GB/T30737-2014
海洋微微型光合浮游生物的测定流式细胞测定法
Determinationofmarinephotosyntheticpicoplankton―flowcytometry
- 中国标准分类号（CCS）A45
- 国际标准分类号（ICS）07.060
- 实施日期2014-10-01
- 文件格式PDF
- 文本页数13页
- 文件大小500.50KB
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海洋微微型光合浮游生物的测定流式细胞测定法
国家标准 GB/T30737一2014 海洋微微型光合浮游生物的测定 流式细胞测定法 Determinatioofmarinephot0syntheticpieoplankton Floweytometry 2014-06-09发布 2014-10-01实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T30737一2014 目 次 前言 范围 规范性引用文件 术语和定义 方法原理 主要仪器设备 试剂 样品采集与处理 测定步骤 结果分析与计算 附录A(规范性附录)海洋微微型光合浮游生物测定流式细胞测定法采样和测定结果记录表格式 参考文献
GB/T30737一2014 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由国家海洋局提出
本标准由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口
本标雅起草单位;国家海洋局南海环境监测中心,厦门大学,国家海祥局第二海洋研究所、华东师范 大学、科学院南海海祥研究所 本标准主要起草人;朱艾嘉、焦念志,黄楚光、骆庭伟、邓鸿,乐风风,邱大俊,李海涛、杨振雄、林端、 方宏达,许战洲,蔡伟叙,曲念东
GB/T30737一2014 海洋微微型光合浮游生物的测定 流式细胞测定法 范围 本标准规定了海洋微微型光合浮游生物中原绿球藻,聚球藻和微微型真核藻类细胞数量的流式细 胞测定法
本标准适用于海洋微微型光合浮游生物中上述3个主要类群细胞数量的流式细胞测定
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T12763.62007海洋调查规范第6部分:海洋生物调查 术语和定义 GB/T12763.6一2007界定的以及下列术语和定义适用于本文件 3.1 浮游生物planktonm 缺乏发达的运动器官,没有或仅有微弱的运动能力,悬浮在水层中,常随水流移动的生物
注改写GBy/T12763.6一2007,定义3 3.9
3.2 微微型浮游生物picoplankton 粒径范围在0.2m一2m的浮游生物
注1，微微型浮游生物不是一个严格的生物学概念,而是一个生态学概念 注2改写GB/T12763.6-2007,定义3.9
3.3 微微型光合浮游生物photosyntheticpicoplankton 能进行光合作用的微微型浮游生物
注，微微犁光合浮游生物又包括自养和异养两种类型,以自养型的占绝对优势
自养型的微微型光合浮游生物由 三个主要类群组成:原绿球藻、聚球藻和微微型真核藻类
异养型的微微型光合浮游生物主要为不产氧光合细 phototrophicbacteria,APB)y 商(aosysenie 原绿球藻 Prochlorococcsspp.;Pro. 蓝细菌(Cyanobaeteria)中的一属,为原核生物,粒径一般为0.6Am左右,其主要特征色素为二乙烯 基叶绿素(DiVinyl-Chlorophyll,DvChl 3.5 聚球藻Synechococcs .;Syn. spp.; 蓝细菌中的一属,为原核生物,粒径一般为1Mm左右,除了含有叶绿素a(Chlorophyla)外,其主
