蜜蜂白垩病诊断技术

国家标准 GB/T35908一2018 蜜蜂白垩病诊断技术 Diagnostietechniquesforehalkbroodofhoneybees 2018-02-06发布 2018-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
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GB/35908一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口 本标准起草单位:福建出人境检验检疫局、吉林出人境检验检疫 局、福建农林大学,福建赛福食品检测研究所有限公司 本标准主要起草人:郑腾、张体银、宋战胸、黄少康、李宋钰、张志灯、陈日春、王武军、白泉阳、 林素洁
GB/35908一2018 蜜蜂白垩病诊断技术 范围 本标准规定了蜜蜂白垩病的诊断技术 本标准适用于蜜蜂白垩病诊断和病原检测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 缩略语 下列缩略语适用于本文件 EB澳化乙锭(Ethidiumbromide) PCR;聚合酶链式反应(Polymmerasechainreaction SDS:十二烧基硫酸钠(Sodiumdodecylsulfate) 试剂和材料 4.1水 本标准所用水应符合GB/T6682中一级水的规格要求 4.2固定液、染色液和培养基 乳酸苯酚固定液(配方见附录A中的A.1)、乳酸棉蓝染色液(配方见A.2)、病原菌分离培养基(配 方见A.3) 4.3PCR检测方法试剂 亚精胺-SDS缓冲液(配方见附录B中的B.1)饱和酚、氯仿、3nmol/L的醋酸钠pH5.5)(配方见B2)、 TE缓冲液(配方见B.3),0.5×TBE缓冲液(配方见B.4)、上样缓冲液(配方见B.5)、1.5%琼脂糖凝胶 配方见B.6)、TaqDNA聚合酶(5U/L),10×PCR缓冲液、dNTPMix(10mmol/L. 引物序列及对照样品 4.4 上游引物(F):5'-TGTCTGTGCGGCTAGGTG3' 下游引物(R)5'-GAwCACGACGCCGTCACT-3';扩增产物为442bp 蜜蜂蜂球囊菌阳性对照,由指定单位提供或合成含有阳性片段的质粒 蜜蜂蜂球囊菌阴性对照,可以选用健康且无白平病临床症状的幼虫作为阴性对照
GB/T35908一2018 5 仪器设备 5.1光学显微镜 5.2恒温培养箱(35C士1C) 5.3A2型二级生物安全柜 5.4冰箱(2C8C和一20C) 5.5PCR仪 5.6电泳仪 5.7冷冻离心机 5.8凝胶成像系统 6 临床诊断 6.1流行病学 西方蜜蜂的幼虫易患蜜蜂白垩病,病虫和病菌污染的饲料、蜂具是主要的传染源 丝和抱子均具 有侵染性,它们可由成年蜂或蜂蜻体表携带并在蜂群内或蜂群间传插 白垩病主要引起老熟幼虫和封 盖幼虫死亡,3日龄一4日龄雄蜂幼虫和4日龄 食一 日龄工蜂幼虫最易感染白整啊,鲜场内蜂群的发精 率可达10%一50%,幼虫感染率为5%40%,成年蜂虽不易感染,但是病原的携带者和传播者 白驯 病的发生有明显的季节性,多发生在春夏的6月一8月高温、高湿季节 凡是日照长、地势高燥的地方 白垩病发病率低，一般为3%一5%,或根本不发病;而气温高、湿度大、光照不足的地方,白垩病危害 严重 6.2箱外观察 患病蜂群的巢门口可见被工蜂拖出的幼虫干尸,质硬,有的干尸呈苍白色,似葵花仁状,表面有一层 绒毛膜,掰开幼虫干尸可见内心为浅棕色;有的干尸为部分或全部黑色,似西瓜子状,表面有一层黑色颗 粒状物质 参见附录C) 6.3开箱检查 从患病蜂群中提出封盖子脾,在已封盖的部分有呈星点式分布被工蜂咬开的巢房,可见内有向一侧 贴壁的幼虫干尸,形态完整,质地柔韧,无光泽,无臭味,用锻子取出后,可见有的为白色有的为部分或 全部黑色 健康的蜜蜂幼虫是呈有光泽,珍珠样外观 参见附录D) 6.4结果判定 结合该病的流行特点,若蜂群出现6.1和6.2的典型症状,即可判定为临床诊断阳性 实验室诊断 7.1采样 根据临床诊断结果,选择疑似感染的蜂群采集蜜蜂幼虫样品 采样时,应尽量无菌采集变色或死亡 幼虫,样品保存于2C8C的条件下,24h内送实验室检测
