饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验

饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验

国家标准 GB/T20191一2006 饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验 MierobiologicalexaminationofLaetobaeillusaeidophilusinfeeds 2006-09-01实施 2006-05-17发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20191一2006 饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验 范围 本标准规定了饲料中嗜酸乳杆菌数的测定及鉴定方法 本标准适用于含有有益微生物嗜酸乳杆菌的各种饲料中嗜酸乳杆菌数量的测定 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T14699.1饲料采样 设备和材料 3.1恒温培养箱:36C士1C 3.2冰箱;0C一4C 3.3恒温水浴:46C士1C 4 电炉可调式 3 3.5吸管;容量为1mL,10mL.25 m 3.6广口瓶或三角瓶;容量为500ml 33.7平皿直径为9 cm 3.8试管;18mmX180mm 3.g显微镜:400倍 3.10高压灭菌锅使用温度为121c 3.11烘箱使用温度为160c 培养基和试剂 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂、蒸馏水或去离子水或相当纯度的水 改良MC培养基(modifedchalmers培养基)(见第A.1章) 4.2氯化钠 4.3革兰氏染色液(见第A.6章) 3%过氧化氢溶液 4.5靛基质试剂(见第A.4章) 4.6硝酸盐培养基、硝酸盐试剂 明胶培养基(见第A.5章) 4.8乳酸杆菌糖发酵管(见第A.2章) 4 .g 七叶昔培养基(见第A.3章 采样与试样制备 5.1采样工具,如探子,铲子,匙,采样器,试管、广口瓶,剪子等,应是灭菌的 5.2样品包装为袋、瓶或罐装者,取完整未开封的 样品是固体粉末,应边取边混合;样品是流体,通过
GB/T20191一2006 振摇即可混匀 样品送到微生物检验室应越快越好，一般应不超过3h 如果路途遥远,可将试样于 0C一5C中保存(如冰壶). 5.3采样数量和方式按GB/T14699.1执行 嗜酸乳杆菌数的测定 6.1检验程序 嗜酸乳杆菌数检验程序如图1: 试料 配成几个迈当倍数的稀释液 选择2个~3个适当稀释度，各以1ml最加入灭菌平里内 每m内加入适量改良Mc培养基 36c土1 72h土1h 菌落计数、签定 报告 图1嗜酸乳杆菌数检验程序 6.2操作步骤 6.2.1以无菌操作将经过充分摇匀的试料25g(或25mL)放人含有225ml灭菌生理盐水(见第A.7 章)的灭菌广口瓶内配成1:10的均匀稀释液 6.2.2用1ml.灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml.,沿管壁徐徐注人含有9nml灭菌生理盐水(见第 A.7章)的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液) 6.2.3另取1mL灭菌吸管,按上述操作顺序,作10倍递增稀释液,如此每递增一次,即换用1支1mL 灭菌吸管 6.2.4选择2个3个以上适宜稀释度,分别在作10倍递增稀释的同时,即以吸取该稀释度的吸管移 ml稀释液于灭菌平皿(3.7)内,每个稀释度作两个平皿 6.2.5稀释液移人平皿后,应即时将冷至50C的改良MC培养基(4.1)注人平皿约15mL,并转动平 皿使混合均匀 同时将计数培养基倾人加有1m稀释液试料用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白 对照,以上整个操作自培养物加人培养皿开始至接种结束须在20min内完成 6.2.6待培养基凝固后,翻转平板,置36C士1C恒温培养箱(3.1)内培养72h土1h取出,观察菌落特 征,选取菌落数在30一300之间的平板进行计数 6.3菌落特征 嗜酸乳杆菌在改良MC培养基(4.1)上菌落生长形态特征见表1