GB/T30737一2014 要特征色素为藻胆蛋白(phycobiiprotein,PBP),包括藻红蛋白(phyeoerythrn,PE>和藻蓝蛋白(phyo eyanin,PC). 3.6 微微型真核藻类piceukaryotes;Euk 由多种隶属于不同门类的真核浮游植物组成,粒径范围在0.2m一2um,它们的主要色素为叶绿 素a 方法原理 一种在单细胞水平上对微微型光合浮游生物组胞物理化学和生物化学性质进行快迷测定 本方法是- 的方法
含有荧光物质的微微型光合浮游生物细胞在检测区受激光照射后,产生前向散射光、侧向散射 光和荧光
前向散射光信号表征细胞的大小和形状,侧向散射光信号表征细胞质的颗粒性,荧光信号表 征细胞的荧光物质含量
根据原绿球藻,聚球藻和微微型真核藻类上述信号的不同进行区分和计数
主要仪器设备 主要仪器设备如下 a)流式细胞仪(配备488nm激光器): b液氮罐; 超低温冰箱(一80C); c) d漩涡振荡器 试剂 固定剂 样品可采用多聚甲醛溶液(固定终浓度为1%)或戊二醛溶液固定终浓度为0.1%)进行固定,也可 同时加人多聚甲醛溶液和戊二醛溶液进行固定(固定终浓度分别为1%和0.05%)
多聚甲醛溶液和戊 二醛溶液获得方法如下 多聚甲醛溶液;市售电子显微镜用多聚甲醛溶液或自制10%多聚甲醛溶液
自制10%多聚甲 醛溶液配置方法是;在通风橱中称取10g多聚甲醛粉末放人70mL煮沸的燕僧水中,连续搅 拌至少2h(可使用恒温磁力搅拌器);加人少量氢氧化钠(NaOH)溶液(o.1mol/L)直至溶液 10%的磷酸盐缓冲液(PIs),调节到pH7.5;定容至100mL;用孔径为 澄清;加人10ml 0.2 24m的注射器过滤器过滤
过滤后的多聚甲醛溶液可分装于15ml.的小管中,一20C保 存
未冻结的多聚甲醛溶液(4C保存)使用不宜超过1周
b戊二醛溶液:市售电子显微镜用25%或50%戊二醛溶液
注:上述固定终浓度均为体积百分比
鞘液 6.2 鞘液宜使用经孔径0.2pm谴膜过谴的现场海水,也可使用超纯水 6.3标准荧光小球(hends)悬浮工作液 用超纯水稀释直径1Am的标准黄绿荧光小球悬浮液至浓度约为10个/L的工作液
GB/T30737一2014 注:标准荧光小球在流式细胞测定时能产生固定强度的红色和橙色荧光,而且小球颗粒大小固定,因此可作为荧光 和散射光信号的内部参考物质
样品采集与处理 7.1样品采集 按GB/T12763.6一2007中7.1.1、7.1.2的规定进行
7.2采水量 每次采水量宜不少于30mL
7.3样品固定与保存 7.3.1水样应先用孔径204m筛绢预过滤至润洗2次一3次的清洁小烧杯中 7.3.2可在12h内上机分析的样品,可置于4C避光保存
7.3.3样品固定保存方法如下 a)吸取预过滤水样至2mL或5ml的冻存管中,加人固定剂[见6.1a)或6.1b)],用漩涡振荡器 [见第5章d)]充分混匀,用铝箱纸包裹好,避免光照 min后,置于液氮[见第5章b]中速冻.然后转移到一80C超低温冰箱[见 b 在室温下放置15nr 第5章e)]保存或直接存放在液氮[见第5章b)]中直至分析
注，样品宜尽快分析，一80C超低温冰箱[见第5章e)]或液氮[见第5章b)]中保存不宜超过1年,若一20C条件 下保存则不宜超过1个月
7.4记录 将采样情况记录于表A.1
测定步骤 8.1测定准备 8.1.1将鞘液(见6.2)置人流式细胞仪[见第5章a)]中,当使用过滤海水作为鞘液时,宜短接仪器内的 郸液过滤器以防止鞘液过滤器受污染
若不短接椭液过滤器,当鞘液过滤器受污染导致背景嗓音增多 和流路不稳定等情况时,应更换鞘液过滤器
8.1.2开机预热
8.2测定方法 8.2.1流量校准法 进行流量校准,方法如下;进样管中加人过滤海水或超纯水.测量样品重量;卸下进样针的针管 8.2.1.1 套,待鞘液滴从进样针中滴下,在下一滴鞘液滴滴下前放上进样管,还原托架位置,同时开始计时;至少 10min后取下进样管,同时停止计时,记录测定时长,测定剩余样品的重量
流量计算用式(1): W一W R= T×l
