GB/T15670.22-2017
农药登记毒理学试验方法第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验
Toxicologicaltestmethodsforpesticidesregistration—Part22:DNAdamageandrepair/unscheduledDNAsynthesisinmammaliancellsinvitro
- 中国标准分类号（CCS）B17
- 国际标准分类号（ICS）65.100
- 实施日期2018-02-01
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
- 文件大小821.82KB
以图片形式预览农药登记毒理学试验方法第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验
农药登记毒理学试验方法第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验
国家标准 GB/T15670.22一2017 农药登记毒理学试验方法 第22部分体外哺乳动物细胞DNA损害 与修复/程序外DNA合成试验 TIosicoogiealtestmethodsforpesticidesregistration一 Part22:DNAdammageandrepair/unscheduledDNAsynthesistest inmmammaliancellsinvitro 2017-07-12发布 2018-02-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T15670.22一2017 农药登记毒理学试验方法 第22部分:体外哺乳动物细胞DNA损害 与修复/程序外DNA合成试验 范围 GB/T15670的本部分规定了体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验的基本 原则方法和要求
本部分适用于为农药登记而进行的体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
2.1 程序外DNA合成mscheduledDNAsynthesis;UDs 发生在细胞周期的S期半保留DNA程序合成之外的DNA合成
2.2 净核银粒netnueleargrain;NNG 在放射自显影UDS试验中细胞内UDS活性的定量测定,计算为核银粒数(NG)减去等于核面积的 细胞质内银粒平均数(CG),即NNG=NG-CG
由各细胞计算NNG数,再将一个培养物或平行培养 物中的细胞NNG汇总
试验目的 该测试系统是通过对DNA修复合成水平的检测来评价受试物能否对原代哺乳动物细胞和已建立 的哺乳动物细胞系的DNA造成损伤及损伤的程度
由于UDS反映损伤的切除修复过程,并反映出损 伤的程度,因此可作为化学致癌剂短期生物学试验的判断终点
试验概述 将分离和培养的非S期哺乳动物细胞移人含胸腺密核苷('HH-TdR)和受试物的培养瓶中,孵育 -定时间后,观察'H-TdR掺人情况,如果受试物造成了细胞DNA损伤,必然引起细胞的自主性DNA 修复,在修复过程中'HTdR整合人DNA链中,造成'HTdR在修复后DNA中的掺人
再用放射性自 显影或液体闪烁计数的方法来观察掺人'H-TdR的量,掺人越多,说明受试物对DNA的损伤越广泛
除非采用肝原代细胞作为靶细胞,培养的哺乳动物细胞均要在加和不加外源性代谢活化系统两种 情况下与受试物作用
鉴于原代培养肝细胞存在易于分离培养、保留肝微粒体酶系等优点,建议用原代培养肝细胞作为试 验的靶细胞
GB/T15670.22一2017 5 试剂与器材 5.1试剂 注:全部试剂除注明外,均为分析纯,试验用水为双蒸水 5.1.1细胞增殖用培养基 Eagle氏最低必需培养基minimalessentialmedium,Eagle)85份,小牛血清15份,加人青霉素、链 霉素贮存液1份,使青霉素,链霉素的最终浓度分别为l00单位及1004g/mL
EMEM培养基可选用 各种商品供应的粉末培养基按生产厂商提供资料配制并除菌,4C冰箱贮存
