GB/T28981-2012
齿兰环斑病毒检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofOdontoglossumringspotvirus
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2013-06-01
- 文件格式PDF
- 文本页数11页
- 文件大小372.62KB
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齿兰环斑病毒检疫鉴定方法
国家标准 GB/T28981一2012 齿兰环斑病毒检疫鉴定方法 Detection.andidentifieatioofodomtoglossuringspotvirus 2012-12-31发布 2013-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T28981一2012 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标准起草单位;宁波出人境检验检疫局、上海出人境检验检疫 局、检验检疫科学研究院、浙江出人境检验检疫局 本标准主要起草人:闻伟刚、陈先锋、杨翠云、郭立新、鲁洁张永江、张明哲、徐瑛、崔俊霞、张慧丽
GB/T28981一2012 齿兰环斑病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了齿兰环斑病毒血清学和分子生物学特征的检测方法
本标准适用于种子、种球、花卉和种苗等植物材料中齿兰环斑病毒的检测,也适用于蚜虫等传播媒 介中该病毒的检测
齿兰环斑病毒基本信息 中文名;齿兰环斑病毒 名:odontoglossumringspotvirus 学 缩 写:ORSV 属烟草花叶病毒属(Tohn amoiuus u),齿兰环斑病毒其他信息参见附录A 方法原理 利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(Doubleantibodysandwichenzyme-linked immunosorbentassay,DAs-ELISA、体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应Reverse transeriptionpolymeraseehainreaction，RT-PCR、实时荧光反转录聚合酶链式反应real-time fluorescentRT-PCR)进行检测鉴定
仪器设备、用具和试剂 仪器设备 PCR仪,实时荧光PCR仪、超净工作台,电子天平(感量;0.001g),电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、 高速冷冻离心机,超低温冰箱(一80C)、高压灭菌锅、小型食品加工机、微波炉、酶标仪
4.2用具 可调式微量移液器(2aL,10aL,100aL,200aL、1000aL、5000aL)及相应的无RNase吸头、无 RNase离心管、PCR管和研钵等
4.3试剂 主要试剂和缓冲液见附录B和附录C
检测 样品制备 取0.5g10g种子、种球鳞片或畸形、变色症状的叶片等植物组织,在研钵或小型食品加工机中
GB/T28981一2012 充分研磨,取五分之一量的均匀后样品,转人离心管中,按1:10(质量:体积)加人样品提取缓冲液振 荡混匀
媒介昆虫按1;10(质量;体积)加人样品提取缓冲液研磨混匀
2000只离心10min,上清液 即为DASELISA,RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测粗提液
注:提取液在3h内使用,否则保存在4条件下
5.2检测方法 5.2.1双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAs-ELISA DASELISA检测应设置对照,用健康的植物组织作阴性对照,用感染ORsV的植物组织作阳性对 照,用样品提取缓冲液作空白对照
