木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法

木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法

国家标准 GB/T28095一2011 木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofPhellinusnoxiuus(Corner)G.Cunn. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T28095一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标淮起草单位;宁波出人境检验检疫局检验检疫技术中心,江苏 出人境检验检疫局 本标准主要起草人:张建成、陈先锋、丁国云、张慧丽、戴忠军、张培、王良华
GB/T28095一2011 木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了木层孔褐根腐病菌Phelin4s no.zius 的检疫鉴定方法 本标准适用于木材和苗木上的木层孔褐根腐病菌的检测和鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T12728食用菌术语 sN/T1126进出境木材检疫规程 sN/T1157进出境植物苗木检疫规程 术语和定义 GB/T12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件 3.1 平伏反卷effused-relexedl 担子果在基物上的着生形态,其一部分贴附于基物上,边缘翘起反卷形成檐状、条状,半圆形或扇形 菌盖,有时呈覆瓦状叠生 整个担子果贴附于基物上,不形成菌盖的形态称为平伏(efused) ative 生殖菌丝generan hyphae 担子果中基本的菌丝类型 在刺革菌科(Hymenochaetaceae)种类中,生殖菌丝只形成简单分隔" 不形成锁状联合,通常无色、浅黄色或浅黄褐色,薄壁或厚壁,分枝或很少分枝 3.3 刚毛状菌丝setalhyphae 在菌肉或菌髓中形态像菌丝,但明显比菌丝宽,且具有厚壁,顶端尖锐的结构 木层孔褐根腐病菌基本信息 中文名:木层孔褐根腐病菌 学名;Phellinuso.rius(Corner)G.Cunn.1965 异名;FomesoriusCorner1932;Phellinidiumo.rium(Corner)Bondartseva&.s.Herrera1992 病害英文名;brownrootrotdisease 属真菌界Fungi,担子菌门Basidiomycota,担子菌纲Basidiomm ,刺革菌目Hymenochaetales. myceteS， 刺革菌科Hvmenochaetaceae,木层孔菌属Phellinus 木层孔褐根腐病菌的其他信息参见附录A
GB/r28095一2011 方法原理 根据木层孔褐根腐病菌在寄主植物上的症状,抽取可疑样品进行病原菌分离培养,根据病原菌的形 态特征,生物学特征和PCR特异性反应对病菌进行鉴定 仪器和用具 6.1仪器设备 体视显微镜、显微镜(具100×油镜和测微尺),超净工作台,生物培养箱,冰箱、高压灭菌器、干热灭 菌器 6.2实验用具 载玻片、盖玻片、滴管、培养皿、慑子、解剖刀、酒精灯、,医用手术剪 试剂和材料 7.1试剂 7 1.1燕僧水(H.O). 7.1.25%氢氧化钾(KoH)溶液(质量浓度). 7.1.3棉蓝试剂;棉蓝(苯胺蓝)0.5g、乳酸60mL 7.1.4Melzer试剂;碘(I.)0.5g、碘化钾(KI)1.5g、水20g、水合氯醛22.5g 7.2培养基 7.2.1大麦提取物琼脂(MEA)培养基 大麦提取物MaltExtract)20g,琼脂Agar)20g,加燕僧水至10001 mL 121C高压湿热灭菌 30min,倒平板备用 7.2.2选择性培养基 MEA培养基灭菌后,待冷却至40C50C,加人100mg氨节青霉素,10mg氯硝胺,10mg苯菌 灵,500mg没食子酸,混匀倒平板 7.2.3马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基 自行配制或使用市售PDA培养基 现场检测 取样和抽样按照sN/T1157或sN/T1126方法进行 取样时应进行针对性检查,检查有无可疑症状,重点观察茎干基部1m范围内区域及根系是否包裹 褐色菌丝层;剥去树皮,观察树木组织是否白色腐朽,有无褐色网纹状菌丝束;腐烂树木表面是否有真菌 子实体 直接挑出带有可疑症状的货物,将可疑部分切锯)下,送实验室作进一步检验鉴定
