccAAaTAcrAAccAAAArGccTrrGcn 1381cTAGcTATCAAGAGAGAATrcAGCAGAArTGrrrccrrcrTAAccArTcTrcGTAAGAAc 1441A7AcacccGcArTaGrcGA C R1 14

白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分：套式PCR检测法GB/T28630.2-2012

白斑综合征(WSD)是水产养殖业中一种常见的病害，其可引起虾类的广泛死亡和损失。因此，快速、准确地诊断该病害至关重要。目前，WSD的诊断方法有很多种，其中，套式PCR检测法是一种较为可靠、高效的方法。 GB/T28630.2-2012标准是基于对WSD病原菌白斑综合征病毒（WSSV）感染虾体组织进行研究得出的。该标准的检测步骤包括样品制备、DNA提取、PCR扩增、电泳分析等。具体来说，首先需要采集虾体组织样品，然后通过DNA提取技术将样品中的DNA提取出来。接着，使用特定引物在PCR反应中扩增目标序列，并通过电泳分析检测扩增产物。 GB/T28630.2-2012标准的优点是具有高度的专一性和敏感性，能够快速、准确地检测出WSD病原菌。此外，该方法还可以同时检测多个样品，具有较高的效率。但是，该方法也存在一些局限性，比如不能区分不同毒株的WSSV，以及可能受到样品质量等因素的影响。 总之，GB/T28630.2-2012标准作为一种套式PCR检测法，在WSD的诊断中具有重要意义。未来，随着技术的不断发展，相信会有更加先进、高效的诊断方法应用于WSD的检测中。

白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分：套式PCR检测法的相关资料

和白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分：套式PCR检测法类似的标准

GB/T28630.5-2012

白斑综合征(WSD)诊断规程第5部分：新鲜组织的T-E染色法

2022/10/28 19:16:17 现行

GB/T28630.4-2012

白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断法

2022/10/28 19:13:08 现行

GB/T28630.3-2012

白斑综合征(WSD)诊断规程第3部分：原位杂交检测法

2022/10/28 19:05:21 现行

GB/T28630.2-2012

白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分：套式PCR检测法

2022/10/28 18:57:52 现行

GB/T28630.1-2012

白斑综合征(WSD)诊断规程第1部分：核酸探针斑点杂交检测法

2022/10/28 18:47:59 现行