冬生疫霉菌检疫鉴定方法

冬生疫霉菌检疫鉴定方法

国家标准 GB/T3178g一2015 冬生疫霉菌检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofPhytophthorahibernalisCarne 2015-07-03发布 2015-11-27实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T31789一2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位;检验检疫科学研究院、厦门出人境检验检疫局 本标准主要起草人:杜洪忠、吴品珊、王宏毅、严进、张秋娥
GB/T31789?2015 ù? Χ ?涨?ù?? ??ù????,??д?жù ? 2.1 ??,??(1/1000g,?,PCR?? PCR??????,?? 2.2? ?????????,?,???,??? ???,?,?? ?? 3.1? ?ù(pimaricin),ù(ampicillin),?(rifampicin),(penta chloronitrobenzene ),?(Cadco.)(sioterol),?(ryptopbhan),(thbiamine) ?(CaClH.,O),(NaClo) ?,Tris-HCI,MgCl,HCI!,EDTA?),Na(OH,NaOAc,KClI,Tris,CTAB ????),TAE,?(Ehana),(chorofarm),(Ilpropn nol), ?(Isoamylalcohol),sYBRGreenI?,?K,TaqDNA??,dNTPs,DNA? ?,PCRPHB1PHIB2,???PCRPH-FPH-RTaqMan-MGB? PH-Pr 3.2 ?,V8??(Cedrusdeodara),??(Citruspp.),?? 3.3 V8,??CPA,?PARPV8?,?μ ?B. ? 4.1?? ?????к?,?С???;??,??????
GB/T31789一2015 或整个叶片和叶柄变褐;参见附录A 玫瑰受害症状为叶部和小枝枯萎,茎基部有深紫色到黑色病斑 其他寄主上为根部腐烂或溃疡 4.2分离培养和诱集 4.2.1寄主组织分离培养 可疑症状的根、茎,叶,果实用流水冲洗表面约15nmin,在病健交界处或变色部位切取边长为5mm× 5mm的样品,灭菌滤纸吸干水分,放于选择性培养基PARPV8上,或用0.5%次氯酸钠消毒2n min一 5min， ,无菌水冲洗3次,灭菌滤纸吸干水分,放于胡萝卜丝培养基或稀释5倍或10倍的V8培养基上 培养皿16C20C黑暗培养4d6d,如有真菌菌落出现,转到V8培养基上纯化,1620C 黑暗培养 4.2.2土壤和介质诱集 称取25g土壤或介质,碾碎,去杂放人灭菌烧杯中,加人无菌水将土壤或介质润湿(无游离水),保 鲜膜封口,置于16C20C黑暗放置 3d~5d后在烧杯中加人灭菌水,使水层高4.0cm 取雪松松针或柑橘叶片,无菌水清洗后漂放在 水面或浸在水中,16C一20C黑暗放置 2d3d后开始检查,取有失绿或变色的松针或叶片,无菌水冲洗,灭菌滤纸吸干水分,放于选择性 培养基PARPV8或胡萝卜丝培养基上,16C一20C黑暗培养 如有真菌菌落出现,转到V8培养基 上纯化,16一20C黑暗培养 4.2.3抱子囊培养 取纯化后菌落边缘菌丝块,置于盛有10mL无菌水的培养皿中,16C一20C黑暗条件下诱发袍子 囊,48h后观察菌丝块周围抱子囊产生情况 4.2.4卵跑子培养 将分离菌转至卵抱子培养基上,7C一8C培养1周2周,观察是否有卵袍子形成 4.3分子生物学检测 4.3.1DA提取 收集分离到的真菌菌丝,采用CTAB法提取核酸 参见附录C 4.3.2CR检测 采用引物PHIB1和PH2的特异性,检测从病菌基因组DNA中PCR扩增到的基因片段 特异性引物PHIB1和PHIB2的序列分别为5'-TCGGGTCTGAGCTAGTAGTCTT-3'和5'-CT TcCAcAAcCAATTcCATTATGC3' 反应体系(25AL);样品DNA1l,10×PCR缓冲液2.5AL,25mmol/1MgCl,2AL2.5mmol/L 小NTP2AL.10pmol/引物各0.5AL.,5U/L.TuqDNA聚合酶0.2AL,ddHL.o16.3L 反应条件为94C2min;94C30s,68丫30s.72c45s,35个循环;72C10min;4C保存 在1×TAE电泳缓冲液中,1.5%琼脂糖(含sYBRGreenI核酸染料)凝胶电泳,5V/em,凝胶成 像仪分析结果 4.3.3实时荧光CR检测 可以选择荧光PCR检测.
