微束分析透射电子显微术植物病毒形态学的透射电子显微镜鉴定方法

微束分析透射电子显微术植物病毒形态学的透射电子显微镜鉴定方法

国家标准 GB/T35098一2018 微束分析透射电子显微术植物病毒 形态学的透射电子显微镜鉴定方法 Microheamanalysis一Iransmissioneleetronmicroscopy- Morphologicalidentificationmethodofplantviruses bytransmissionelectronmicroscopy 2018-05-14发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/T35098一2018 次 目 前言 引言 范围 规范性引用文件 术语和定义 基本原理 仪器设备、试剂和材料、环境条件 试样 透射电子显微镜鉴定步骤 植物病毒形态学鉴定结果的质量要求 鉴定报告发布 10除害处理 附录A(资料性附录)常用试剂的配方 附录B(资料性附录)植物病毒各科、属的形态学和细胞病理学特征 参考文献 15
GB/35098一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国微束分析标准化技术委员会(SAC/TC38)提出并归口 本标准起草单位:浙江大学、云南省农业科学院、浙江省农业科学院 本标准主要起草人:洪健、张仲凯、谢礼、吴建祥、钱亚娟、周雪平
GB/T35098一2018 引 言 植物病毒是一类侵染被子植物、裸子植物和蕨类植物的重要病原生物,在全世界范围内引起农作 物果树、花卉、牧草、药用植物的病害,造成产量和品质下降,严重影响人类的生产生活 2016年国际 ationalCommitteeforTaxonomyofViruses， 病毒分类委员会(Internat s,ICTV)公布的植物病毒涉及4个 目,26个科、5个亚科、l18个属,共有1323种 病毒形态学是病毒鉴定和分类的重要依据,根据病毒粒 子的形状、大小,有无包膜、衣壳的对称性、病毒在寄主体内的细胞病理学等特征,同时结合基因组序列 等分子生物学证据可以诊断鉴定病毒到科、属、种 由于植物病毒个体小至数十纳米,可借助透射电子 显微镜方能观察到其形态 为了规范植物病毒形态学检测的技术方法,正确指导植物病毒病原的诊断 和鉴定工作,有必要制定植物病毒透射电子显微镜形态学鉴定方法的国家标准
GB/35098一2018 微束分析透射电子显微术植物病毒 形态学的透射电子显微镜鉴定方法 范围 本标准规定了使用透射电子显微镜对植物病毒进行形态学观察和鉴定的步骤、质量要求及鉴定报 告的发布 本标准适用于各种类型透射电镜对植物病毒形态的观察和鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 SN/T2964植物病毒检测规范 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 virs 病毒 由核酸和蛋白质外壳组成且具有侵染活性并能够在细胞内自我复制的病原生物 3.2 irion 病毒粒子 成熟的或结构完整、有感染性的病毒个体 3.3 衣壳eapsid 由集合的蛋白质亚单位组成并包围核酸基因组的对称蛋白质外壳 3.4 nucleocapsid 核衣壳 由包围病毒核酸的蛋白质衣壳与核股形成的组合体 3.5 内含体 inclusiob0dy 病毒侵染后在寄主细胞中产生的由病毒或者细胞组分共同构成的异常结构 注在光学显微镜或透射电镜下内含体显示不同的形态特征 3.6 抗原 antigen 能刺激动物机体产生抗体和致敏淋巴细胞并能与之发生特异性免疫结合反应的物质