GB/35908一2018 7.2镜检法 7.2.1处理方法 取虫尸样品于无菌培养皿中,用无菌解剖刀刮取样品表面物质置于干净的载玻片上,加1滴一2滴 水或乳酸苯酚固定液,在显微镜下观察,可见呈白色的似棉花般的菌丝或黑色的含有抱子球的抱囊 也 可用乳酸棉蓝染色液进行染色,染色后菌丝呈蓝色(参见附录E) 7.2.2典型特征 镜检时,蜂球囊菌的子实体为特征性的鉴定部位,墨绿色的抱囊呈球形(参见附录E),自外向内有 3层结构;最外层为墨绿色的闭囊壳,其中包裹着许多球形的子囊,子囊无外膜,子囊中又有大量的椭圆 形的子囊袍子,不同子囊果中子囊的大小和数目也有不同参见附录E) 待子实体成熟后,子囊壁消 融,子囊抱子积聚成为抱子球,并被有外膜 子囊及带有抱子的子囊在该菌生长过程中很少见，一般待 袍囊成熟,子囊壁已不存在,所以显微镜下看见的抱囊内的球形袍子团只是袍子球,每个袍子球的大小 不一,内含的袍子数也不同 成熟的袍囊会自行破裂,释放出袍子(参见附录E) 蜂球囊菌有两个变 种,即大抱球囊霉和蜜蜂球囊霉,其区别在于成熟的燃养绸胞和抱囊、抱子大小不同,两变种同彼此不能 p，平均为Bm，泡子(m一孔恳nm) 99 杂交 蜜蜂球囊霉的袍囊直径通常为32mm" 1.5Am一2.34m);大抱球囊霉的抱囊直径一般为88.4Am~168.5m,平均128.4m,袍子比前者 大10% 7.2.3结果判定 根据镜检观察到的典型特征可判为疑似阳性 7.3分离培养 7.3.1培养方法 无菌操作条件下,将虫样剪成1mm×2mm的小方块,置于75%士5%的乙醇中消毒2min后接种 于病原菌分离培养基平板上,35C士1C下培养5d一7d,逐日检查菌丝生长和抱囊产生的情况,待抱 囊产生后挑取抱囊纯化至纯培养 7.3.2生长特性 在分离培养时,可见蜂球囊菌的菌落呈白色,较致密,中央凸起,菌落老化时颜色变成浅棕色至棕 色 菌丝多呈分支状，二叉分枝间距较大,菌丝体呈疏松的蛛网状 菌丝均匀具横嗝膜,直径为 2.5m一6.0m,菌丝细胞多核,雌性菌丝能长出有横隔壁隔离的藏卵器,雄性菌丝能形成体积很小的 呈纺锤形的藏精器,雌雄菌丝相交后几小时内即可形成黑色的抱子带,而同性菌丝相交处则没有黑色的 抱子带,有时两性菌丝混合长成一个菌落,往往成为不规则的黑色抱子带 7.3.3镜检 分别挑取少量的菌丝和子实体置于载玻片上,加1滴2滴无菌水或乳酸苯酚固定液,在400倍 600倍的显微镜下观察,可见树枝状分支的有隔菌丝和墨绿色抱囊,抱囊内含有许多大小不等的抱子 球,破裂的抱囊可释放出大量的子囊袍子(参见附录E) 7.3.4动物感染试验 试验应在严格的隔离设施中进行,并应符合GB19489中有关实验室的生物安全要求 将已分离
GB/T35908一2018 纯化的蜂球囊菌接种于病原菌分离培养基,35C士1C培养5d~7d,待抱囊发育成熟并释放出子囊抱 子时,用水将产生徊囊的菌丝制成菌悬液,菌悬液至少应含有2×10'个袍子/mL 选用无病群健康的 西方蜜蜂幼虫脾,以1日龄一2日龄健康的西方蜜蜂幼虫为试验对象.以水为对照液,分别给健康的幼 虫滴喂菌悬液和对照液,滴喂量为2l 蜜蜂幼虫经滴喂菌悬液后,第1天第3天无异常,感染幼虫与健康幼虫无明显区别;第4天起有 部分感染幼虫出现死亡,随后每天的死亡数量逐日增加;第6天一第7天时死亡量达到高峰;第10天左 右死亡幼虫体壁开始长出白色菌丝,开始呈苍白色,继而发展为暗灰色，继续发展变成僵硬的石灰质块 幼虫发病初期膨胀柔软,腹面出现菌丝,巢房壁上也粘有菌丝 至中期虫体布满菌丝,较初期萎缩 且逐渐硬僵化,形状似粉笔块,部分虫体有黑色子实体覆于体表 病至末期,部分虫体被成年工蜂拖出 巢房,散布于箱底、箱门口或蜂箱前地面 留有白垩病幼虫尸的巢房口被一层白色或淡黄色的菌丝 封闭 S 结果判定 7.3.5 依据病原在分离培养过程中的生长特性以及镜检结果进行判定,与7.3.2和7.3.3的结果相符的可 判为阳性,必要时可以进行动物感染试验 7.4CR检测 7.4.1病原培养 培养方法同7.3.1 7.4.2DNA抽提 取0.5g一2.0g纯化好的新鲜或者冷冻的菌丝体放人灭菌研钵中,加人液氮充分研磨,将研磨好的 菌丝粉转移到装有15mL亚精胺-SDS缓冲液的试管中,充分振荡20min后,用等体积的饱和酚进行抽 提,重复抽提1次 取水相用等体积的氧仿进行萃取,再取水相加人1/10水相体积的3moL/L的醋酸 钠(pH5.5)和2倍水相体积预冷的无水乙醇,颠倒混匀,4C下10000离心10min;弃上清,沉淀用预 冷的70%乙醇清洗,4C下10000g离心10min,弃上清,沉淀干燥后加1mlTE缓冲液溶解,-20C 保存备用 本步骤也可采用等效DNA提取试剂及方法 7.4.3PCR扩增 按下列方法配制25L的PCR扩增反应体系 10×PCR缓冲液 2.5l 10mmol/IdNTPMix 0.5AI TunNA聚合鹏GU/L 0.5Al 上游引物F(10mmol/IL AL 下游引物R(10mmol/L) 1Al DNA模板 1"l 水 18.5!l 反应程序;94预变性10min;94C45s,60C45s,72C60s,运行30个循环;72101 m1n; 4笔保存 以水作为空白对照,同时设阳性对照和阴性对照 7.44CR产物的检测 制备1.5%的琼脂糖凝胶,取扩增产物、阳性对照、阴性对照和空白对照各10AL进行电泳,恒压
