GB/T27517-2011
鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法
AmultiplexRT-PCRmethodtodifferentiatethehighlypathogenicandclassicalporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2012-03-01
- 文件格式PDF
- 文本页数10页
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鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法
国家标准 GB/T27517一2011 鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性 与经典毒株复合RI-PCR方法 AmultiplexRI-PCRmethodltodifferentiatethehighly path0genicandclassicalporeinereproductiveand respiratorysyndromevirus 2011-11-21发布 2012-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27517一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(sAC/TC181)归口 本标淮起草单位;河南省动物疫病预防控制中心 本标准主要起草人;吴志明,目若潜、张志凌、张健、荆汝顶,刘光辉、赵明军、曹杰伟、钱勇,程俊贞、 赵雪丽、张盼
GB/T27517一2011 鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性 与经典毒株复合RI-PCR方法 范围 本标准规定了检测以基因组非结构蛋白Nsp2编码区缺失30个氨基酸为特征的猪繁殖与呼吸综 合征病毒高致病性毒株与非缺失30个氨基酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株复合RT-PCR鉴别 诊断方法
本标准适用于疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猪血清及临床病料等样品中的病毒核 酸检测
试剂和仪器设备 除另有规定外,所用生化试剂均为分析纯
提取RNA所用试剂均应使用无RNA酶的容器进行 分装
2.1试剂 2.1.1拭子悬液(见附录A),组织悬液(见附录A),以上试剂常温保存
2.1.2阿氏液(见附录A),裂解液(Trizol),1×TAE核酸电泳缓冲液(见附录A),氯仿,0.01nmol/L (pH7.2)的PBs(见附录A),DEPC处理水(见附录A),以上试剂4C保存
2.1.3异丙醇,75%乙醇,DNA分子量标准,6×电泳上样缓冲液,以上试剂-20C保存
2.1.4阳性对照、阴性对照(见附录A 2.1.5复合RT-PCR扩增用上、下游引物序列参见附录B
2.1.6鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR反应体系组成、说明及使用 注意事项参见附录C 2.2仪器设备 PCR扩增仪,高速冷冻离心机(离心力在1200og以上),核酸电泳仪和水平电泳槽,恒温水浴锅， 2C8C冰箱,一20C冰箱,单道微量移液器(0.5l10AL;2Al20AL;20200AL;100~ 1000AL),组织匀浆器或研钵,凝胶成像系统(或紫外透射仪),真空干燥器(非必备)
样品的采集,处理,存放及运输 3 样品采集及处理过程的注意事项 采样过程中样本不得交叉污染,采样及样品处理过程中应戴一次性手套、口罩、帽子 3.2样品的采集及处理 3.2.1拭子样品 3.2.1.1鼻腔拭子:采样时要将棉拭子深人鼻腔来回刮35次,取鼻腔分泌物
GB/T27517一2011 3.2.1.2肛门拭子;将棉拭子深人肛门转一圈沾取粪便
3.2.1.3将鼻腔拭子和肛门拭子一起放人盛有1.0ml拭子悬液的Eppendorf管中,然后将拭子悬液 转人无菌Eppendorf管中,4C条件下5000r/min离心l0min,取上清转人新的无菌Eppendorf管中 编号备用
3.2.2组织样品 组织样品采集时应采取有明显病变的淋巴结,扁桃体,肺脏、脾脏、肾脏、胸腺等组织样品
用无菌 的剪刀和锯子剪取待检样品0.5g左有于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨,再加0.3mL" 0.5ml PBS混匀,然后将组织悬液转人无菌Eppendorf管中,4C条件下5000r/min离心10min,取上清转人 新的无菌Eppendorf管中,编号备用
3.2.3血清或抗凝血 用无菌注射器自耳静脉或前腔静脉采集血液3ml~5mL,待血清析出后直接吸取至无菌Eppen- dor管中,编号备用;用无菌注射器先吸人抗凝剂阿氏液)2ml3 ml,再自耳静脉或前腔静脉采集 等量血液,快速混匀后转人无菌Eppendorf管中,编号备用
3.3存放与运送 采集或处理的样品在2C一8C条件下保存应不超过24h;若需长期保存,应放置一70C冰箱,但 应避免反复冻融
采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,尽快运送到实验室
操作方法 4.1样品RNA的制备 4.1.1取1.5ml灭菌Eppendor管,每管加人300L裂解液,然后分别加人待测样品、阴性对照样 品,阳性对照样品各100l,吸头反复吸打混匀(一份样品换用一个吸头);再加人100AL氯仿,充分颠 倒混匀(不宜过于强烈);于4C条件下,12000r/min离心15min. 4.1. 吸取离心后各管中的上清液150L转移至新的1.5mL灭菌Eppendor管中(注意不要吸出 2 中间层),加人150L一20C预冷的异丙醇,颠倒混匀,室温放置15min.