5.1.2同步用培养基 不含精氨酸的Eagle氏最低必需培养基(G minimalessentialmedium,Eagle)98份,小牛血清2份 青霉素,链霉素浓度同细胞增殖用培养基
5.1.3lanks平衡盐溶液(HBss 贮液A.将领化悄10瓦.叙化娜&瓦.随酸锁(Ms6so.7H.o2发及氧化钱(Mac.GH.o)2发滋 于800mL双蒸水(50C60)中
另取无水氧化钙2.8g溶于100mL双蒸水中
将上述两溶液混 合后,加水至1 1000mL.加人三氧甲榄2mL,保存于4笔中 财液B.将磷酸复二纳(NaHro,12H.o)3.04(或aHro.2H.o1.2p.腾股二氢娜 KH.PO2H.O)1.2g(或KH.PO0.95g)、葡萄糖20【溶解于800ml双蒸水中,加人100ml 0.4%酚红溶液(取酚红1g,溶于3mL1mol/几氢氧化钠中,待完全溶解后,加人双蒸水中至250mL). 加水至1000mL,加人三氯甲烧2ml,保存于4C中 贮液C:1.4%碳酸氢钠,以双蒸水配制
应用液的配制:取A液1份,B液1份,水18份,混合后分装于玻璃容器内,高压灭菌,4C保存
用前加人1.4%碳酸氢钠,将pH调整至7.2~7.4
5.1.4磷酸缓冲液(无钙、镁的Dlhecco氏磷酸缓冲盐液)pH7.4 取氧化钠8.00g、磷酸二氢钾0.20g、氧化钾0.20g、磷酸氢二钠(NaHPO12H.O)2.89g溶于 1000ml双蒸水中 5.1.50.02%乙二胺四乙酸二钠或四钠(EDTA)溶液 取EDTA0.2迟溶于无钙、镁的磷酸缓冲液中,使成1000mL
高压灭菌后使用
5.1.6抗菌素贮存液 取临床注射用青霉索G100万单位及链霉素1g粉针,在无菌操作下溶于100mL灭菌蒸水中 使青霉素及链霉素在溶液中的浓度分别为1万单位及100004g/mL,使用时每100mL培养基中加人 抗菌素贮存液1mL
5.1.7大鼠肝微粒体S9混合液(10% 每10mL由以下成分组成,临用时配制 6.0mL 磷酸盐缓冲液(0.2mol/L,pH7.4) 0.2mL 氯化钾溶液(1.65mol/儿L)
GB/T15670.22一2017 0.2mL 氧化钱溶液(0.4mal/L) 1.0mL 6-磷酸葡萄糖溶液(0.05mol/L 1.6ml 辅酶I(CoI)溶液(0.25mol/I) 肝s9液 1.0mL 混匀,置冰浴中待用
5.1.8显影液及定影液(放射自显影用 5.1.8.1KodakD170显影液 贮液;无水亚碗酸销25g、澳化钾lg,加水至200ml
使用时用水稀释至1000mL,溶人2氨基 酚盐酸盐(amitol)4.5g
5.1.8.2KodakD-196显影液 水(50C)500mL..,顺次溶人米吐尔(硫酸对甲氨基苯酚)2g,无水亚硫酸钠72g、对苯二阶8.8g,无 水碳酸钠48g、澳化钾4g,加水至1000mL 5.1.8.3停显液 98%冰乙酸15mlL,加水至1000nmL
5.1.8.4KodakF-5定影液 水(50)100ml,依次溶人硫代硫酸钠240g,无水亚硫酸钠15g、28%乙酸48mlL,棚酸(结晶 7.5g、钾矶15g,加水至1000ml 5.1.90.25mw/L及0.5mo/L，高氧酸 70%高氧酸(售品)8.57ml,加水至100mL.为1mol/L,倍比稀释至所需浓度
5.1.10闪烁液 2,5-二苯基恶陛(PPO)5g、l,4-双-[5-苯基幽基-2]苯(POPOP)300mg溶于甲苯中，配成 1000mL
5.2器材 5.2.1玻璃类 在自来水中将污物冲净,在肥皂或洗衣粉溶液中煮沸5min,稍冷后在热肥皂水内反复洗刷,用自 来水冲洗干净
干后浸于清洁液内过夜
取出后用自来水反复冲洗12次
再用蒸溜水冲洗2次,于燕 憎水中浸泡24h
取出后用燕憎水再冲洗2次,烘干
所用玻瓶用纸包扎瓶口,移液管及滴管在近端管 内塞人棉花栓后用纸包裹
5.2.2橡皮类 自来水中冲洗干净后,在肥皂水内煮沸
若为新购置的,则用4%氢氧化钠煮沸10min,再用4%盐 酸煮沸10nmin，自来水流水冲洗2h以上
再于蒸僧水中煮沸2次,用蒸水冲洗后,浸泡于蒸僧水中 24h,干燥后,用玻璃纸包装,置于容器内
