畜禽体细胞库检测技术规程

畜禽体细胞库检测技术规程

国家标准 GB/T24862一2010 畜禽体细胞库检测技术规程 Techniealregulationoffarmanimalssomaticcellbankdetection 2010-06-30发布 2011-01-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T24862一2010 前 言 本标准的附录A为资料性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口 本标准起草单位:农业科学院北京畜牧兽医研究所 本标准主要起草人:马月辉,关伟军、李向臣、于太永、李啥、何晓红、刘涛
GB/T24862一2010 畜禽体细胞库检测技术规程 范围 本标准规定了畜禽体细胞库检测方法 本标准适用于猪、牛、羊、马、驴,鸡、鸭、鹅等畜禽体外培养细胞鉴定 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 (GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 细胞活率cellmotilityrate 活细胞占总细胞的百分比 3.2 细胞生长曲线eelgrowthcurve 在一代细胞生存期内,依据潜伏期,指数增长期、停滞期和衰亡期细胞动态变化的数值,以细胞培养 时间为横坐标、细胞密度为纵坐标而绘制的细胞生长规律曲线 3.3 核型karyotype 体细胞分裂中期整套染色体按照其数目、长度、着丝点位置、随体、主缢痕和次缢痕等相对恒定特征 排列起来的图像 3.4 同工酶iswzyme 功能相同结构各异的一类催化酶 3.5 汇合度conueney 细胞占其培养表面的比例 工作区条件 工作区一般要由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室组成 其中,缓冲间面积应不小于3m,并设有更衣柜和紫外灯,紫外灯的强度不少于1.5w/m 紫外线灯 nmin30 管距地面不应超过2.5m,每次照射时间为201 nin 无菌室无菌等级的最低标准应达到万级 主要仪器、设备 电泳仪及电泳槽、超净工作台,冰箱、鼓风干燥箱、高压蒸汽消毒器,液氮生物容器、离心机、电子天 平、恒温培养箱、CO培养箱、超纯水装置、凝胶自动成像分析系统和显微镜等
GB/T24862一2010 清洗与消毒 6 玻璃器皿清洗与消毒 6.1.1浸泡 所需的玻璃器皿在含有洗涤剂的清水中浸泡12h 6.1.2刷洗 选软毛毛刷,反复洗刷后用清水冲洗3次，三蒸水冲洗3次后,60C下烘干后备用 6.1.3酸浸 酸浸时间为24h 6.1.4冲洗 酸浸后先用自来水反复冲洗10次以上,最后用重蒸水浸洗3次5次,烘干包装 6.1.5消毒 高压灭菌应以0.14MPa0.16MPa的压力下持续15min30min 6.1.6初次玻璃器皿使用 初次使用玻璃器皿需要先经过浸泡和洗刷再置于5%稀盐酸溶液中浸泡12h以上,其余操作同 6.1.3、6.1.4和6.1.5等步骤 金属器皿清洗与消毒 金属材质的器具除了没有酸浸处理步骤外,其余步骤同6.1 塑料与橡胶制品清洗与消毒 塑料和橡胶材质的器具用清水浸泡和冲洗同玻璃器皿清洗,之后还需要用2%的Na(OH溶液浸泡 12h,清水冲洗和烘干后用1%稀盐酸浸泡30min,再用清水和三蒸水分别冲洗3次,高压灭菌和烘干 后备用 高压灭菌以0.073MPa的压力下持续10min 主要试剂与溶液配制 主要试剂与溶液配制参见附录A 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂 实验用水符合 GB/T6682一级用水的要求 体外培养细胞鉴定 8.1细胞形态检测 8 .1.1光学显微镜检测 在倒置相差显微镜下,直接观察和记录培养细胞的形态和生长状况 刚贴壁细胞边界清晰,核呈圆 形,核浆比率小,细胞排列整齐,无重叠生长 8.1.2Giemsa染色检测 将盖玻片置于细胞培养瓶中,在5%CO培养箱中37C培养,细胞形成单层后,取出盖玻片,用磷 酸缓冲盐溶液(phosphatebufleredsaline,PBS)冲洗,放在载玻片上,自然干燥 固定液固定10min, Giemsa染色2min,置于显微镜下观察 正常细胞的细胞核被染成紫红色或蓝紫色,细胞质被染成浅 红色 微生物检测 8 2 8.2.1细菌和真菌检测 取5L细胞悬液,置于8mlL无抗生素培养基中,混匀,300g离心5min,重复2次 再用2ml无 抗生素培养基重悬,取0.5mL.接种到胰蛋白陈培养基中,置于37C培养箱以检测细菌;取0.5mL接 种到麦芽汁培养基中,置于26C培养箱以检测真菌 分别培养2周后,晃动悬液,置于显微镜下观察， 无异物则细胞未受细菌和真菌污染