GB/T35098一2018 3.7 抗体antibody 动物机体受到抗原刺激而产生的能与相应抗原发生特异性免疫结合反应的免疫球蛋白 3.8 negativestain 负染色 采用高密度的重金属盐染色液提高试样颗粒背景电子密度的染色方法 3.9 免疫电子显微术 immun0electronmicroscopy 利用抗原与抗体特异性结合的原理在超微结构水平上定位、定性及半定量显示抗原的技术方法 3.10 超薄切片ultrathinseetion 100 采用超薄切片机切成的厚度为50nm一 nm的生物试样薄片 基本原理 4.1负染色技术原理:采用高密度的重金属盐染色液(如磷鸽酸、醋酸铀等)包围低密度的试样颗粒,使 试样周围的电子密度得到增强,在透射电镜下显示暗背景衬托的浅色试样形态及微细结构,图像呈现负 反差 该方法直接对病毒悬液试样进行负染色,操作简便分辨率高,可用于病毒快速诊断 4.2免疫电子显微术原理;免疫电子显微术分为免疫复合物电镜技术和免疫标记技术两大类 免疫复 合物电镜技术是对电镜载网上形成的抗原抗体免疫反应复合物进行负染色后直接电镜观察,其中免疫 吸附法具有富集病毒的作用,免疫修饰法具有血清学相关性识别的作用,适用于病毒快速诊断 免疫标 记技术是以抗体连接标记物如胶体金)作为探针,对细胞表面或细胞内部的相应抗原进行定位、定性及 半定量测定 4.3超薄切片技术原理;将经过固定的生物试样包埋在树脂介质中,采用超薄切片机将固化的试样包 埋块切成厚度为50nm一100nm的薄片,供透射电镜观察用 5 仪器设备、试剂和材料、环境条件 5.1仪器设备 5.1.1透射电子显微镜 5.1.2超薄切片机 5.1.3玻璃制刀机 5.1.4超薄切片钻石刀或玻璃刀 5.1.5高迷离心机 5.1.6正置光学显微镜 5.1.7研钵 5.1.8微型研磨器 5.1.9涡旋振荡仪 5.1.10辉光放电仪 5.1.11移液器(20L.200L) 5.2试剂和材料 5.2.1磷酸二氢钠(分析纯.
GB/35098一2018 5.2.2磷酸氢二钠(分析纯). 5.2.3戊二醛(分析纯. 5.2.4四氧化饿(结晶体 5.2.5丙酮(分析纯 5.2.6乙醇(分析纯 5.2.7 环氧树脂包埋剂 5.2.8醋酸双氧铀(分析纯 5.2.9柠檬酸铅(分析纯. 5.2.10磷钨酸(分析纯 5.2.11钼酸铵(分析纯 5.2.12亚甲基蓝 5.2.13病毒多克隆抗体 5.2.14PCR检测离心管(0.5mL,1.5mL) 5.2.15封口膜 5.2.16包埋管 5.2.17硅胶包埋板 5.2.18 覆For r膜的电镜载网 rmVar 5.3环境条件 超薄切片机、透射电镜应安装在独立的房间内，工作环境应符合以下要求 超薄切片机相对湿度小于60%,温度(20士5),电源电压(220士22)V,电源频率(50士 a 1)Hz,满足防震要求 透射电镜;相对湿度小于60%,温度20士5C,电源电压(220士22)V,电源频率(50士 b Hz,具备仪器专用地线,接地电阻值参照仪器说明书的要求 o 试样 6.1试样来源 6.1.1分离提纯的植物病毒悬浮液 6.1.2人工接种病毒的鉴别寄主和繁殖寄主植物 6.1.3田间受植物病毒侵染的叶、茎、花、根等新鲜材料 6.1.4植物种子,球茎,苗木等繁殖材料 6.1.5植物组织培养苗 6.2取样要求 田间作物和人工接种植物的取样及试样处理按照sN/T2964的规定执行 6.2.1 6.2.2进出境植物检疫的取样按照sN/T2122的规定执行 6.3试样预处理 6.3.1组织粗汁液试样;将呈现明显感病症状或者隐症的植物组织以1只加2nmL的比例加人 0.05mol/L磷酸缓冲液(pH值7.0),在研钵中研磨,过滤或离心后获得粗汁液 小片组织可用微型研 磨器研磨,或者用手挤出组织汁液,或者压破叶表皮获得组织汁液 种子剥皮去仁后,将种皮于液氮中 研磨制备组织粗汁液,也可以在适当温度和光照条件下使其发芽后再制备获取组织粗汁液 磷酸缓冲