GB/T28095一2011 实验室检测 分离和培养 将带病材料用自来水冲洗干净,洁净吸水纸吸干 去除树皮,用消毒的解剖刀片将内部病组织切成 约3mm×3mmX6mm小块,置于选择性培养基平板上,每个培养皿放置5块,梅花状排列,30C黑暗 培养5d10d 选择性培养基上的褐色菌落转移到MEA培养基或PDA培养基30丫黑暗培养 长满 平板后,检查培养性状,在光学显微镜下观察菌丝形态特征 9.2子实体观察 如发现病菌子实体,采用宏观形态观察和显微切片方法检测 宏观形态观察使用体式显微镜,观察子实体的形态,色泽,菌盖、菌孔等特征 显微切片检测方法,使用干标本制作成徒手切片,以蒸水、Melzer试剂和5%氢氧化钾溶液分别 做为浮载剂,在显微镜下观察菌丝及子实层中的担袍子、担子,菌髓等微观特征 显微测量和摄像均在 棉蓝试剂包埋的切片中进行 袍子测量30个,其他结构如菌丝直径、担子大小等均测量10个,取极小 值与极大值,宽度测量于其结构的最宽部位,长度测量于其顶端至基部分隔处 9.3PCR检测方法 培养物菌丝或病组织中病菌DNA提取和PCR检测方法见附录B. 引物PN-1F/PN-2R扩增病菌NA,得到414bp或422bp扩增产物,则为PCR检测阳性,反之,为 阴性 所有真菌DNA均可与通用引物ITs-1和ITs2结合扩增产生300bp左右的DNA片段 鉴定特征 10 10.1寄主上症状 树木根和茎基部表面多形成一层厚厚的黑褐色到黑色菌丝壳,坚硬,油浸状表面,根部菌丝壳常与 泥沙结合不明显 潮湿时,茎部菌丝壳的延伸边缘乳白色,约2em宽,带有澄清褐色的渗出液滴 参 见图C.1)树皮易剥落,病害引起软而脆的蜂窝状白色腐烂,受感染树皮内侧组织具不规则暗褐色菌丝 束形成的网纹(参见图c.2). 10.2无性阶段特征 10.2.1培养性状 在含有没食子酸MEA培养基上,能产生扩散性的暗褐色色素 菌落不规则,菌落前缘菌丝气生至 平伏,初始白色至草黄色,渐渐转为黄褐色至褐色,有褐色网纹(参见图D.1 0.2.2显微特征 菌丝透明到褐色,不产生锁状联合，一般能够产生节袍子和毛状菌丝 节抱子(参见图D.2)由菌丝 断裂形成,与菌丝同色,球形到卵形 毛状菌丝(参见图D.3)鹿角状,菌丝分叉生长,表面有刺状突起 10.3子实体形态 10.3.1整体特征 子实体单生,无柄,大小不一,平伏或平伏反卷形成窄的菌盖(参见图C.3和图C.4),长可达10cm，
GB/r28095一2011 宽可达6cm,基部厚可达2.5cm;平伏时长可达40cm,宽可达15cm 新鲜时硬革质或软木栓质,无嗅 无味,干后硬木质 菌盖表面暗褐色至黑色,具不规则的环带,光滑 孔口表面灰褐色至暗褐色,不育的 边缘明显,孔口圆形,每毫米7个8个,孔口边缘薄而全缘 10.3.2微观结构 子实体切片分为3部分,最上层表皮为一明显的黑色薄皮壳,中间菌肉层,下层菌管层 菌肉黄褐 色,具同心环带,菌肉和菌管之间有一条黑色细线相间 菌管褐色 微观结构参见图D.4 具体结构 如下 菌丝结构;担子果内只存在生殖菌丝;菌肉中菌丝为菌肉菌丝,菌管为子实层体,其中的菌丝为 菌髓菌丝,菌髓菌丝与菌肉菌丝相似;所有隔膜无锁状联合;在5%KOH试剂中菌丝组织颜 色变黑,对Melzer试剂无变色反应,在棉蓝试剂中略变蓝色 担子果菌髓里的刚毛状菌丝顶 端钝而菌肉里的刚毛状菌丝顶端锐,是子实体的最重要的鉴定特征 菌内生殖菌丝无色,博壁,偶尔分枝,常具隔膜,平直,规则排则,直径为4pm一7pm刚毛状 菌丝褐色至暗褐色,厚壁,内腔宽,通常末端尖,起源于黄色厚壁菌丝,长达数百微米,直径 一10" 5 m" Amo 菌管;生殖菌丝很少分枝,常具隔膜,略平行排列,相互紧密黏结,直径为3m一6xm 刚毛状 苗丝明显.厚壁并具一狭窄的内脸,顶端圆钝,长达数百微米,最宽处直径为7pm 14.5丛m 子实层通常在后期消解;囊状体棍棒状,具长而尖锐的顶部,薄壁,大小为(16Am一21um)× (4m一5um);担子近棍棒状,大小为(12Am~16um)×(3.54m~4um);次生菌丝丰富,无 色,博壁,常分枝，直径为3Mm- 15丛m 袍子;担袍子椭圆形或倒卵形,无色,薄壁,大小为(44m一6m)×(3um5Am) 10.4木层孔褐根腐病菌与其近似种的主要区别 木层孔褐根腐病菌与其近似种橡胶木层孔菌的主要区别参见附录E 结果判定 11 11.1检出子实体,符合10.3的鉴定特征,可直接判为木层孔褐根腐病菌 11.2未检出子实体,为害症状、,无性阶段培养特征符合10.110.2鉴定特征,判为木层孔褐根腐 病菌 11.3未检出子实体,为害症状不明显,分离得到符合10.2鉴定特征的真菌,PCR特异性反应阳性 可 判为木层孔褐根腐病菌 标本和样品保存 1 鉴定为木层孔褐根腐病菌的病木保存至少12个月 选择适当的病原菌材料制成永久玻片,分离获得的木层孔褐根腐病菌分离物转移到MEA斜面培 养基或PDA斜面培养基或灭菌蒸圜水室温黑暗保存,每6个月转接到新的培养基上保存,并严格防止 扩散 妥善保存实验原始记录等材料,以备复验、谈判和仲裁 样品和菌株保存期满后,经高温高压灭菌处理