其中,阴性对照材料应该尽量与所检测样品一致
具体操作步骤见附录B
当使用商品化检测试剂盒时,参照试剂盒使用说明进行操作
5.2.2RT-PCR方法 RT-PCR检测应设置对照,用健康的植物组织作阴性对照,用感染ORsV的植物组织作阳性对照、 用ddH.O作空白对照
具体操作步骤见附录C
当使用商品化检测试剂盒时,参照试剂盒使用说明进行操作
5.2.3实时荧光R-PCR方法 实时RT-PCR检测应设置对照,用健康的植物组织作阴性对照,用感染ORsV的植物组织作阳性 对照,用ddH.O作空白对照
具体操作步骤见附录D，当使用商品化检测试剂盒时,参照试剂盒使用说明进行操作
6 结果判定 样品经DAsELISA与RT-PCR检测,结果均呈阳性,可判定样品携带齿兰环斑病毒 样品经DAs-ELISA与实时荧光RT-PCR检测,结果均呈阳性,可判定样品携带齿兰环斑病毒
样品保存与记录 7.1样品保存 经检测确定携带齿兰环斑病毒的样品保存在一80C冰箱中,并做好登记和标记工作
样品保存期 限至少1年
7.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括;样品的来源、名称、唯一性标识、检测时间,地点,方法和结果等
血清学测定 需有酶联反应吸光值的原始数据,RT-PCR检测需有电泳结果图片,实时荧光PCR需要有荧光曲线图 与Ct值
结果记录与资料保存期限至少1年
GB/T28981一2012 附 录A 资料性附录 齿兰环斑病毒相关资料 A.1名称 中文名;齿兰环斑病毒 名:odontoglossumringspotvirus 学 缩写;ORsV 分类地位;烟草花叶病毒属(Tobamooirus). A.2寄主范围 主要寄主是建兰(Cymbidiumensiolium)、蝴蝶兰(Phalaennopsissp.,文心兰(Omcidiumsp.)等 兰科(Orehidaceae)植物
A.3为害症状 感染了ORSV的兰花,叶片常产生黄化条纹或不规则褪绿色斑块,花部甚至出现畸形或褪色斑,红 色系花朵尤为明显
A.4分布地区 在世界各地均有分布
A.5传播方式 可通过无性繁殖材料、机械操作携带汁液、蚜虫等传插
A.6粒体形态 长约300nm,宽约18nm的杆状病毒,颗粒中轴可清楚分辨,部分病毒头尾相连
A.7基因组 ORsV粒体分散在细胞质内基晶格排列
内含体为X一体,病毒基因组6395nt
沉降系数 211.6s,核酸为单链RNA,相对分子质量2×10"
GB/T28981?2012 B ? 淶?? ??(DAs-ELISsA) B.1? B.1.110PS?(plH7.4) ?(NaCD) 80g (KHPO 2g (NaHPO 11.5g ?(KcD 2g -20 (Tween- 55 ml 900mL?,?(HcI)pH7.4,1000mL B.1.2???(pH7.4 (NasO. l.3g 20 ??(PVP) g (NaN, 0.2g Tween-20 20mL 900mL1PBST,HClpH7.4,1000ml B.1.3建?pH9.6 1.59g ?(Na.cO. ?(NaHco. 2.93g ?900mL.??,?(HCI)pH9.6,1000ml B.1.4??建?(pH7.4) 800mL 1PBST? ???(BSA 2g PVP(MW2400040000) 20 4 ??1000mL (\P?(pH9.8y B.1.5 97 ? ml NaN 0.2g ?600ml?,?(HCl)pH9.8,?? 1000mL B.2 B.2.1 ??ORsV尴??,??,100L/,·2h4C ?
GB/T28981一2012 B.2.2加样 清空酶联板孔中溶液,用PBST缓冲液清洗6~8次,在吸水纸上拍干
每孔加人100AL制备好的 样品检测粗提液,每个样品设2个重复
同时,设置阴性对照,阳性对照和空白对照
室温孵育2h或 4C过夜
B.2.3加酶标抗体 用酶标抗体缓冲液将酶标抗体按说明稀释
清空酶联板孔中溶液,用PBST缓冲液清洗68次， 在吸水纸上拍干
每孔加人100AL酶标抗体溶液,室温孵育2h