GB/T30737一2014 式中: R -流量,单位为微升每分(L/min): 测定时间,单位为分(rmin); T 初始重量,单位为毫克(mg); W 测定后所剩重量,单位为毫克(mg) W l -进样管内液体密度,单位为毫克每微升mg/L). 注:过滤海水d=1.03mg/nL,超纯水d=1.00; mg/nl 8.2.1.2样品分析时，一天内校准流量不少于4次 8.2.1.3冷冻保存样品置于常温或37C水浴中避光解冻备用
8.2.1.4吸取500Al1000Al水样至进样管中,加人10AL标准荧光小球悬浮工作液(见6.3),用漩 涡振荡器[见5d]混匀
8.2.1.5将装有水样的进样管放置于样品托架上后开始进样
8.2.1.6设定仪器各散射光和荧光通道的电压值,在红色荧光通道设定闵值,保证目标细胞群出现在分 析图谱中
电压值的大小应视样品散射光和荧光信号的强弱而定
注;一般各散射光和荧光通道电压参考值为;前向散射FSC为Eo1(个别仪器型号需设定具体电压值,侧向散射 SSC为420V,绿色荧光FL1为630V,橙色荧光FL2为550V,红色荧光FL3为600V,红色荧光FL3值为 50V
所有电压信号设定为对数放大模式Log档) 8.2.1.7选择流量档,流量宜控制在10AL/min~30aL/min范围内,采集颗粒速度50个/s100个/s 为宜
8.2.1.8稳定至少15s后开始采集数据,采集数量宜大于10000个颗粒
记录样品分析时仪器的电压 设置
8.2.1.9流量校准法为仲裁方法
除本方法外,另有内标法(见8.2.2)
8.2.2内标法 8.2.2.1标定标准荧光小球悬浮工作液(见6.3)的浓度
标定方法可使用荧光显微镜直接计数法
标 定前用漩涡振荡器[见5d]混匀,防止荧光小球凝聚沉底
有条件者可使用绝对计数管,绝对计数管内 含有已知数量的标准小球,不需对标准荧光小球悬浮工作液(见6.3)的浓度进行标定
8.2.2.2样品解冻,加样,进样、仪器参数设定、流量档选择和数据采集按照8.2.1.38.2.1.8规定的步 骤进行
结果分析与计算 9.1不同类群细胞的区分 根据各细胞群光散射信号和荧光信号橙色茨光和红色荧光,分别表征藻胆蛋白和叶绿素含量)的 差异区分原绿球藻,聚球藻和微微型真核藻类
(当使用超纯水作为鞘液时,会对散射光/荧光信号的绝 对值产生一定影响,但对于各细胞类群散射光/荧光信号的相对强弱无显著影响,不影响细胞类群的区 分与计数
)前向散射光、侧向散射光和红色荧光信号强度大小依次为微微型真核藻类>聚球藻>原绿 球藻;橙色荧光信号强度大小依次为;聚球藻一原绿球藻微微型真核藻类
流式细胞分析图谱中细胞 类群的区分见示意图1
GB/T30737一2014 10 10 Euk Euk 10 101 103 10 101 I0" 109 10 109 10 100 10 103 109 104 10 10s 前向散射光 侧向散射光 1o 10 bead Euk 10 10 Syn Syn s 10 安 1o 10 Pr bcads 10 10 100 103 1010 o3 10 0 橙色奖光 侧向散射光 图1流式细胞分析图谱中原绿球藻、聚球藻和微微型真核藻类区分示意图 9.2 获取细胞数 在仪器分析结果的散点图上圈出目标细胞群,仪器自带的分析软件将自动给出该类群细胞的数量， 做好记录
9.3细胞密度计算 9.3.1使用流量校准法时,样品中每个类群的细胞密度可用式(2)计算 N×V×1000 V又R又T" 式中: C 细胞密度,单位为个每毫升(cdl:/ml) 获取该类群的细胞数量,单位为个(cells). -样品体积加上添加物(固定剂、标准荧光小球悬浮工作液等)的体积,单位为微升(AL) -样品体积(不含固定剂,标准荧光小球悬浮工作液等添加物体积),单位为微升(aL) R 样品流量,单位为微升每分(pL/nmin); 样品测定时间,单位为分min)
g.3.2使用内标法时,样品中每个类群的细胞密度可用式(3)计算 N×Q×1000 V.×N6 式中 -细胞密度,单位为个每毫升(cells/mL); -样品中添加的标准荧光小球数量,单位为个; ？. N 获取该类群的细胞数量,单位为个(cell)