GB/T24862一2010 8.2.2支原体检测 将畜禽细胞接种到无抗生素的培养基中进行细胞单层培养,待盖玻片细胞汇合度达到50%~60% 取出 PHBS漂洗,固定液浸泡盖玻片,固定10min后再用PBS漂洗 将Hoechst33258染液滴加到已 固定的细胞上,染色30min 用PBS漂洗3次,每次3min51 min 将1滴含1%封片液的PES滴加 到已染色的细胞上,翻转盖玻片盖于载玻片上 用100倍~400倍荧光显微镜观察 细胞核外无蓝色 荧光小点或丝状荧光物表明细胞未受支原体污染 8.2.3病毒检测 利用酶联免疫吸附试验,免疫酶试验,免疫荧光试验、血凝试验、血凝抑制试验、免疫酶组织化学、放 射免疫测定等方法对畜禽体细胞库进行病毒检测 细胞活率检测 细胞汇合度达到80%~85%,常规法消化,制成1.0×10个/ml3.0×10个/ml的细胞悬液 取一滴悬液和一滴0.4%台盼蓝溶液混匀,静置2min 用血球计数板计算细胞总数和未着色细胞数 细胞生长周期鉴定 细胞汇合度达到80%~85%,常规法消化,制成悬液,计数 分别向培养板21个孔接种1.0X10个 2.0×10'个细胞，置于37c、5%co培养箱中培养 每隔24h计数3个孔内的细胞密度,用血球计 数板计算细胞总数,取3孔的平均值,连续计数7d 以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标,绘制细 胞的生长曲线 正常生长曲线包括潜伏期、指数增长期停滞期和衰亡期四个阶段 8.5细胞表面抗原检测 -20C放置20min 弃去固定液,用PS漂洗3次,每次 绸胞接种在盖玻片上 用固定液固定一 加人血清,静置20mim,用Ps洗去血清 加人相应的一抗.37C孵育30min,室温放置1h- 3min， 3h 用PBS漂洗后,加人相应的二抗,37 C孵育2加nmn 用Pps深洗.封片,镜检 细胞表面特异性抗 原与特异性抗体结合,荧光显微镜下进行观察 8.6细胞核型检测 8.6.1秋水仙素处理 取对数生长期的细胞,加秋水仙素使其终浓度为0.1E/ml一0.44E/ml 在37C,5%co培 养箱中继续培养1h一6h,使大部分细胞处于分裂中期 8.6.2分裂相细胞采集 用常规方法消化收集细胞 转人15ml离心管,以300离心8min,收集细胞 8.6.3低渗 弃上清液,加人预热至37C,0.075mol/L(或0.4%)Kcl溶液2mL,轻轻吹打,继续加至10ml. 37C温箱中温育30min40min 8.6.4预固定 在温育后的悬液中加人新鲜固定液lmL,混匀,将悬液以300g离心8min,弃上清 8.6.5固定 加人新鲜固定液5ml,打匀,室温静置20min 300g离心8min,弃上清 8.6.6重固定 重复8.6.5步骤,离心后留1ml1.5ml上清液,混匀 8.6.7滴片 取2滴3滴细胞悬液,滴在倾斜45"的预冷载玻片上,干燥 8.6.8染色 用PBS(pH6.8)稀释10倍的Giemsa液染色10nmin,自来水冲洗,干燥 8.6.9封片 将载玻片二甲苯固定两次后,用中性树胶封片
GB/T24862一2010 8.6.10数据分析 统计100个分裂相以确定染色体数目 测量并计算染色体的相对长度、臂比值和着丝点指数,并确 定染色体着丝点类型 8.7细胞同工酶检测 8.7.1样品制备 常规方法消化收集细胞,用PBS重悬,记数 用温育PEBS洗细胞3次,离心,弃上清液 用蛋白提 取液重新悬浮细胞,密度达5.0×10个/ml 将细胞悬液移到1.5ml离心管中,4C下以300g离心 2min， 吸取上悬液,以每管20AL分装后置一70C贮存备用 8.7.2制板和点样 灌注分离胶,待分离胶聚合好再加满浓缩胶,插上梳子 向上下槽缓缓加人稀释10倍的电极缓冲 液至适量,用微量加液器向每个样品槽加人混有1AL2l澳酚蓝样品液20l50L 等量上样 放人4C冰箱 8.7.3电泳 120V电泳,待澳酚蓝进人分离胶后调电压至220V 澳酚蓝迁移至下端0.5 cm~1em处停止 电泳 染色 切去浓缩胶,用蒸溜水漂洗分离胶两次后置37C温箱中避光保温染色2h,拍照