GB/T35098一2018 液的配制参见附录A 6.3.2提纯病毒试样;将分离提纯的病毒用双蒸僧水或0.01mol/儿L的磷酸缓冲液(pH值7.0)稀释至 适合电镜观察的浓度 6.3.3超薄切片试样;采集呈现明显褪绿花叶症状的感病植物叶片,取病叶的退绿黄化边缘部位供超 薄切片前处理之用,不建议采用枯斑部位作为电镜试样 6.4电镜试样制备 6.4.1负染色试样制备 6.4.1.1负染色液的选择;根据植物病毒试样不同可采用2%20g/L)磷鸽酸(pH值6.7)或1% 10g/L)醋酸铀(pH值4.2),实验中需要同时具备这两种负染色液 对于具有囊膜的病毒样品,还可 以选用2%(20g/L.)钼酸铵(pH值7.0) 负染色液的配制参见附录A 常用负染色液有 2%(20g/L)磷钨酸水溶液(pH值6.7):适用于大多数植物病毒,但对一些不稳定的病毒具有 a 破坏作用,需先用1%一2%戊二醛或多聚甲醛进行固定,然后再进行负染色 1%(10g/L)醋酸铀水溶液(pH值4.2),对植物病毒的破坏作用较小,图像分辨率更好,但容 b 易与样品中的盐类及其他成分反应产生沉淀物,不适宜对高盐的提纯试样和新鲜病组织汁液 负染色 2%(20g/L)钼酸铵水溶液(pH值7.0);性能稳定,反差较弱,对病毒破坏作用小,尤其适合于 具有囊膜的病毒负染色 6.4.1.2载网的预处理;采用辉光放电法对覆For )rmvar 膜的电镜载网进行亲水化处理,使支持膜亲水 化,便于病毒粒子的均匀附着 6.4.1.3负染色操作方法有悬滴法和漂浮法,如下 悬滴法:用子夹持载网,用移液器吸取一滴病毒试样悬液(或组织粗汁液)滴在亲水化处理过 a 的电镜载网上,然后用小滤纸片从载网边缘吸去多余液体,待液体将要完全干燥之前,滴上负 染色液,染色1 ,用滤纸吸去多余负染色液,自然晾干后供透射电镜观察 min2min， b 漂浮法;在培养皿内或载玻片上铺上封口膜,用移液器吸取一滴病毒试样悬液(或组织粗汁液 滴在封口膜上,同时也将负染色液滴在封口膜上,将亲水化处理过的电镜载网倒扣在病毒悬液 滴上静置1min2min,然后夹起载网,用小滤纸片从载网边缘部吸去多余液体,待液体将要 完全干燥之前,将载网倒扣在负染液滴上,静置1min2min,夹起载网,用小滤纸片吸去多 余负染色液,自然晾干后供透射电镜观察 6.4.2免疫复合物电镜试样制备 6.4.2.1免疫吸附法 在培养皿内铺上封口膜,用移液器吸取一滴1:101:100倍稀释的病毒多克隆抗体并滴在 a 封口膜上;将电镜载网膜面朝下放置于抗体液滴上,室温下在培养皿中保湿15min. 用20滴0.05molL的磷酸缓冲液(pH值7.0)连续滴洗载网,洗除多余抗体 b 用小滤纸片吸掉余液后,将载网膜面朝下放置于病毒试样悬液(或组织粗汁液)液滴上,室温下 在培养皿中保湿反应30min(如果病毒含量低,反应时间可延长至数小时或过夜). d 反应结束后用20滴0.05mol/I的磷酸缓冲液,30滴双蒸僧水先后连续滴洗试样载网 min2min,用小 用小滤纸片吸除余液后,以2%(20g/L)磷钨酸(pH值6.7)进行负染色1 e 滤纸片吸去多余负染色液,自然晾干后供透射电镜观察 6.4.2.2 免疫修饰法: 在培养皿内铺上封口膜,用移液器吸取一滴1:10~1:100倍稀释的病毒抗体滴在封口膜上 a