4.1.34C条件下12000r/min离心15min(Eppendor管开口保持朝离心机转轴方向放置)
轻轻 倒去上清,倒置于吸水纸上,吸干液体,不同样品应置于吸水纸不同地方沾干
加人1ml.75%乙醉,轻 轻颠倒洗涤
4C条件下12000r/min离心5min(Eppendor管开口保持朝离心机转轴方向放置)
轻轻倒 去上清液,倒置于吸水纸上,吸干液体,不同样品应在吸水纸不同地方吸干
4.1.54C条件下12000r/min离心30s,将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量加样器尽量将其 吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面,真空抽干3min一5min或室温干燥10min
不宜过于干燥,以免RNA不易溶解
4.1.6加人11lLDEPC处理水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000r/min离心5s,冰上保存备 用
提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增或放置于一70C冰箱备用
4.2反转录(eDNA的合成》 配制反转录反应体系(参见附录C),向每管中加人4.1.6中相应NA10Al,37C水浴1h或置 于PCR仪中37C1h,反应结束后,70C15min灭活反转录酶,直接用于下面的PCR扩增或一20 冻存备用
GB/T27517一2011 4.3复合CR扩增 配制复合PCR反应体系(参见附录C),在室温下融化后,瞬时离心使液体全部聚集在管底部,向每 管中加人4.2中相应cDNA4AL,经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底,加人25L的石蜡油 覆盖液面(若PCR仪具有热盖加热功能时PCR反应管中也可不加石蜡油,但推荐采用加石蜡油的 方法) PCR扩增条件:95笔预变性5min后,94C45s,59C45s,7245s共35个循环,最后72笔延 伸10min
扩增反应结束后取出放置于4C
rCR扩增产物的电泳检测 称取1.2只琼脂糖加人I00mL核酸电泳缓冲液中加热,充分溶化后稍放凉,加人适量的澳化乙键 (终浓度0.万a/nL.)倒人胶情制备凝胶板
在电沫糟中加人1XTAE核酸电冰缓冲液,使被而刚朋 没过凝胶
取5L~10L.rCR扩增产物分别和1L~?L.6×电泳上样缓冲液混合后,分别加样到 各凝胶孔取5LDNVA分子量标准加到一凝胶孔中
5V/em恒压下电泳30min左有
将电泳好的 凝胶放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果,进行判定并做好试验记录
结果判定 试验结果成立条件 猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株阳性对照的PCR扩增产物,经电泳后分别在400bp 和264bp位置出现特异性条带,同时阴性对照的CR扩增产物电泳后没有任何条带(参见附录D),则 试验结果成立;否则结果不成立
5.2阳性判定 在试验结果成立的前提下,如果样品的PCR产物电泳后在400bp和264bp的位置上同时出现特 异性条带,判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株核酸检测双阳性;若400bp位置出现 特异条带而264p位置无特异条带,判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株核酸检测阳性;若 264bp位置出现特异条带而400bp位置无特异条带,判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株核酸检 测阳性
5.3阴性判定 在试验结果成立的前提下,如果400bp和264bp位置均未出现特异性条带,判定为猪繁殖与呼吸 综合征病毒高致病性与经典毒株核酸检测阴性
GB/27517一2011 附录 规范性附录 试剂的配制 A.1拭子悬液 在0.01mol/儿LPEBS液中添加以上所有的抗生素,浓度提高5倍;加人抗生素后调pH值至7.27.4
A.2组织悬液 在0.01mol/1PHBS液中添加青霉素(2000IU/ml),链霉素(2mg/ml),庆大霉素(50pg/ml)和 制霉菌素(1000IU/mL)
A.3阿氏液 葡萄糖2.05g,柠檬酸钠0.8g,柠檬酸0.055g,氯化钠0.42g,加燕僧水至100ml,溶解后调 pH值至6.1,69kPa15min高压灭菌,4C保存备用
A.41×TAE核酸电泳缓冲液 Ti碱,24A.2g;冰乙酸,5.71ml.0.百mol/儿EDTA(plH8.0),10ml.;加蒸水至1o0mL使用时 用蒸僧水作50倍稀释,即为1×TAE核酸电泳缓冲液
A.50.01mo/L(pl7.2)的磷酸盐缓冲液(Ps) A.5.1A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液):NaH.POH.027.6g,先用适量蒸僧水溶解,最后用 蒸水稀释至1000mL A.5.2B液(0.2nmol/L磷酸氢二钠水溶液);Na,HPO7H.O53.6g,(或NaHPO12H.O71.6g或 Na,HPO,"2H.035.日g)先用适量蒸溜水溶解,最后用燕霜水稀释至1 l000ml
