猪链球菌2型三重PCR检测方法

猪链球菌2型三重PCR检测方法

国家标准 GB/T19915.4一2005 猪链球菌2型三重PCR检测方法 MethodofdeteetingStreptocoeessuistype2ytriplc-PCR 2005-11-01实施 2005-09-27发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T19915.4一2005 猪链球菌2型三重PCR检测方法 范围 本标准规定了猪链球菌2型荚膜基因(cs2),溶菌酶释放蛋白基因(mrp)和orf2这三个毒力基因 的三重PCR检测技术 本标准适用于由猪链球菌2型致病基因和致病菌株的检测 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T66821992分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 e2 猪链球菌2型Sirn reptococcussuistype 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌,根据其荚膜多糖抗原的差异,可分为134及1/2共35个 血清型 猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型,不仅对猪致病性很强,而且可以感染特定的人群,是 -种重要的人畜共患病病原菌 测定方法 方法提要 挑取可疑细菌培养物菌落,加人PCR反应管中,进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物、 与标准分子量标记比较,来确定扩增产物的大小 4.2试剂和材料 除另有规定,所用试剂均为分析纯,水为符合GB:/T6682一1992的灭菌双燕水 p2.rp和r/2的上下游引物,按合成说明书使用. 4.2.1 4.2.2TuqDNA聚合酶 4.2.3琼脂糖;电泳级 4.2.4溴化乙锭 4.2.5分子量标记.DL-20o0. 4.2.6TE缓冲液:l0mmol/1TriHCl(pH8.0),lmmol/LEDTA(pH&.0). 4.2.710×PCR缓冲液;100mmol/LKCl,160nmmol/L(NH,.SO,20mnmol/LMgSO,200mmol/I Tris-HClpH8.8).1%TritonX-100.1mg/mLBSA 4.2.8电泳缓冲液242gTris碱，57.1ml.冰乙酸,100mL.0.5mol/LEDTA(pH8.0),加蒸僧水至 1000mL,使用时10倍稀释 4.2.9加样缓冲液;0.25%澳酚蓝,40%蔗糖 4.2.10阳性对照猪链球菌2型HA9801株基因组DNA模板,阴性对照马链球菌兽疫亚种ATcc 35246株和金黄色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA模板
GB/T19915.4一2005 4.2.11猪链球菌2型三重PCR反应混合物 4.3仪器和设备 4.3.1离心机 4.3.2DNA热循环仪 4.3.3核酸电泳仪 4.3.4pH计 4.3.5移液器,10L.20L,100L1000L 4.3.6紫外线透射仪或凝胶成像系统 4.3.7恒温水浴锅 PCR操作步骤 阳性对照和阴性对照DNA模板的提取 分别将猪链球菌2型HA9801,马链球菌兽疫亚种ATcc35248株和金黄色葡萄球菌ATcc 25923株接种于5%犊牛血清Todd-Hweitt肉汤培养基,37C摇振培养18h,用革兰氏阳性细菌柱离心 式基因组DNA小量抽提试剂盒提取INA模板，一20c保存备用 4.4.2PCR扩增 用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌2型三重PCR反应混合物的PCR管中,混 匀,加人Taq酶(2U/L)0.7L.2000r/min离心10s,立即进行CR扩增;同时设去离子水的空白 对照、猪链球菌2型HA9801株基因组DNA模板的阳性对照、马链球菌兽疫亚种ATcc35246和金黄 色葡萄球菌ATcc25923株基因组DNA模板的阴性对照 扩增条件为;94C预变性5min;94C30s 55C30s,72C40s,30个循环;72C延伸7min,4C保存 4.4.3琼脂糖凝胶电泳 在电泳缓冲液中加人1%琼脂糖,加热融化后加人澳化乙锭制备凝胶,凝固后进行电泳 8L酶切 产物加人2L5X上样缓冲液,混匀后加人上样孔.80V恒压电泳20mn,紫外线透射检测 结果及判断 5.1试验结果成立条件 阳性对照HA9801株经PCR扩增出现约858bp,387bp和316bp三条条带,去离子水的空白对 照,马链球菌兽疫亚种ATcc35246和金黄色葡萄球菌ATcC25923株基因组DNA模板的阴性对照 PCR产物电泳后没有条带,试验结果成立,否则,结果不成立 5.2结果判断 琼脂糖凝胶电泳后,在紫外线投射下检测,在空白和阴、阳性对照成立的情况下,待检样品只出现 387p一条条带,可判定为猪链球菌2型;待检样品出现约387p,316bp和858bp三条条带,或出现 387p和858bp两条条带,可判定为猪链球菌2型致病菌株;待检样品只出现858bp一条条带,可判 定为非猪链球菌2型的致病菌;待检样品不出现条带,结果为阴性 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物,应收集后高压灭菌处理