B.2.4加底物 将底物NPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用)
清空酶联板孔中游液用 PBsT缓冲被清洗6一8次,在吸水纸上拍干
每孔加人100L底物溶液,室温避光孵育至阳性对照孔 显色明显(约30min一60min)
B.2.5吸光值的测定 用酶标仪在405nm波长下测定各孔的吸光值并记录 B.3结果判定 B.3.1质量控制要求 缓冲液孔和阴性对照孔的oD值小于0.15,阴性对照孔的oD值小于0.05时,按0.05计算
阳性对照有明显的颜色反应,孔的重复性以样品OD值的平行允许率控制,按照式(B.1)进行计算 OD一OD: ×100% P= B.1 oDToDT? 式中: 平行允许率; OD 重复样品1; OD -重复样品2. 当重复检测样品OD值平行允许率(P)小于20%时,判定检测结果有效
B.3.2若满足不了B.3.1的质量要求,则不能进行结果判定
B.3.3在满足了B.3.1的质量要求后,则按如下原则作出判定 样品oD/阴性对照oD值>2,结果判定为阳性; 样品ODs:/阴性对照OD值<2,判为阴性
GB/T28981一2012 附 录 规范性附录 r-CR方法 C.1主要试剂 C.1.1RNA提取试剂 Trizol、三氧甲烧、异丙醇、70%乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的ddH.O C.1.2RI-CR反应试剂 -步RT-PCR反应试剂;AMV反转录酶(5U/L),RNA酶抑制剂(40U/aL),AMV-Optimiced Ta聚合酶(5U/L),10×RT缓冲液(含50mmol/L的Mg+),dNTP混合物(各10mmol/L)
C.1.3电泳缓冲液TAE(50× 三胫甲基氨基甲烧(Tris 242g 52.1mL 冰乙酸 乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA2H.O) 37.2g 用灭菌蒸僧水定容至1000mL
用时加灭菌蒸馏水稀释至1×TAE
C.1.4澳化乙锭(EB)溶液(10g/L 澳化乙锭 20mg 灭菌去离子水 20ml C.2RNA提取 c.2.1取100nL样品检测粗提液到1.5mL离心管中,再加人700LTrizol和200aL三氯甲烧，上 下颠倒混匀5mim;4C10000
离心10min,小心吸取上层无色水相到新离心管中
c.2.2加人邻体积异两醇.;混匀.4七静置10minr4七10wo《离心10mm,弃上清液
加人700L70%乙醉清洗一遍沉淀
RNA沉淀干燥后,加人20L焦碳酸二乙酯(DEPC)处 C.2.3 理的ddH.o溶解 注:在保证能够得到质量满意的总RNA情况下,也可以采用其他总RNA提取方法
C.3引物序列 O)RSV1;5'-ttacagacccgtctaagetggc-3' ORSV2:5' tgtetc-3” caagtaagtccagacat 预期扩增片断长度为451bp RT-PCR扩增 反应体系如下:10×RT缓冲液含50mmol/L的Mg+)2.5L、dNTP混合物各10mmol/L
GB/T28981一2012 2.5LRNA酶抑制剂(40U/L)0.5L、AMV反转录酶(5U/AL)0.5AL、AMV-OpimizedTaq聚 合酶(5U/AL)0.5L,ORSV1引物(20Amol/儿L)0.5L,ORSV2引物(20Mmol/L)0.5AL、总RNA 1Al,RNasefreedlH.O16.5AL,总体积25L
使用One-stepRNAPCRkit试剂盒或其他等效产 品,也可采用两步法RT-PCR反应试剂,操作步骤按使用说明进行
每个样品设2个重复,同时设置阴 性对照、阳性对照和空白对照
反应条件:50cDNA合成30n min,94预变性2min;94笔变性30s,60C复性30s,72C延伸 ,35个循环;最后72C延伸5" mln. min
C.5琼脂糖凝胶电泳检测 C.5.1制备凝胶 用1×TAE配制l.5%琼脂糖凝胶,加热溶化后冷却至55C左右
C.5.2加溴化乙锭 将澳化乙能(EB)加人到配制好的凝胶中,EB终浓度为0.5g/ml
