美澳型核果褐腐病菌活性检测方法

美澳型核果褐腐病菌活性检测方法

国家标准 GB/T40252一2021 美澳型核果褐腐病菌活性检测方法 ViabhilitytestofMoniliniafruicolaG.winter)lHoney 2021-05-21发布 2021-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/40252一2021 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分;标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本文件起草单位;深圳海关,深圳市检验检疫科学研究院、深圳市仙湖植物园 本文件主要起草人:章桂明、王颖、高瑞芳、程颖慧、朱子钦、李娜、黄河清、刘莹
GB/T40252一2021 美澳型核果褐腐病菌活性检测方法 范围 本文件描述了应用普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对美澳型核果褐腐病菌[Moni/in- iafruticolaG.winter)Honey]进行活性检测的方法 本文件适用于美澳型核果褐腐病菌相关寄主中携带美澳型核果褐腐病菌的分生袍子活性检测 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件 SN/T2589植物病原真菌检测规范 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 活性viability 具有生命力的一种性质 3.2 分生抱子活性conidialiablity 分生抱子具有生命力的一种性质 注分生抱子具有活性,说明分生抱子是活的;分生抱子不具有活性,说明分生抱子是死的 基本信息 中文名;美澳型核果褐腐病菌 英文名:pathogenofAmerieanbrownrotofstonefruit rwicola(G.winter)Honey 学名Moniliniaf" Winter)Rehm. 曾用名:Sclerotiniafructicola 无性态;MonilhiaruethicolaBatra 分类地位;属真菌界(Fune),子粪菌门(Aeo comyco1 ta)子囊菌纲(Asc Ascomycetes),柔膜菌目(Helotiar les),核盘菌科(Selerotiniac ,链核盘菌属(Monilinia). eae 美澳型核果褐腐病菌寄主、症状,菌落特征及分生弛子形态学特征见附录A . 原理 uresceinDiacetatd 分别应用二乙酸荧光素(Flou te,FDA)和碘化丙(PropidiumIodide,PI)荧光染料
GB/T40252一202 对美澳型核果褐腐病菌抱子进行染色处理,根据FDA可通过细胞代谢留在活细胞内,使具有活性的抱 子发出绿色荧光,如果细胞膜损伤,则荧光素流失,因而使不具有活性的抱子不发出荧光;PI能够穿透 正在死亡或者已经死亡的细胞膜,使不具活性的抱子发出红色荧光,P1不能透过具有活力的细胞膜,使 具有活性的袍子不发出荧光 根据上述特点并运用普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对病菌分 生抱子进行活性检测,分析分生抱子的死活 仪器和试剂 6.1仪器用具 普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜、超净级工作台、天平、高压灭菌锅、生化培养箱、冰箱、离 心机 6.2试剂 二乙酸荧光素(FlouresceinDacetate,FDA)称取0.1gFDA粉末,加人10mL丙酮,配制成浓皮 mg”mL-'的母液,置于棕色瓶4C避光保存 使用前用丙酮稀释,配置成0.5 mgml'的工 为10 作液 碘化丙唉(Propidumbodide,P)称取0.o1gP粉末,加人10mL无菌水,配制成浓度为1mg”ml" 的母液,置于棕色瓶4C避光保存,使用前用无菌水稀释,配置成0.05mgmL-的工作液 6.3主要培养基 1000mL自来水,煮沸 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA);200g去皮马铃薯切成小方块,加人1 15nmin,用四层纱布过滤得到滤液,滤液中加人18只葡萄糖、18g琼脂粉,加热溶解后将溶液定容至 1000mL,分装到三角瓶中,121C高压蒸汽灭菌20min 活性检测方法 7.1检测样品制备 刮取寄主症状病征的分生弛子装人到有无菌水的离心管中,配制成终浓度为每微升含10个~ 100个抱子的抱子悬浮液,镜检,备用 7.2袍子染色 7.2.1FDA染色 取199AL抱子悬浮液,加人1AL质量浓度为0.5mgml-的FDA,混匀,于室温下避光染色 15nmin,16000片离心1min,弃上清液终止染色,加人灭菌去离子水洗涤一次,重新悬浮 现配现用、 避光放置 7.2.2I染色 取199L弛子悬浮液,加人1L质量浓度为0.05nmgml-的P,混匀，于室温下避光染色 4min,16000片离心1min弃上清液终止染色加灭菌去离子水洗涤一次,重新悬浮 现配现用,避光 放置
GB/40252一2021 7.3普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜活性检测 7.3.1普通荧光显微镜检测 7.3.1.1制片 吸取5AL活性染料处理之后的样品制备玻片,封片 7.3.1.2检测 将制好的破片立即放置于普通炎光显微镜载物台上,在低倍镜下找到瘪子,然后转至10僧镜下观 察,微调至视野内图像清晰下观察并计数 至少检测30个抱子,观察染色情况 FDA染色检测;将荧光光路打开,设置荧光通道的激发波长488nm,收集荧光信号的发射波长 530nm,收集荧光信号 微调至视野内图像清晰 见附录B) PI染色检测;将荧光光路打开,设置荧光通道的激发波长534nm,收集荧光信号的发射波长 617nm,收集荧光信号 微调至视野内图像清晰 见附录B 注，为了保证图像能够反映出袍子最真实的荧光染色情况,特别需要观察明场通道下所得到袍子图像是否清晰 7.3.2激光扫描共聚焦显微镜活性检测 制片 7.3.2.1 吸取5AL活性染料处理之后的样品制备玻片,封片 7.3.2.2激光设置" 选择相应的激光管(氧离子激光器)激发荧光信号,FDA检测设置荧光通道的激发波长(488nm) 收集荧光信号的发射波长(530nm),并设置一个明场通道作为对照 PI检测设置荧光通道的激发波长 534nm),收集荧光信号的发射波长617nm),并设置一个明场通道作为对照 7.3.2.3扫描设置 选择低像素扫描模式扫描(xy:512×512),重复扫描次数Average为1次,扫描速度Speed为9,根 据成像效果渊整探测针孔Pnhoe.