5.2.36号玻璃滤器(除菌用 新购置的滤器浸人含少量亚硝酸钠的热硫酸内24h,蒸僧水抽滤后,用氢氧化钠溶液抽滤至中性
GB/T15670.22一2017 再用双蒸水抽滤2次,烘干后配上橡皮塞后包扎
滤器使用后立即用蒸馏水抽滤一次,随后用1%亚硝 酸钠硫酸溶液(硫酸溶液浓度0.5mol/L)抽滤后,浸于该硫酸溶液内(注意应使滤板的两侧都浸于酸 内)
清水冲洗后,用蒸溜水抽滤3次,干燥后,配塞包扎 5.2.4器材的消毒 不带橡皮塞的玻具及金属用具可用干热灭菌,温度升至140C后,保持2h
橡皮类及带橡皮塞的 玻具应高压灭菌(120C,30min)
溶液除不耐热的应用抽滤除菌外,耐热的可用高压灭菌，一般用 1l5C,l0min
试验方法 6 6.1试剂和受试物制备 6.1.1溶剂/溶媒的选择 受试物和对照物都应用培养基配制或者溶解在适当的溶剂中,然后用培养基稀释后用于试验
终 浓度不应影响细胞活力
在必须使用溶媒时,应尽可能使溶媒浓度降低,以免影响细胞的存活率和增殖 率
如用二甲基亚碱作溶媒时,其在培养基中的终浓度应低于1%
溶剂浓度在所有受试组的培养基 中应保持一致
6.1.2对照 在每一项试验中,在代谢活化系统存在和不存在的条件下均应设阳性对照和阴性溶剂)对照
6.1.3阳性对照物 大鼠肝细胞试验中阳性对照物选择7,12-二甲基苯慈(7,12-DMBA)或2-乙酰氨基芬(2-AAF)
对 于已建系的细胞系,用放射自显影或液闪仪方法,在无代谢活化系统时选择4-硝基呤啾(4-NQQ)作为 阳性对照物,在有代谢活化系统时可用N-二甲基亚硝胺(NDMA)作为阳性对照物
6.1.4细胞和培养条件 原代培养物(如大鼠肝细胞)、人淋巴细胞或已建系的细胞系(如人的二倍体成纤维细胞)都可以用 于试验
已建立的细胞系应该定期检测是否有支原体污染
6.1.5受试物剂量设置 受试物至少应设置5个可供分析的浓度剂量组(5个10个)
使用放射自显影技术检测UDS时， 每个试验组至少需要2个细胞培养样本;用液闪技术测UDs时,每个试验点则需6个以上平行样本
受试物最高浓度的选择由预试验获得,是基于细胞毒性
无毒性受试物的最高浓度应达10mmol/L 或5mg/mL;有毒性受试物的最高浓度应出现细胞毒性反应,使细胞存活数诚少
在无明显毒性到 24h无细胞存活浓度范围内选择5个以上剂量进行试验
6.2试验步骤 6.2.1细胞的传代,维持和贮存 哺乳动物原代肝细胞的短期培养物选用新分离的贴壁生长的肝细胞,以培养液培养
人淋巴细胞 可用全血经白细胞分离液分离获得
其他的细胞系可由原培养物传代获得
生长成单层的细胞,除去培养基
用Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗涤后,用0.02%EDTA或0.1%
GB/T15670.22一2017 胰酶溶液(无Ca+、Mg的磷酸缓冲液中)于37C下处理数分钟,使细胞退缩,细胞间隙增加
再用 HBSS洗涤1次,加人适量培养基,反复吹吸,使细胞自玻面上脱下并分散于培养基中
取细胞悬液 1滴,加于血球计数池中,计数四大格中的细胞数,计算出悬液中的细胞浓度(四大格的细胞数/4×10 /ml
将上述绷 即为每毫升所含细胞数)
将细胞悬液用生长用培养基稀释至0.5×10'/ml1×10'/ 胞悬液接种于培养瓶中(30ml培养瓶可接种31 ml,100ml的可接种10mL)
每次接种3份,长成融 合单层后取其中1瓶再按以上方法传代接种3瓶
另两瓶在证明传代成功后弃去或供试验所用,这样 可保证细胞在试验中延续保持
有条件可按下法将细胞贮存于液氮中
将细胞增殖至所需数量后,按 1×10"/mL1.5×10°/mL
上法制成细胞悬液于生长用培养基中)
细胞浓度为 在冰浴中,逐滴加 人为细胞悬液总量10%的灭菌二甲基亚碱
然后将细胞悬液分装于洁净干燥的灭菌安瓶或细胞冻存 专用塑料小管中,每份1ml
封口后,置于4C中2h~3h,然后移至普通冰箱的冰格内4h5h,再 移人一30C-20的低温冰箱内过夜
次日晨将安瓶移至生物用液氮贮存器内
需用时,将安瓶 或小管自液氮中取出,锯(打)开,除去含有二甲亚碱的培养基,加人适量生长用培养基,并调整细胞浓度 至1×10'/ml1.5×10'/ml