GB/35098一2018 b)用电镜载网蘸取病毒试样悬液(或组织粗汁液),用数滴0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH值7.0) 滴洗载网,用小滤纸片吸掉余液后将电镜载网膜面朝下放置于抗体液滴上,盖上培养皿盖,室 温下保湿15min一30min. 反应结束后用20滴0.05mol/儿的磷酸缓冲液,30滴双蒸僧水先后连续滴洗试样载网 c d 用小滤纸片吸除余液后,以2%(20g/L)磷钨酸(pH值6.7)进行负染色1 nmin2min,用小 滤纸片吸去多余负染色液,自然晾干后供透射电镜观察 6.4.2.3免疫吸附-修饰法: 先按照6.4.2.1的步骤a),b),e)进行免疫吸附反应 a b 反应结束后用20滴0.05mol/儿的磷酸缓冲液连续滴洗试样载网 min30min 用小滤纸片吸除余液后将载网膜面朝下放置于抗体液滴上,在培养皿中保湿15m c d)按照6.4.2.2的步骤c),d)进行滴洗和负染色,自然脉干后供透射电镜观察 6.4.3超薄切片试样制备 6.4.3.1前固定;将感染病毒的植物组织切成1mm×1mm×3mm的小块,置于0.lmol/I磷酸缓冲 液(p值7.0一7.2)配制的2% 3%体积分数)戊二醛固定液进行前固定,在4C下固定2h 戊二醛 固定液的配制参见附录A 6.4.3.2漂洗;用0.1mol/儿磷酸缓冲液(pH值7.0一7.2)亢分漂洗3次,每次10min一15min. 6.4.3.3后固定;经过漂洗后的试样置于0.1mol/儿磷酸缓冲液(pH值7.0一7.2)配制的1%(10g/L) 四氧化锻固定液中,在4C下固定1h一2h;再用相同缓冲液充分漂洗3次,每次10min一15min 四 氧化俄固定液的配制参见附录A 6.43.4脱水;采用50%、70%、80%,90%、95%、100%(体积分数)的乙醇进行梯度脱水,各级浓度乙 醇脱水时间为10min~15min 然后用纯丙酮脱水2次,每次30nmin 6.4.3.5浸透与包埋;试样在室温下脱水后放置于丙啊:包埋剂(1:1,体积分数)渗透液中浸透1h,然 后在丙酮:包埋剂(1:3,体积分数)渗透液中浸透3h,之后在纯包埋剂中浸透12h以上 用包埋管、 胶囊或硅胶包埋板进行试样包埋 推荐采用spurr'低黏度包埋剂、Epon812或其他包埋剂 Spurr'低 黏度包埋剂和Epon812包埋剂的配制参见附录A 6.4.3.6聚合;包埋后的试样在包埋聚合器或恒温烘箱内进行加温聚合 6.4.3.7修块;聚合后的包埋块修成易于超薄切片的形状 6.4.3.8定位;包埋块在超薄切片机上用玻璃刀进行半薄切片,切片厚度为0.5m~1Am,经1% 10g/L)亚甲基蓝染色后在正置光学显微镜下进行病变细胞定位 6.4.3.9超薄切片;经修块和定位后的包埋块在超薄切片机上用玻璃刀或钻石刀切成超薄切片,切片厚 度50nm100nm,用电镜专用载网捞取超薄切片 6.4.3.10染色;采用2%(20g/L)醋酸铀乙醇溶液和柠檬酸铅在室温下对超薄切片进行双重染色,醋 酸铀染色时间15min30min,柠檬酸铅染色时间5min10min,干燥后待检 超薄切片染色液的配 制参见附录A 透射电子显微镜鉴定步骤 7.1按照透射电镜操作程序开机,抽真空至正常工作状态,调整仪器至最佳工作状态 7.2推荐加速电压范围:60kV80kV 7.3推荐放大倍率范围:4000倍100000倍 7.4病毒负染色试样的透射电镜观察;先在低倍率(4000倍左右)下选择负染色剂着色的电子密度较 大斑点或斑块,观察样品全貌 逐步提高放大倍率,寻找具有典型形态特征的病毒粒子,图像精细聚焦
GB/T35098一2018 后用cCD相机记录并储存(或者用电子底片进行照相) 植物病毒各科、属的病毒形态学特征参见 附录B及相关文献 7.5感病试样超薄切片的透射电镜观察:先在低倍率模式50倍1000倍)寻找切片,切换到正常放 大模式观察病变的细胞 逐步提高放大倍率,仔细观察病毒粒子在细胞内的分布状况,是否产生特殊的 内含体,细胞超微结构以及各种细胞器是否异常 细胞图像精确聚焦后用cCD相机记录并储存(或者 用电子底片进行照相) 植物病毒各科、属的细胞病理学特征参见附录B及相关文献 8 植物病毒形态学鉴定结果的质量要求 8.1负染色的电镜图片要求反差适中,病毒粒子分布均匀,形态清晰,表面细节可辨认 