将凝胶倒人凝胶槽中,插上样 品梳子
冷却凝固后拔掉梳子,在电泳槽内加人1×TAE,缓冲液要没过凝胶表面约1 mm
C.5.3加样 将加样缓冲液与扩增产物按比例混合后加人样品孔,并设置相对分子质量标准(Marker) c.5.4电泳 接通电源,以3V/em一5V/em电场强度进行电泳,0.5h后观察结果
c.5.5结果观察 电泳结束后,将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察,记录结果
C.6结果判定 阳性对照,阴性对照与空白对照正确,待测样品出现451p的扩增条带,经测序和同源性比较,结 果为ORsV序列时,判定为阳性
阳性对照、阴性对照与空白对照正确,待测样品未出现451bp的扩增条带,判定为阴性
GB/T28981一2012 附录D 规范性附录 实时荧光RT-PCR方法 D.1实验步骤 D.1.1引物和探针序列 引物序列:ORsV-TF:5'-gggctgaccceaattceacta-3 ORsV-TR:5'-atcagcaaactgetgttgaacag- 探针序列:ORSV-probe:5'-FAM-accaattetctgggtaatcagttcca-Eclipse-3” D.1.2RNA提取 操作方法见c.2
D.1.3实时荧光rCR反应体系 反应体系如下:2×OneStepRT-PCRBuffer10L、20Amol/L上下游引物各0.6AL、 20mol/L荧光探针0.6L、50×ROXreferencedye0.4L、5U/LExTagTHs0
！L、 PrimeSeriptITMRTEnn nzymeMixl0.4AlL总RNA1MlLRRNasefreedH,O6AL,总体积20AlL
采用 OneStepPrimeSeriptTRT-PCRKit(PerfectRealTime)或其他等效产品,也可采用两步法实时荧光 RT-PCR反应试剂,操作步骤按使用说明进行
每个样品设2个重复,同时设置阴性对照、阳性对照和 空白对照
D.1.4实时荧光PCR反应参数 反应条件;42C5min,95C10s;然后955s,60C31s,共40个循环
本反应条件适用于 AB17000型荧光PCR仪,如使用其他荧光PCR仪,可以根据仪器性能进行适当调整
仪器操作方法 按照设备使用说明进行,反应结束后保存各项数据和图像
D.2结果判定 D.2.1阔值设定 阔值设定根据仪器雕音情况进行调整,或以阀值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点
D.2.2质控标准 阳性对照的Ct值应<30.0,并出现典型的扩增曲线
否则,此次实验结果无效
阴性对照和空白 对照无Ct值
GB/T28981一2012 D.2.3结果判定 样品无C值并且无扩增曲线,判定为阴性
样品C值<35.0,且出现典型的扩增曲线,判定为阳性
样品Ct值在35.0~40.0之间时,应重新提取样品总RNA进行扩增检测
重做结果无Ct值,判 为阴性;否则判为阳性
齿兰环斑病毒检疫鉴定方法GB/T28981-2012
齿兰环斑病毒是一种危害植物生长和发展的病毒，在我国多地均有发现。为了控制其传播和扩散，对于进出口、运输等相关行业，要求必须进行检疫鉴定。
GB/T28981-2012《齿兰环斑病毒检疫鉴定方法》是目前我国针对该病毒制定的标准化技术规范，旨在提高检疫鉴定的准确性和有效性。
检疫鉴定方法
GB/T28981-2012中规定，齿兰环斑病毒的检疫鉴定主要通过以下方面进行：
- 外部形态观察：观察受感染植物的叶片、茎、根等部位是否呈现出病斑、病斑形状、颜色、大小等特征，以确定是否为齿兰环斑病毒。
- 生物学特性观察：通过对受感染植物进行病原学观察、传播试验、血清学检测等手段，判断其病原学特性是否符合齿兰环斑病毒的特征。
- 分子生物学方法：通过PCR技术等分子生物学方法，检测其RNA序列，以确定是否为齿兰环斑病毒。
综上所述，GB/T28981-2012规定的齿兰环斑病毒检疫鉴定方法，包括外部形态观察、生物学特性观察和分子生物学方法三个方面，具有科学、准确、可靠的特点。