分种于细胞培养瓶中,37C培养1h后,换培养基一次,将无活力的细 胞除去,待长成融合单层后分传增殖维持于实验室中 若较长时间不用,不必在实验室中维持
在需要时取出经增殖后供试验所用
6.2.2UDS的放射自显影显示法 将细胞增殖至所需数量后,按上述方法制成单细胞悬液,细胞悬于生长用培养基中
浓度为0.5x 10/mL1×10/mL
将上述细胞悬液接种于置有小盖片(18mm×6mm)的培养瓶中,37C培养 1d~3d,使细胞在盖片上生长至适当密度
培养瓶接种数目根据受试物的数目、所选剂量级别而定 每一剂量作2个3个样片,并另备4个一6个样本供溶剂对照和已知致癌物的阳性对照用
细胞在增 殖培养后,以同步培养用培养基(ADM补以1%小牛血清)作同步培养3d4d
在试验前一天下午 加人溶于ADM的胫基脉(HU)溶液,使HU在培养基中的终浓度为10mmol/L
继续在37C下孵育 16h,然后将上述长有细胞的盖片置于含有不同浓度的受试物、HU浓度为10mmol/L)及'H胸腺嗜 院核苷(1.9x10q/ml一3.7X10Bq/ml,l.1x10/mmol)的同步用塔养基中
37C中孵育 5h
以溶剂及已知致癌物为对照
受试物及已知致癌物溶液在试验时新鲜配制
先将它们溶于适当溶剂(蒸水、二甲基亚碱、丙啊 等)中,配成最高测试浓度100倍的贮液
再依次以溶剂按10倍稀释,配成不同浓度的受试物溶液
将 各种浓度的受试物溶液加于培养基中,使溶剂的最终浓度为1%
孵育结束后,用HBSS充分洗涤,用1%柠檬酸钠溶液处理10min,随后用乙醇-冰乙酸(3:1)固定 4C)过夜,空气中干燥后,用少量中性树胶将盖片粘固于载玻片上,长有细胞的一面朝上,45C烘烤 24h
在暗室中,将适量核-4乳胶移人浸溃用的玻璃器皿中,置于40C水浴中令其融化,同时取等量蒸 水于一量筒中也置于该水浴中加热
待乳胶融化后,将热燕僧水倾于乳胶液中,继续在水浴中加温 并用玻璃棒轻轻搅拌,等待10min一20nmin,使气泡逸出
在以上准备过程中,将准备作自显影处理的 玻片置于水浴平台上预热
准备就绪后,将玻片垂直浸溃于1:1稀释的乳胶液中约5s,徐徐提出玻 片,并将玻片背面的乳胶用纱布或擦镜纸拭去
将已涂有乳胶的玻片移人温度为29C及一定湿度的温 箱中(4h)待乳胶干
然后置于内置适量干燥剂(变色硅胶)袋的曝光盒中
曝光盒外包以黑色避光 纸及塑料纸,置于4C冰箱中曝光10d
曝光结束后,将玻片移人有机玻璃制成的玻片架上,在液温为 9C的D-170或D-196显影液中显影5min,在停显液中漂洗2min,在F-5定影液中定影6 min一 0min,再用水漂洗数小时
细胞可在乳胶涂片前用地衣红(2%)冰乙酸溶液或在显影后用H.E或Giemsa染液染色
将玻片脱水透明后,用盖片封固
GB/T15670.22一2017 在油镜下,计数各样本细胞核上的显影银粒数,同时计数相当面积的本底银粒数,并计算出两者的 差值
计数30个~50个细胞核,计算出对照组,各受试物组及阳性对照组的银粒数的均值和标准差等 统计量
6.2.3UDS的液体闪烁计数显示法 将试验用细胞悬于生长用培养基中,细胞浓度为0.5×10/ml,将细胞接种于液体闪烁计数瓶中 每瓶1mL.,并加人'C-胸腺唁核苷使终浓度为3.7×10'Bq/mL(1.9×10'q/mmol)
37C中培养 48h,使细胞增殖并预标记,去培养基并用HBSS洗涤后,换以含C-胸腺密唁核苷(3.7×10Bq/mL 的同步用培养基,在37C中同步培养2d4d
同步培养结束后,于试验前一天下午去培养基,用 HBSS充分洗涤后,加人含有浓度为10mnm nol/儿胫基脉(HU)的同步用培养基,37C中孵育16h,UDs 的诱发同放射自显影显示法
细胞在含有HU及'H胸腺嗜吮核苷(1.9×10Bq/mL,1.1×10Bq mmo nol)的同步用培养基中与不同浓度受试物接触5h,孵育结束后,去培养基及受试物
以冷盐水洗涤 min,以固定细胞并除去酸可溶性成分,再 2次.随后用冰冷的0.25molL高氧酸溶液处理2次.每次? 用乙醇处理10min以除去脂溶性成分及未掺人的标记物、干后以0.5mol几一1.0mol/几高氨酸 0.5mL于75C~80C恒温箱中水解40min,使掺人的标记物释出