光电倍增管增益Gan和激光扫描强度Scan.sir等参数,将图像调整 至质量较好的效果 再用精确扫描方式(xxy:2048×2048)然后根据信噪比调整扫描模式,选择精确像 素的平面扫描方式进行粗略扫描(xy;2048×2048),重复扫描次数Average为2次,扫描速度Speed为 6,获取最终图像 7.3.2.4检测 将制好的破片立即放置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上低倍镜下找到弛子,转到40倍镜下观 察,微调至视野内图像清晰,扫描至少30个袍子,观察染色结果 见附录C) 注:为了保证图像能够反映出抱子最真实的荧光染色情况,特别需要观察明场通道下所得到抱子图像是否清晰 结果判断与表述 8 通过普通荧光显微镜或激光共聚焦显微镜扫描检测分别经FDA和PI处理至少30个分生抱子 结果判断与表述如下: 如经FDA处理检测到分生袍子发绿色荧光,以及经PI处理检测到分生袍子不发荧光,则判定 该分生抱子具有活性;
GB/T40252一2021 如经PI处理检测到分生抱子发红色荧光,以及经FDA处理检测到分生抱子不发荧光,则判定 该分生袍子不具有活性 9 样品与原始数据集保存 9.1样品保存 存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式,妥善保存6个月 如发现具有活性的美澳型核果 褐腐病菌袍子的,进行斜面保存,如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕 保存期满后,需经灭菌处 理 样品保存方法应符合SN/T2589的规定 9.2原始数据保存 样品检测结束后,其原始记录单和检验结果或证书应归档,妥善保管,以备复验、谈判和仲裁
GB/T40252一2021 附 录 A 资料性) 美澳型核果褐腐病菌寄主、症状,菌落特征及分生袍子形态学特征 A.1主要寄主 主要寄主有苹果(Malusdomestica、番木瓜(Caricaaaya),欧李(CerasusHumilis)、樱桃 Ceras6speudoerasus)欧洲山荣黄(Cornu、mas),杏(Prwnasarmeniaca)欧洲甜樱桃(Pyrunas Cerasus)、欧洲李(Prunusdomestica)、扁桃(Prunusduleis)、桃(Prunus atiwm)欧洲酸樱桃(Pyrunds persica),李(Prwn4ssalicima),杏李(Prun4sximoni)、葡萄(Vitisini/era)批粑(BriobotryaJaoni ca),病菌还可在木瓜属(Chaenoneles),山楂属(Crataegus),椁属(Cydonia,批粑属(Eriobotrya) 刚竹属(Phylosachys)、李属(Prunus),梨属(Pyrus)等寄主上为害 A.2为害症状 该病害主要为害果实,病害发生初期果实表面上形成灰褐色圆形病斑,随后病斑迅速蔓延扩展至全 果,并使果肉变褐软腐,病部表面产生散生的灰褐色绒球状霉层,最后病果大部分或完全腐烂脱落,或干 缩成僵果悬挂枝条上经久不落 若在低湿度条件下,整个果实皱缩,干瘪 受侵染的花和叶变褐,枯萎 形成一个典型的枯萎状,在茎上造成褐色的凹陷区域(溃疡斑),通常其表面聚集着树胶 潮湿条件下 在这些受侵染的组织上产生分生抱子梗束 美澳型核果褐腐病菌为害症状见图A.1 b 美澳型核果褐腐病在苹果上症状 美澳型核果褐腐病在李上症状 美澳型核果褐腐病在桃上症状 图A.1美澳型核果褐腐病菌为害症状图 A.3菌落特征 菌落生长速度快,在PDA培养基上22C培养8d左右,菌落可布满整个培养皿,呈同心轮纹状,菌 落边缘完整,质地均匀,气生菌丝中等发达、呈绒球状,菌落颜色初期灰白,后期呈灰黄色或灰褐色、产抱 量丰富、菌落表面的分生袍子堆呈同心轮纹圆环 菌株在PDA培养基上生长菌落形态见图A.2
GB/T40252一2021 图A.2菌株在PDA上生长菌落形态 A.4分生跑子形态学特征 28m)×(5 19 袍子链呈念珠状,柠檬形至椭圆形,有时顶部平截,大小为(8Am" 9Am),无色 Am 透明,聚集时为灰黄色 分生袍子梗较短,分枝或不分枝,顶端串生分生袍子
GB/T40252一2021 附录 B 资料性 普通荧光显微镜对美澳型核果褐腐病菌抱子染色观察结果图 普通荧光显微镜观察FDA对美澳型核果褐腐病菌抱子染色效果见图B.1 104m 0m 标引序号说明 活袍子染色结果,A为荧光通道,B为明场 A,B C,D -死弛子染色结果,C为荧光通道,D为明场 图B.1普通荧光显微镜观察FDA对美澳型核果褐腐病菌抱子染色效果图 普通荧光显微镜观察P1对美澳型核果褐腐病菌抱子染色效果见图B.2
GB/T40252一202 10m 10m 标引序号说明 A，B -死袍子染色结果,A为荧光通道,B为明场 C,D 活袍子染色结果.,C为荧光通道,D为明场 图B.2普通荧光显微镜观察Pl对美澳型核果褐腐病菌袍子染色效果图
GB/T40252一2021 录 附 C 资料性) 激光共聚焦显微镜对美澳型核果褐腐病菌抱子染色观察结果图 激光共聚焦显微镜观察FDA对美澳型核果褐腐病菌抱子染色效果见图c.1 标引序号说明 A,B -活弛子染色结果,A为荧光通道,B为明场 c,D 死抱子染色结果,c为荧光通道,D为明场 图C.1激光共聚焦显微镜观察FDA对美澳型核果褐腐病菌袍子染色效果图
GB/T40252一2021 激光共聚焦显微镜观察PI对美澳型核果褐腐病菌抱子染色效果见图C.2 0m 10m 标引序号说明 A，B -死袍子染色结果,A为荧光通道,B为明场; 活抱子染色结果,c为荧光通道.D为明场 C.D C.2激光共聚焦显微镜观察P对美澳型核果褐腐病菌抱子染色效果图 图 0
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GB/T40252-2021 美澳型核果褐腐病菌活性检测方法