GB/35908一2018 5V/cm8V/cm,电泳301 min~60min;紫外检测仪下观察结果 7.4.5试验成立的条件 蜜蜂蜂球囊菌PCR标准阳性对照出现一条约442bp的特异DNA条带,标准阴性对照和空白对照 没有任何核酸条带,说明试验成立 7.4.6结果判定 待检样品PCR扩增产物经电泳出现约442bp的DNA条带,可以初步判为蜜蜂蜂球囊菌核酸阳性 参见附录F) 确证时需对PCR扩增产物进行测序,与参考序列(参见附录G)进行比对 综合判定 凡具有第6章的临床症状,并满足7.2和7.3,或满足7.4均可判为蜜蜂白垩病
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GB/35908一2018 附录B 规范性附录 PCR检测方法试剂的配方 B.1亚精胺-SDs缓冲液的制备 B.1.11mol/ITris-HCIpH8.0)50mL的配制 Tris碱6.06g,加水40mL溶解,滴加浓HCl约2.1mL调pH至8.0,定容至50ml B.1.20.5mol/1DTAp8.0)50ml的配制 称取EDTA-Na2H.,O9.306g,加水35mL,剧烈搅拌,用约1gNaOH颗粒调pH至8.0,定容 至50mL B.1.31mol/L卜-疏基乙醇100mL的配制 2-疏基乙醇原液 6.5mL 水 93.5ml B.1.4亚精胺-SDs缓冲液(4mol/L亚精胺;10mol/LEDIA;0.1mol/LNaC;0.5%sSDS;10mol/L 静-疏基乙醇;10mmmo/LIiis-HClpH8.0)的配制 亚精胺 1.02 g NaCl 5.85 g SDS 5g mol/LTris-HCl(pH8.0) 10ml 0.5molLEDTA(pH8.0) 20ml lmol!/I8筑基乙醇 10ml 加水调整体积至1000mL B.23mol/L醋酸钠(pH5.5)的制备 NaAc3H.O 40.8g 水 40ml 搅拌溶解,加人冰醋酸调节pH值至5.5,加水定容至100ml B.3IE缓冲液的制备 B.3.11mol/LTris-HCIpH8.0)50ml的配制 Tris碱 6.06g 40mL 水 浒解后滴加浓Hcl约2.1mL调pH至&.0,加水定容至50mL.
GB/T35908一2018 B.3.20.5mol/LEDTApH8.0)50mL的配制 称取EDTA-Na22H.09.306g,加水35mL,剧烈搅拌,用约1gNaOH调pH至8.0,加水定容 至50mL B.3.31×TE(10mmol/LIris-HCI,pH8.0;1 o山/LEDTA，pH8.0)的配制 m1o mol/LTris-HCl(pH8.0 mL 0.2mL 0.5mol/LEDTApH8.0) 加水定容至100ml B.40.5×TBE缓冲液制备 按以下过程配制相关溶液 先按以下要求配制5×TBE缓冲液 a 54 Tri碱 g 27.5 棚酸 g 20ml 0.5mol/LEDTApH8.0) 加水定容至1000mL b)再使用5×TBE缓冲液配制0.5×TBE缓冲液 取5×TBE缓冲液100ml,加水定容至1000ml B.5 上样缓冲液制备 蓝 0.25g 蔗糖 40g 加水定容至100ml B.61.5%琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖 0.75g 0.5×TBE缓冲液 50ml 加热溶解,冷却到50C一60C左右时加人5L的EB(也可用其他核酸染料),倒人胶槽内自然 凝固
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GB/35908一2018 附录 F 资料性附录 蜂球囊菌PCR产物电泳图 蜂球囊菌PCR产物电泳图见图F.1 500bp 442bp 400bp 说明 -空白对照; 2 -DNAMarker -阳性对照; -阴性对照; -样品 图F.1rPCR产物电泳图 13
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蜜蜂白垩病诊断技术GB/T35908-2018