超薄切片的电 镜图片要求反差适中,层次分明,细胞超微结构清晰,细胞膜结构和病毒粒子清晰可辨 8.2植物病毒形态鉴定电镜图片应包括 磷钨酸和醋酸铀两种染色液负染色的病毒粒子形态; a b 寄主细胞内病毒粒子的分布状态 c 内含体的形态结构; 细胞和细胞器的超微结构变化 d 图片应具有标尺,用于测量病毒粒子的直径或/和长度 鉴定报告发布 9.1鉴定报告应包括以下信息,亦可参照GB/T27025一2008 报告的唯一编号; a 试样名称; b 送样人姓名、单位和地址; c 试样的接收日期; d 鉴定仪器及其工作条件; e 鉴定结果和必要的说明; 鉴定人签字; g 鉴定报告负责人的签字; h 鉴定报告的页码 发布鉴定报告的实验室名称和地址 k鉴定报告的日期 9.2原始记录应包括试样来源、试样接收日期、编号、电镜观察条件、图片或底片的编号、标尺或准确的 放大倍数 10 除害处理 对于列人《进境植物检疫性有害生物名录》的植物病毒,在检测过程中使用的有关 材料和用具,当使用完毕后应进行消毒和除害处理 种子试样应保存在4冰箱内,叶片和果实试样应 保存在一20C以下冰箱或冻干保存3个月备查,保存期满后进行灭活处理,以防病毒扩散
GB/35098?2018 ? A ?? ?? ??? A.1 A.1.10.2mol/L??? A?0.2mol/L?? 27.60 NaHPOH,O g NaHPO2H.O 31.21g ??1000ml,? B?0.2mol!/L?? 35.61 Na.HPo2H.o g NaHPO12H.O 71.64g ??1000mL,? A.1.20.1mol/L?? A.1?A?B?,0.2mol/L???,1??? ?0.1mol/L???????????? A.1?pH????? pH? 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 A? 73.5 62.5 51.0 39.0 28.0 19.0 13.0 8.50 B? 49.0 26.5 37.5 61.0 72.0 81.0 87.0 91.5 ??? A.2.1??? A.2. A.20.1mol/L??????? 50 50 0.2mol/1??/mL 50 50 50 50 50 12 25%???/ml 10 16 20 ??/ml 100 100 100 100 100 100 100 1.0% 1.,5% 2.0% 2.5% 3.,0% 4.0% 5.,0% ?? lll A.2.2??? 2%20g/L)?,1%(10g/L)??,
GB/T35098一2018 2%(20g/L)四氧化俄贮存液 a 将装有四氧化俄的安(共0.5g)清洗干净,用玻璃划割器在上面刻痕,再用双蒸僧水冲洗几次,放 人洁净棕色广口玻璃瓶内,加上25mL.双蒸儡水,用洁净玻璃棒捣破安瓶 然后用石蜡将广口玻璃瓶 严密封口,贴上标签,置于干燥器中,4下避光保存 b0.1mol/儿磷酸缓冲液配制的1%10g/L)四氧化俄固定液 取等量的0.2mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)与2%(20g/L)四氧化俄贮存液混合,现配现用 A.3包埋剂配方 A.3.1环氧树脂Spurr'低黏度包埋剂 环氧树脂spur'低黏度包埋剂配制表见表A.3 表A.3环氧树脂Spurr'低黏度包埋剂配制表 配方 标准 偏硬性 硬性 软性 快速聚合 缓慢聚合 ERL-4206 0.0g 10.0g 10.0g 10.0g 10,0g 10,0g ERI-4221 DER-736 6,0g 5,0g 4.0g 7.0g 6,0g 6.0g NSA 26.,0g 26.,0g 26,0g 26.0g 26,0g 26,0g DMAE 0.4ml. 0,4ml 