GB/T24862一2010 附 录A 资料性附录 主要试剂及溶液配制 水 A.1 实验用水符合GB/T6682一级用水的要求 2 平衡盐溶液 A 生理盐水或PBS适用于细胞的漂洗 A.3PBS 称取4.00gNaCl,0.10gKCI、1.45gNae,HPO12H.O,0.10gKH,PO,加超纯水定容至 500mL， 调节pH至7.2,高压灭菌,密封后置于4C条件下贮存 生理盐水 称取4.50gNaCI,加人500mL.超纯水,高压灭菌,密封后置于4C条件下贮存 A.5培养基 85%90%的高糖最低限量必需培养基(n minimumessentialmedium,MEM)适用于家禽细胞的培 养;85%90%的高糖Dulbecco改良Eagle培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium,DNMEM)适用于 家畜细胞的培养 用于过滤培养基的滤膜直径为0.22m和0.45 m A.6血清 10%~15%的胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)适合于家畜和家禽细胞的培养 消化液 称取0.10或a.25&腿蛋白腾干粉,游于Ps中,调pH至7.2一了.4,定容至I0ml. 无菌操作 台内,0.22am滤膜过滤除菌、分装,密封后置于一20C条件下贮存 A.8冻存 MEM或DMEM的基础培养基加人终浓度为10%二甲基亚(dimethylsulfoxide,DMsO)和 20%一50%FBS,0.22pm滤膜过滤除菌,密封后置于一20C条件下贮存 A.9胰蛋白陈培养基 称取3.00g大豆胰蛋白陈,溶于100mL超纯水中,调pH至7.3,高压灭菌15min20min A.10麦芽汁培养基 称取2.00g麦芽汁,溶于100mL.超纯水中,调pH至34,高压灭菌15min一20min. A.11IHoechst33258工作液 称取5.00mg Hoechst33258,和10.00mg硫柳汞,溶于100mLPBS,置于棕色瓶中,搅拌30 min
GB/T24862?2010 ??,?1.5mLС?Hoechst33258?,?20c±??档1m ??100mlPEs45min,????5.004g/'ml.4C±??档 A.12?? 22.2ml.0.1mol/27.8ml.0.2mol/1Na,HIPO?50ml,pH 5.5,4C±汸á A.13?? ??1;3?,? A.140.4%?? ?0.40?,PBs?,?PEs100ml A.15?? ?10mg?,10mL??,?1ml??9mL? ? A.16Giemsa? ?1.50gGiemsa?,?50ml,вGiesa??,? ???,56C2h,50mL,?Giemsa?,?? á lnL?9mLrEs?Giemss?,. A.17?? Tritonx-1000.9%NaCl-0.06mmol/L?(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)?1:15?,C档 A.18? A?;?28.80g?,8.00g??,100ml.??; B?:?7.30??48mL1mol/LHCl,0.4mL???100mL pH8.9; C??38.00g?3.00?????.20nl,100mL D?:13mL1mol/LHCI,1.50???,100mL,pH6.7; E?;?30.00g?,0.80g???,100mL F?;??? A.18.1??? ?13.35mL?7.ml1.5mol/?6ml40%?.3ml2%? ??,150AL10%?,30ALF?; ?6.5m?,lmLC?,2.5mlD?,65L10%?,25nlF? ????? 18.2???? 18.2.1?? ?:9.375ml.?,5.625mlE?,9.375mllmol/1Tris-ClpH8.8),0.625mlL1% ?,43.35LF?;
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