什么是蜜蜂白垩病？

蜜蜂白垩病是由真菌感染引起的一种疾病，它主要侵犯蜜蜂的肠道系统和呼吸系统。受感染的蜜蜂会出现行动迟缓、飞行困难、体力下降等症状，导致整个蜜蜂群体的生产力和养殖效益降低。

GB/T35908-2018《蜜蜂白垩病诊断技术》介绍

GB/T35908-2018是由国家质量监督检验检疫总局和中国标准化协会联合发布的标准，它规定了蜜蜂白垩病的诊断方法和技术要求。该标准的发布，为科学严谨地进行蜜蜂白垩病的诊断和治疗提供了重要的参考。

GB/T35908-2018标准内容

GB/T35908-2018标准主要包括以下内容：

1. 术语和定义
2. 诊断方法
3. 采样方法
4. 检测方法
5. 结果判定
6. 报告形式
7. 仪器设备和试剂
8. 检测质量保证和控制
9. 实验室管理

其中，诊断方法中包括了蜜蜂群体的观察、取样、检测等步骤；结果判定包括了判断蜜蜂白垩病的感染程度等内容。

GB/T35908-2018标准的意义

GB/T35908-2018的发布，为蜜蜂养殖业提供了重要的技术支持，它可以帮助养殖人员快速、准确地诊断和治疗蜜蜂白垩病。同时，该标准也为相关科研机构开展蜜蜂白垩病防治方面的研究提供了技术规范和参考依据。

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2022/8/20 16:50:32 现行

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