0.4ml 0,4ml 1,0ml 0.2ml 聚合时间70C/h 混合时间/d 注1:按上述比例将前3种成分混合均匀,再加DMAE催化剂搅拌 配好的包埋剂在低温和防潮状态下可保存数 月 此包埋剂需用包埋管包埋,聚合时需加盖,以免包埋块发脆 在70C温度下聚合8h即可完全聚合 此 包埋剂不易受溯 注2:ERL-4206(Vinylcyclohexenedioxide),黏度低,聚合块硬度大 目前ERL-4206停产后由ERL-4221替代,它 的黏度稍大于ERI-4206 使用ERL-4221时,适当增加DER-736的比例可以得到硬度适中的包埋块 DER7(Dulsetdl letherofpolypropyleneglycol),属于脂肪族,有低黏度性质,可调节包埋块的硬度 NSA(Nonenylsuceinicanhydride),硬化剂,避免暴露在潮湿的大气中 DMAE(2-Dimethyaminoethanol),催化剂,增加催化剂的比例,可以缩短聚合时间 A.3.2环氧树脂Epon812包埋剂 环氧树脂Epon812包埋剂配制表见表A.4 表A.4环氧树脂Epon812包埋剂配制表 总量 10ml 20ml 30ml 40ml 50ml Epon812 5g 10g 15g 20g 25g DDSA 2.2 5.58 1.lg 2g 3.3g 4.48 MNA 3.9g 7.8g 19.5 1.7 5.6 g 8 g DMP30 0,15tml 0.30mL 0.45ml 0.60mL 0.75ml 注1，按上述比例配好各成分,充分搅拌30min,驱除气泡 包埋样品分别在37C,45c,60它下聚合12h,12h、 h或直接在60C温度下聚合48h 此包埋剂易受溯,可以在干燥器中保存聚合后的样品包埋块 24
GB/35098一2018 注2:Epon812是环氧树脂单体 DDSA(D Ddecenylsueeinie.anhydrde)十二婉基琥珀酸肝，一种可得到软性包埋块的长链脂肪族分子 MNA(Methylnadicanhydride)甲基内次甲基二甲酸酥,又称六甲酸酥,有两个链环,能获得较硬的包埋块 DMP3o[2,4,6-Tr(dimethylatminomethyl)phenol]2,4,6-三(二甲基氨基甲基)苯酚,能加速固化过程 A.4超薄切片染色液配方 醋酸铀染色液.称取1.0g醋酸铺,用50mL50%(体积分数)的乙醇配制成2%(20g/L)醋酸铀 A.4.1 乙醇溶液,呈淡黄色,室温下避光保存 柠檬酸铅染色液;称取硝酸铅1.33g、柠檬酸三钠1.76g,放人50mL容量瓶中,加人预先煮沸 A.4.2 过的双蒸僧水30mL.,混合后摇荡30min,混悬液呈乳白色,加1mol/LNaOH溶液8mL后混悬液逐 渐变澄清,pH值为12,再加双蒸水定容至50mL,封闭瓶口 A.5负染色液配方 A.5.12"%(20/L)磷钨酸负染色液 称取1.0g磷鸽酸,用50mL.双蒸憎水配制成2%(20g/L)的水溶液,用1nmol/LNaOH调pH值 至6.7一6.8,过滤后4C下保存备用 A.5.21%(10/L)醋酸铀负染色液 低盐的病毒提纯试样也可用1%(10g/L)醋酸铀水溶液进行负染色.具有更高的图像分辨率 称 取0.5只醋酸铀,用50mL双蒸馏水配制成醋酸铀负染色液,呈淡黄色,pH值4.2,室温下避光保存 备用 A.5.32%(20/L)钼酸铵负染色液 称取1.0g钼酸铵,用50mL双蒸馏水配制成2%20g/L)的水溶液,用乙酸铵调pH值至7.0~ 7.,2,过滤后4C下保存备用