GB/T30737一2014 N 获取标准荧光小球数量,单位为个; -样品体积(不含固定剂,标准荧光小球悬浮工作液等添加物体积),单位为微升(L
9.4记录 将测定结果和计算结果填于表A.2
GB/T30737一2014 附录A 规范性附录 海洋微微型光合浮游生物测定流式细胞测定法采样和测定结果记录表格式 表A.l表A.3给出了海洋微微型光合浮游生物流式细胞测定采样和测定记录表格式
表A.1海洋微微型光合浮游生物流式细胞测定海上采样记录表 任务名称 任务编号 海区， 调查船 采水器名称型号 采样日期: 页共 年 年 第 日 日至 站位 水样 固定剂 采样 采样 水深 水层 序号 样品编号 体积 体积 经度 纬度 日期 时间 m m 编号
" o" ml ml 10 11 12 13 14 15 16 18 备注 采样者 记录者 校对者
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GB/T30737一2014 s 窖 司 出 四 典 母 嵌 四 , 烘 州 E
GB/T30737一2014 参考文 献 [1]焦念志.海洋微型生物生态学[M].北京;科学出版社,2006. [2]宁修仁,孙松.海湾生态系统野外观测方法[M].北京;环境科学出版社,2005， [3]MARIED，PARTENSKYF，VAUL.0TD，BRUSSAARD Enumerationof phytoplanktonbacteriaandvirusesinmarinesamples[M]//ROBINSONJ,DARZYNKIEwICZZ o DEANP,DRESsLERL,RABINOVITCHP,STEwARTC,TANKEH,wHEELESsL.Currentl ro- tocolsinCytometry.NewYork:Johnwiley8.SonsInc.,1999;11.11.111.11.15. cellcountingbylow.eytomery[M]/ [4]MARIED,SIMONN,VAUL0TD.Phytoplankton N sevierAcademicPress， ington;EIs ,2005;235-268. ANDERsENRA.AlgealcalturingTcdhamiques W 10
海洋微微型光合浮游生物的测定流式细胞测定法GB/T30737-2014
海洋微微型光合浮游生物是海洋生态系统中重要的生物种群之一，在海洋生态环境研究和海洋资源开发利用中具有重要的意义。为了准确地测定海洋微微型光合浮游生物的数量和分布，现在广泛采用流式细胞仪技术。下面将详细介绍海洋微微型光合浮游生物的测定流式细胞测定法GB/T30737-2014。
方法原理
流式细胞仪是一种高精度和高通量的细胞分析技术。它可以通过多参数检测和分类来同时对数千个单个细胞进行分析。利用流式细胞仪的技术原理，可以对海洋微微型光合浮游生物进行准确、快速和高通量地测定。
海洋微微型光合浮游生物的测定流式细胞测定法GB/T30737-2014主要基于流式细胞仪的技术原理。它采用荧光染色和激光散射技术对样品中的光合浮游生物进行检测和分类。通过测定不同波长下的荧光信号和散射光信号，可以对不同类型的光合浮游生物进行区分，并计算其数量和比例。
实验步骤
海洋微微型光合浮游生物的测定流式细胞测定法GB/T30737-2014的实验步骤如下：
- 取一定数量的海水样品，用滤器过滤掉颗粒物。
- 将滤液加入含有荧光染料的离心管中，静置15分钟。
- 离心10分钟，弃去上清液。
- 取适量PBS（磷酸盐缓冲液）进行洗涤。
- 将样品溶解在PBS中，用流式细胞仪检测。
应用范围
海洋微微型光合浮游生物的测定流式细胞测定法GB/T30737-2014适用于海洋微微型光合浮游生物的数量和分布研究。该方法可以广泛应用于生态环境监测、海洋资源开发利用等领域。
海洋微微型光合浮游生物的测定流式细胞测定法的相关资料
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