GB/T28095?2011 ?A ?? ???? A.1? ;???,?,(?????),,?,?(, ????),?(???),?,й ?). ;,,?,,?,,,?,?,,, ,??,??,з? ;,,,?,?? :?(?),??,?(),?,?,? ,??,?, A.2 ???Χ?,56?200?(A.1). A.1???? ? ? ?? ? Acaciaaulacocarpa Artemisiacapillaris ?? , Acaciaconfsa Arteisierices ?? rocarpushelerohylus ? Acaciannangimn Actinodahnebedicellala С? Awerrhoacarambola Agahisrobusta ?? Barleriacrisala ?? ? Abizialebeck ?? Bauhiniapwrprea ? Bauhhini Abiziasp spP Aleurilesfordi Bauwhimiaariegalua ? ? Alelritesollccaa Bauhiniahbrid ? Bischofiajaanica ? Alstoiascholari sguamosa-cherimola Beharocaryaintolucrigera ? ??? Boehmeriuniea lo710fa1a ? Boma.rceiba ? Annonasquamosa ?" ? 777O7SO7OSX A.cherimola Bougaimilleusp ? ??? Brenii0s Araucariacunninghami С ?? Brossonetiaka2ioki Araucariahelerophyllue Areatriandra ? Broussoneliaapyrifera
GB/r28095?2011 A.1() ? ? ? Crotalariamican3 ? Cajanuscajan Calocedlrsforosaa ?Ф Cca.staizwaniaa ? Calohylluminohyllum ? Dalergiasisso0 ??? Camelliajaonicau ? Delonirregia ? CCamelliajaonicavar.jaonica ? Dimocarpuslongan Camelliasinensis Diospyrws/errevar.b.ri/oliua Cassiaistula Diospyroskaki ?? Cassiagrandlis Diospyrosolahami ? Ca.ssisp. Drrantarebes Casuarinaequisetiolia ? Eaeisguinens Cedrelamericana ī Elaeocarpusserratus Ceibaentandra ?? Eriobolryajaonica Cerberamanghas ? Eryhrinaariegate ? Chamaeeyparisormosensi Ewcalyp4scamaldulensis У ? У Chlorohorue.rcelsa Ewcal/ypl4scilriodora У Chorisisbeceiosed Eucalyprusdrepanophyla β Eucalyptsgranli У Chrysalidoca ocarpslutescens Ficuselasticavar.elastica ? Cinaocaphora Cinnamomumkanehirai ?? ? Ficushanceana Ficsmierocarpu C17771aom1l712eyla1c2l7 Cirsaurantifolia Ficuspumilavar.aukeotsang Citrsion Ficusreligiosa Fic ? (Citrsreticulata ic4sstenopylla ?? Fir" ? Cocostcifera irianasiple.r ?? Flemingiamacrohyla ?? Codiaeriegtn Coffeaarabica С Findersiabrayleyana ?? Coffea.canephora Fra.rinwsfrmosana ? ? Cofieasp. Grrleniiasioiles Colanilida (Grevillearobusta ? ?? Cordiadichotoa Hedleraasraliaa ? Heveabrasiliensis CrrataegSp. ? Heveasp Crescentiacuete ?? C'rolalaridanagyroides Hibiscsrosa-sinensis Cryptocaryaconcinnai ?? Hi/iscusschiopelalus ? ī? Hibiscustiliaceus ? Curess4slsitanica