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GB/35098一2018 参 考文献 [1]GB/T27025一2008检测和校准实验室能力的通用要求(IsO/IEC17025;2005,IDT) [2]sN/T1840一20o6植物病毒免疫电镜检测方法 [3]农业部,国家质量监督检验检疫总局 进境植物检疫性有害 生物名录.2007 [4]洪健,李德薛,周雪平 植物病毒分类图谱 北京,科学出版社 2001,1275 [可]张伸凯,李毅 云南植物病毒 北京.科学出版社.2001，11!s [G]张景强,李绳鹏,朱平,洪健等 病毒的电子显微学研究 北京,科学出版社.2011，1-134 [7]洪健，周雪平 IcTV第九次报告以来的植物病毒分类系统 植物病理学报 2014 44(6) 566-572 洪健，周雪平 IcTV第八次报告中的植物病毒最新分类系统 植物病理学报 2005,(6) [[8] ZK):1-9 [91 KimgAMQ，AdamsMIJ,CarstensEB,etal.VirusTaxonomy:NinthReporofthelInterna tionalCommitteeonTaxonomyofViruses.SanDiego，ElsevierAcademicPress 2012，1-1327 101AdamsMJ，KingAMQ，CarstensEB.RatificationvoteontaxonomicproposalstotheIn- ternationalCommitteeonTaxonomyofVirusesArchVirol.2013，158:2023-2030 AdammsMJ，lefkowitzEJ，King etal. voteontaxonomicproposalsto Viruses Arch 2014，159:2831-2841 theInternationalCommmitteeonTaxonommy 12 AdamsMU，lefkowitzE King etal.Ratificationvoteontaxonomicproposalsto theInternationalCommitteeon Viruses，ArchVirol.2015，l60:1837-1850 Taxonomy [13]AdamsMJ，LeflkowitzE，KingAM，etal.Ratifieationvoteontaxonomicproposalsto thelnternationalCommitteeonTaxonomyofViruses ArehVirol，2016，161:2921-2949

微束分析透射电子显微术在植物病毒形态学中的应用

植物病毒是影响植物生长、产量和品质的主要病因之一，因此对于植物病毒的研究具有重要意义。在植物病毒的研究过程中，透射电子显微镜技术被广泛应用来确定病毒粒子的形态和结构。

在传统的透射电子显微镜技术中，由于样品中的病毒数量很少，因此需要大量的样品制备和高分辨率的成像设备。然而，微束分析透射电子显微术通过使用大电流密度的电子束，可以在短时间内快速地成像大量病毒颗粒，从而提高了样品制备的效率和成像的质量。

除了成像效率和质量之外，微束分析透射电子显微术还能够提供更多的信息，例如病毒颗粒的三维结构、元素组成等。这些信息对于研究病毒的形态学、生命周期和致病机理等方面都具有重要价值。

GB/T35098-2018《植物病毒形态学的透射电子显微镜鉴定方法》为微束分析透射电子显微术提供了一套标准化的操作流程和技术指南。该标准规定了样品采集、制备、成像和数据分析等方面的具体要求，旨在确保实验结果的可重复性和准确性。

总之，微束分析透射电子显微术是一种高效、高精度的电子显微镜技术，在植物病毒形态学研究中具有重要应用价值。通过GB/T35098-2018的规范化操作，可以进一步提高实验结果的准确性和可靠性。

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