GB/T20191一2006 表1嗜酸乳杆菌在改良MC培养基上的菌落特征 菌种类型 菌落特征 杆菌 平m底为粉红色,菌落较小,圆形,红色,边缘似星状,直径2nmm士1nmm,可有淡淡的晕 嗜酸乳杆菌的鉴定 菌种制备，自平板上挑取单菌落,接种于改良MC培养基(4.1)斜面,于36C士1C,24h一48h培 养,刮取菌苔,分别进行下列试验 7.2进行革兰氏染色,显微镜(3.9)检查,并做过氧化氢酶试验 嗜酸乳杆菌应为革兰氏阳性,无芽袍， 过氧化氢酶阴性的杆菌 进一步鉴定需做硝酸盐还原、明胶液化、产靛基质、产硫化氢和碳水化合物发 酵试验 嗜酸乳杆菌极少见还原硝酸盐,不液化明胶,不产生靛基质和硫化氢 7.3嗜酸乳杆菌的碳水化合物发酵试验结果及其与干酪乳杆菌和植物乳杆菌的区别,见表2 表2饲料中常用乳杆菌的碳水化合物发酵试验结果 菌种名称 七叶昔 纤维二糖 麦芽糖 甘露醉 水杨苷 山梨醇 籽糖 蔗糖 嗜酸乳杆菌 十 8 干酪乳杆菌 植物乳杆菌 注l:十 -阳性; -阴性 -有些菌株阳性,有些菌株阴性 注2:本表中列出干酪乳杆菌与植物乳杆菌的碳水化合物发酵是为了与饲料中允许使用的其他乳杆菌相区别 嗜酸乳杆菌与二者碳水化合物发酵试验的主要区别在于甘露醇和山梨醉试验 结果计算及表述 菌落计数后,随机挑取5个菌落进行鉴定(见第7章),根据证实为嗜酸乳杆菌菌落数计算出该皿内 的此菌数,然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中此菌数,按式(1)计算 A=B× 皇x" 1 式中 -测定的嗜酸乳杆菌菌落数,单位为菌落形成单位每克(cfu/g)或菌落形成单位每毫升(efu/mL); -嗜酸乳杆菌的可疑菌落总数 5个鉴定的菌落中确认为嗜酸乳杆菌的菌落数; -稀释倍数 例如含有嗜酸乳杆菌的试料中10"稀释液在改良MC培养基平板上,生成的嗜酸乳杆菌可疑菌落 为100个,取;个整定,证实为暗酸乳杆菌的是4个,则由Ig试料中含噜酸乳杆菌菌数为I00x 10"=8.0×10
GB/T20191一2006 附 录 A 规范性附录 培养基及染色液 改良C培养基 A.1 成分 A.1.1 大豆蛋白陈 牛肉浸膏 5g 5g 酵母浸膏 20g 葡萄糖 5g 乳糖 20g 碳酸钙 0g 琼脂 15g 1%中性红溶液 5ml 水加至1000mL 硫酸粘杆菌素B酌情加 10万国际单位 A.1.2制法 将除了中性红溶液和硫酸粘杆菌素B以外的其他7种成分加人蒸僧水中,加热溶解,校正pH6.0， 120t 加人中性红溶液 分装烧瓶,高压灭菌121C15min~ min 临用时加热熔化培养基,冷至50C,酌 情加或不加硫酸粘杆菌索B(样品中怀疑有杂菌污染时,可加硫酸粘杆菌素B,混匀后使用) A.2乳酸杆菌糖发酵管 A.2.1基础成分 牛肉膏 5g 蛋白陈 5g 0.5ml 母浸膏 5 吐温80 g 琼脂 .6%潦甲酚紫酒精溶液 1.5 1.4mL e 蒸水 1000ml A.2.2制法 按0.5%加人所需糖类,并分装小试管 A.3七叶苷培养基 蛋白陈 磷酸氢二钾 1 g 5g 七叶背 柠檬酸铁 3g 0.5g 1.6%澳甲盼紫酒精溶液 蒸僧水 l.4ml 100ml A.4靛基质反应培养基及试剂 A.4.1蛋白陈水 A.4.1.1成分 胰蛋白陈 10g" 氯化钠 5g DL-色氨酸 蒸馏水 1000ml lg A.4.1.2制法 将上述各成分溶解于100C水中,过滤,校正pH7.5,分装于小试管中,每支5mL,121C高压灭菌 15 mina A.4.2柯凡克试剂 .4.2.1成分 A，
GB/T20191一2006 对二甲氨基苯甲醛 盐酸 5ml. 5g 戊醇 75ml A.4.2.2制法 将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后缓缓加人浓盐酸 A.5明胶培养基 A.5.1基础成分(p7.0) 1.0g 蛋白陈 酵母提取物 g 盐溶液 4.0mL 葡萄糖 0.lg 100ml 蒸水 A.5.2盐溶液成分 无水CaC 0.48 0.2g MgSO 7H.O g KHPO. 1.0g KHPO 1.0g NaHcO 10.0g NaCI 2.0g 将CaC1 与MgSO.7H.0混合溶解于300mL蒸溜水中,再加500mL水.一边搅拌一边缓慢加 人其他盐类 继续搅拌直到全部溶解,加200nmL燕僧水,混合后4C储藏备用 A.5.3制法 将拟分装的试管内加人明胶(0.6g/管),再将上述配制煮沸后的培养基分装其中(5mL/管 S 13C115C高压灭菌15min20min o 革兰氏染色液 A.6 A.6.1草酸铵结晶紫染液 A液;结晶紫2g,95%乙醇20m B液;草酸铵0.8g,蒸僧水80mL 混合A液和B液,静置48h后使用 A.6.2番红染色液 番红2.5g,95%乙醇100mL 取上述配好的番红酒精溶液10ml.与80ml蒸憎水混匀即可 A.6.3碘液 碘片1g,碘化钾2g,蒸僧水300m N 先将碘化钾溶解在少量水中,再将碘片溶解在碘化钾溶液中,待碘完全溶解后加足水分即可 生理盐水 将燕溜水加人&.5《的氯化的中做成10o00mL的溶液 在121C下灭菌15min