GB/T28095?2011 A.1() ? ? ? й Hydlrangeachinensis Ohromalagopus Ip0oeapescarae" Omanlhusfragruns Keteleriadatidiaavar.ormoana?? Pachiramacrocara Kigeliapinnata ?? Palaguiumformosanum Kisodlendrona4s/ralianwm ?? Pellophoruminerme ? Koelreuleriahenryn ? Persea aier1ca71 ?? lLaclucainica Perseugraissimd ? ? lagerremiaspecioa Pinusellioti ? ? ILagerstroeiaturbinata Piselliottiivarelliottii ? ataacaard Pi45thnbergii Lewcaenaglabruta-lewcocehala? Pipernigrumn ewcocephala ? Pistaciachinensis ? Liquidamarformosan4 Podocarpusmacrohyllus ? ? Iitciciesi odlocarsacrrobhvllsvar ? macrophylus Liseaglautin0sa ?? Iitseahybohaea С? Ponga1iabinata ?? acarengata7aris Populssp. Machilusuihoesis Prunuscamanulata ?? Maesatenera ?? Prunusmume ÷ Malotusaniculatus ? Prws perS1ca ? Mangiferaindica Perwcarpusindicws ?? ? ? Maihoutilissia Pyruspyrifolia ? Melalecalecadledlron Rhodlodlendlronobtuusunn Melia ?? aaxedlarc/ Rosasp Melicopemerrilli ? Roystonearegia ? Melodinusangusifolius ?? Salirabylonica Micheliacompressa ? Saurauiaolahamii ? Mcheliacomresvar.ormoaa ?? Seheferaoctohyla ? Ц SeСistereintioliIs Micheliaigo" Muntingia.calabura ?? Senocarpssinual4s ?? ? Murraypniculatae Sterculiafoetida Merauxnicaudatavar.xnicauata Sterculianobilis ? С?? ??? Neolitseaparuigea Sieteiaacrophylla ?? Nepheliumlappaceum ? Suieleniamahagoni Neriumoleander" Syygt ygiumsaaraHgese
GB/r28095?2011 A.1() ? ? ? Theobroacacao ? Tabebuiachrysantha Thetetiaberuiana ?? ? Taiwunia.cryptomerioides Teect ? Ulmusarifolia cton4ranis Tehrosiasp. ? Urenalobata л? Tehrosiaogelim ?? Viswni/eru Terminaliaboiwini С? Zelkoaserralavar.serrala Terminaliacatappa
GB/T28095一2011 附 录B 规范性附录 PCR检测方法 B.1仪器和用具 B.1.1仪器设备 普通天平(感量为0.01g),高速冷冻离心机、,冰箱、PCR仪.电泳仪.、凝胶成像系统 B.1.2实验用具 可调微量加样器(2AL10AL.100L.1000AL),离心管(1.5mL. B.2试剂 无菌双燕水(ddHH.O)、液氮(N,,2-基乙醇、聚乙烯毗咯婉酮(PvP),无水乙醇、氯化镁 B.2.1 Mg(Cl,)、TaqDNA聚合酶、,10×PCR缓冲液,琼脂糖、DNA相对分子质量标记(100bp1000bp、 l0×上样缓冲液 B.2.22%CTAB提取缓冲液;2%十六烧基三甲基澳化铵(CTAB)质量浓度),0.01mol/L三羚甲基 氨基甲婉盐酸盐(Tris-HCl)(pHH8.0),0.02mol/L乙二胺四乙酸(EDTA),1.4mol/1氧化钠(NaCI B.2.3三氯甲烧/异戊醉;体积比24:1 B.2.4TE缓冲液pH8.0);l0mmol/LTris-HClpH8.0)、lmmol/LEDTA(pH8.0) B.2.5dNTP混合物;包括dATP,dTTP,dCTP,dGTP,每种浓度各2.5mmol/ B.2.6引物:根据表B.1和表B.2中序列合成引物,加无菌双蒸水配制成10amol/L 表B.1特异性引物 引 物 序列5'-3” PN-1F AGTTTGcGcTcATccATcTc PN-2R AGcCGAcTTAcGcCAGCAG 表B.2真菌通用引物 物 引 序列5’-3” ITS-1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITs-2 (GCTGiCGTTCTTCATCGATGiC B.2.7EB储存液;澳化乙锭(EB)加无菌双蒸水配制成10mg/ml B.2.85×TBE电泳缓冲液;Tris-HC54g、酬酸(H,BO.,)27.5g、0.5mol/LEDTA(pHH8.0)20mL 加蒸僧水至1000mL,使用时10倍稀释