A.5.30.01mol/LPBS的配制:A液14mlL,B液36mL,加氯化钠(NaCI)8.5g,最后用蒸僧水稀释 至1000mL;121C,15min高压灭菌,4C保存备用
A.6DEPC处理水 用0.1%DEPC处理后的蒸憎水,经121C15nmin高压处理,用于溶解RNA
阳性对照 经Mare-145细胞传代培养的第8代PRRsV高致病性和经典毒株灭活细胞毒 阴性对照 Marc-145细胞液
GB/T27517一2011 附 录 B 资料性附录 鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合T-PCR方法所用引物 表B.1鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RI-PCR方法所用引物 引物名称 引物浓度 引物序列 扩增片段大小 PCR扩增上游引物P 5'-GGTTCGGAAGAAACTGTCGG3" 20pmol/Al P1/P3引物对扩增片段 400bp:; PCR扩增上游引物P2 5'-AGCAGGTGGAAGAAGCGAATC-3" 2Dpmol/山l P2/P3引物对扩增片段 PCR扩增共用下游引物P3 20pmmol/Al 5'-GAGCTGAGTATTTTGGGCGTG3" 264bp
GB/27517一2011 附 录 c 资料性附录 鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RI-PCR反应体系 组成说明及使用时注意事项 C1试剂盒组成 表C.1试剂盒组成 数 量 组成成分 反转录反应体系 20管(10AL/管) PCR反应体系 20管21l/管 阳性对照 500Al 阴性对照 5004l 6.5ml 裂解液 叙伤 2.5ml 4mL 异丙醉 75%乙醇 15ml DEPC处理水 2ml 50倍TAE电泳缓冲液 40mL 澳化乙锭溶液 40ML 上样缓冲液 120Al 石蜡油 1.5ml c.2说明 c.2.1反转录反应体系成分.MMLv5×Rationbufer(含Mg*).4l;2.5mml/LdNTP 4ALMMLv,0.5ALRNA酶抑制剂,0.5L;共用反转录引物(P3.,也是复合R共用下游引物 1Al;总体积10L 复合rCR反应体系成分10×PCR缓冲液(含Mg+),2.5pL;2.5mmol/LdNTP,2AL;P1. C.2.2 0.5 5L;P2,0.5AL;P3，lpL.;ExTuqDNA聚合酶,0.5L.(2.5U)灭菌双燕水,l4.0L;总体积为 21 AL0 裂解液的主要成分是TriZol,为RNA提取试剂,外观为粉红色.于4笔保存
反转录反应体系中含猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株共用反转录引物、反转录 酶及各种离子 C.2.5PCR反应体系中含猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株特异性引物对、ExTaq酶及 各种离子
GB/T27517一2011 C.3使用时的注意事项 C.3.1由于阳性样品中模板浓度相对较高,注意检测过程中不得交叉污染
C.3.2注意防止试剂盒组分受污染
试剂盒之间的成分勿混用
C.3.3请按照说明书要求分别在4C、-20C保存不同的试剂,试剂盒有效期为6个月
使用时在室 温下融化,暂放置于冰上,使用后立即放回
C.3.4反转录反应体系与PCR反应体系应避免反复冻融,在使用前应瞬时离心,以保证反应液集中 在管底
GB/T27517?2011 ? D ?? ??????RT-PCR?? 400bp 264bp M DNA?(DL.2000Marker); -PRRSV?????; PRRsV???; -PRRSV??; ?? ?D.1??????RT-PCR??
鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法GB/T27517-2011
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种单股正链RNA病毒，主要感染家猪。PRRSV的高致病性亚型（HP-PRRSV）是引起猪类产业重大损失的主要病原体之一，其临床表现与经典毒株明显不同。因此，及早鉴别PRRSV亚型对于猪类产业的防控至关重要。
GB/T27517-2011是一种适用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株的复合RT-PCR方法，该方法的基本原理是通过特异性引物和探针引导下的反转录聚合酶链式反应技术，扩增目的基因片段并进行检测。该方法包括两个步骤：第一步是筛选出高致病性亚型的特异引物和探针；第二步是通过特异性引物和探针识别和鉴定PRRSV亚型。
GB/T27517-2011方法的优点在于具有较高的灵敏度和特异性，能够同时鉴别经典毒株和高致病性亚型。此外，该方法操作简便、快速，可靠性高，适用于大规模实验室检测或野外样品快速检测。
总之，GB/T27517-2011方法为猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株的鉴别提供了可靠、快速和有效的手段，对于保障猪类产业安全和健康发展具有重要意义。