随着全球贸易的不断发展和扩大，农产品的出口也愈加频繁。而其中一些极具商业价值的农产品，例如水果，由于其易腐性和运输过程中的变化，容易受到各种细菌的污染，进而导致商品的大量损失。为此，必须采取有效的措施保护和监管这些重要的农业资源。

其中，美澳型核果褐腐病菌是一种常见的水果病原体，其可导致多种核果类水果（如桃、杏、李子、西梅等）的腐烂，从而影响商品的质量和市场价值。因此，对于美澳型核果褐腐病菌的活性检测至关重要。

GB/T40252-2021 标准是针对美洲和澳大利亚型核果褐腐病菌的活性检测方法而制定的。该标准详细介绍了样品采集、样品处理、PCR扩增、电泳分离等具体步骤，并且规定了实验室条件、试剂盒种类、阳性对照品等方面的要求。

在进行样品采集时，应选择健康的果实或组织，并尽可能避免损伤。样品处理包括去除表面污染物、切片、提取DNA等步骤。接着，使用PCR技术扩增目标基因区域的DNA，并运用电泳技术进行分离和检测。最后，根据PCR扩增结果和电泳图谱分析结果，可以判断样品中是否存在美澳型核果褐腐病菌。

总的来说，GB/T40252-2021 标准为监管和保护核果类水果提供了重要的技术支持，并且可用于进出口商品的检验检疫。随着技术的不断进步，该标准也将不断更新，以适应更为复杂的市场环境和技术要求。

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