GB/r28095一2011 B.3病菌DNA提取 不同组织DNA提取方法如下,也可使用市售DNA提取试剂盒提取 B.3.1菌丝体DNA提取 制备用菌丝体约0.2g于研钵中用液氮冷却,研成细粉,迅速将其放人1.5mL离心管中加人少量 的pVP,500L的2%CTAB提取缓冲液,20L2雍基乙醇,轻轻混匀,置65C水浴锅中温浴1h 取 出加人等体积的三氯甲烧/异戊醉混匀,抽抛,4C下离心10nmin(12000r/min),吸取上清液,移人另一 支1.5mL离心管中 重复用三氯甲婉/异戊醇抽提.使蛋白质层沉淀完全 吸取上清液.置于一新的 离心管中 加人2倍体积一20C预冷的无水乙醇,混匀后,离心10min(12000r/min) 将所得DNA 沉淀用70%乙醇洗2次 自然干燥,溶于100L150LTE中,贮存于一20C冰箱中备用 B.3.2病组织DNA提取 将病组织切成小块,以液氮冷冻后研磨成粉,取0.2g粉末,DNA提取方法与B.3.1菌丝体DNA 提取方法相同 B.4PCR扩增 扩增引物两对,其中PN-1F和PN-2R为木层孔褐根腐病菌DNA的特异性引物(见表B.l),ITs-1 和ITs-2为真菌ITs区通用引物(见表B.2). PCR扩增反应体系见表B.3 CR扩增反应程序为;94C3min;94C30s,60C30s,72C45s 35个循环;72C10min 使用通用引物ITs-1和ITS2扩增,退火温度改为52C,其他条件不变 增后产物置于一20C保存备用 表B.3木层孔褐根腐病菌特异性PCR反应体系 L反应体系 试剂名称 加样体积 储备液浓度 A 10×PCR缓冲液 2.5 MgCl 25mmol/L 1.5 dNTP混合物 2.5mmol/L TagDNA聚合酶 5U/al 0.2 引物 0mol/I 各0.5 DNA模板 50ng/Al~100ng/l ddH.O 补至25al B.5琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖加人0.5×TBE电泳缓冲液,加热溶解,加人EB储存液至终浓度为1AL/mL,制成1.5%浓 度琼脂糖凝胶 将5AlL10L.的DNAMarker和PCR扩增产物分别与适量的上样缓冲液混合,点 min301 样 5V/em恒压,电泳20 nmin 紫外凝胶成像系统下观察电泳结果,拍照并记录结果 10
GB/T28095?2011 c ? ?? ????? ?C.1???????γ ? Phelinusno.xius??? ?c.3Phelinusno.xius?? ?C.4Phellinusnoxius?? 1
GB/r28095?2011 ?D ?? ????? ?D.1Phelinusnoxius? ?D.2Phelinusno.xius? ?D.3Phelinusnoxius??? 12
GB/T28095?2011 2 10m 0 10m 10m 0Hm 10m ; ?; ; -е???? е???? ??; ? ?D.4Phelinusnoxius ??? 13
GB/r28095?2011 ? E ?? ????? E.1????? ? ??? ?? ? Phelliniiumno.rium Phellinusamaensis и???? 7Mm~14,5Mm 4Mm~7m ???? и???? ? ? ??? и???? ?,? ?,? ??? У?? Χ?γ?? γ γ ,?? ?? ,??,? 14

木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法GB/T28095-2011

GB/T28095-2011《木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法》是国家标准化管理委员会于2011年发布的一项标准，旨在规范木层孔褐根腐病菌的检疫鉴定工作，保障国内外贸易安全及我国林木资源的健康。

木层孔褐根腐病是由真菌引起的一种危害林木健康的重要病害。该病害寄生于松科、柏科等多种树种，对林木的生长发育产生严重影响，甚至导致死亡。为了防止该病害的传播，我国对进口木材及其制品中的木层孔褐根腐病菌实行了强制检疫措施。

GB/T28095-2011标准规定了木层孔褐根腐病菌检疫鉴定的技术要求、操作流程、结果判定以及质量控制等方面内容。其中，涉及到的检测方法有PCR法、ISI法、ELISA法等多种方法。

该标准的发布，对于规范木层孔褐根腐病的检疫鉴定工作，提高检测结果的准确性和可靠性具有重要意义。同时，它也为加强国内外贸易安全和保护我国林木资源的健康提供了有力的支持。

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