冷却后加人乙二醇乙酥3.5ml 及闪烁液(PPO0.5%、POPOP0.03%,以甲苯为溶剂)5ml,振摇后使呈匀相,以液体闪烁计数器测定 各样本中C及H的放射活性
标本中的"H放射活性即反映UDs中'H胸腺略晓核苷的掺人量;而'C的放射活性反映实验细胞 的数目或其DNA量,因此H和C放射活性比('H/lC)即为单位质量DNA或单位数目细胞中UDS 水平的反映值
若将溶剂对照的H和''C比值作为100%(1.00),可计算出各个样本中对于对照的变 化量,并计算各受试物浓度的样本中的有关统计量
试验结果最好通过重复试验验证
试验结果评价 7.1阳性结果 在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中为阳性结果: 放射性标记物的掺人量在两个以上受试组中出现剂量依赖性增高,且与阴性对照组相比有显 a 著性差异; 至少在一个剂量组得到可重复并有统计学意义的掺人量增加
b 7.2阴性结果 不符合以上阳性结果标准的受试物可认为在本试验系统中无致突变性
在评价时应把生物学意义和统计学意义结合考虑
8 试验报告 试验报告至少应包括以下内容 a 试验名称、试验单位名称和联系方式,报告编号; b)试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况: c 试验开始和结束日期试验项目负责人,试验单位技术负责人、签发日期; d)试验摘要;
GB/T15670.22一2017 受试物名称,有效成分美国化学文摘登录号(CAs号)(如已知)、代码(如有),纯度(或含量 e 剂型、生产日期(批号,外观性状、配制所用溶剂和方法; fD 细胞株名称; 试验条件和方法: 8 1 包括主要仪器和设备,所用的细胞系名称,来源、生长及培养条件、制备方法 22 阳性对照物的选择和制备,阴性对照(空白和/或溶剂对照)的设置; 33 代谢活化系统的获得和在试验中使用情况的描述; 4 染毒条件和情况的描述,包括染毒浓度、染毒持续时间等; 5 阻断细胞进人S期的方法和步骤 6 应用放射自显影技术细胞清洗、制片,放射自显影处理过程,染色、计数方法的描述 77 使用液闪技术时的提取方法及总含量的测定方法和过程的描述; h 试验结果;受试物对细胞株的毒性,是否具有剂量反应关系,统计结果、同时进行的溶媒对照和 阳性对照的均数和标准差; 试验结论给出受试物在试验条件下是否引起体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外 NA合成增加的结论,必要时对有关问题进行讨论; 原始记录保存情况的说明
农药登记毒理学试验方法第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验GB/T15670.22-2017
农药登记毒理学试验方法第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验GB/T15670.22-2017是我国针对农药毒理学进行的一项标准化试验方法，该方法主要评估农药对哺乳动物细胞DNA的损害和修复能力。
在试验中，通常使用新生小鼠纤维母细胞（例如L929细胞）等体外哺乳动物细胞进行试验。利用该方法，可以评估农药对DNA的直接损伤能力以及其对细胞DNA修复能力的影响。
本试验方法主要包括两个部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复试验和程序外DNA合成试验。其中，体外哺乳动物细胞DNA损害与修复试验旨在评估农药对DNA的直接损伤能力以及细胞自身DNA修复的能力；而程序外DNA合成试验则用于评估农药对DNA合成的干扰程度。
在实际应用中，农药登记毒理学试验方法第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验GB/T15670.22-2017已被广泛采用。通过该试验方法，可以有效地评估农药对哺乳动物细胞DNA的损害和修复能力，为农药的安全使用提供了重要的数据支持。