GB/T31789一2015 实时荧光PCR引物序列为PH-F:5'-CGACTTGcCACCGGGA-3'和PH-R:5'-AACGGTACTT cTcTTTGcTcCGAA-3',TaqMan-MGB探针PH-Pr;5'-(FAM)TTcCACAACCAATTcCATNFQ MGB)3',探针5'蹦标记的荧光报告基团为FAM.?燃标记的非荧光算灭基团为MciB 反应体系(35AL)样品DNA1L,10XPCR缓冲液2.5L,25mmol/LMg(Cl2AL.2.5mmol/儿 dNTPs2L,10Amol/L引物各1AL,10Amol/L探针PH-Pr1.5AL,5U/LTaqDNA聚合酶 0.5AlL,ddH.o13.5L 反应循环为94C10min;94C15s,56C60s,循环40次 鉴定特征 5.1菌落特征 冬生疫霉菌在V8培养基上生长速度较慢(4mm/d8mm/d),菌落白色,平贴至中度的蓬松,呈 玫瑰花瓣状,花瓣状区域较宽且圆,V8培养基淡橘黄色 参见附录D. 5.2 病菌形态 冬生疫霉菌的袍子囊长卵圆形或椭圆形,易脱落,顶部具有不完全的乳头状突起,通常基部锥形、顶 部近半乳突处最宽 153 ×14 22 袍子囊大小(29m" 2m),长宽比较大,为1.8一2.4,袍囊柄长234m~ Am Am 73um 抱囊梗不分枝或窄的长分枝,或形成不规则合轴式长侧枝 袍子囊低温萌发释放游动泡子 病菌 不产生厚垣袍子,一般无菌丝膨大体 该菌为同宗配合,雄器多围生,偶侧生,平均10mX15m;卵袍子黄橙色,满器,大小为22m~ 5.Qwm,壁厚1pm一3wm;藏卵器大小为2闪m一50"m 抱子囊、雄器和卵抱子形态图参见附录D. 5.3与近似种的形态区别 冬生疫霉菌与丁香疫霉菌(Phytophthorasyringae)在形态上很相似,主要区别为冬生疫霉菌落的 花瓣区域较宽,袍子囊易脱落,雄器多围生;丁香疫霉菌落的花瓣区域较尖,窄,袍子囊不脱落,雄器多倒 生,有菌丝膨大体 参见附录E 5.4PCR特异性产物 引物PHB1和PHI2的特异性PCR扩增目的片段为407bp 5.5实时荧光PCR检测 若阴性对照及空白对照的Ct值>40,供试菌Ct值<36,可判定为阳性 结果判定 病菌的培养性状和形态特征与5.1和5.2的描述一致.且PCR检测结果或实时荧光PCR检测结果 呈阳性,可判定为冬生疫霉菌
GB/I31789一2015 样品和档案保存 7.1样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存 对检出冬生疫霉菌的样品应保存于10C冰箱中,至少保存 6个月,以备复核 该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理 7.2菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为冬生疫霉菌的菌株,应妥善保存 将菌株接种于PDA培养基斜面上 20C培养5d,10C黑暗条件下保存,定期(60d)转接防止病菌死亡,至少保存6个月 保存期满后高 压灭菌灭活处理 7.3结果记录与资料保存 完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并应有实验人员 和审核人员签字
GB/T31789一2015 附 录A 资料性附录 冬生疫霉菌相关信息 A.1背景资料 A.1.1病菌的基本信息 英文名:Citrusfruitbrownrot,Citrusleafblight 学名;PhytophhorahibernalisCarne 分类地位;藻菌界(Chromista),卵菌门(Oomycota),霜霉纲(Peronosporea),霜霉目(Peronosporar les),霜霉科(Peronosporaceae),疫霉属(Phytophthora 传播途径主要通过感病寄主、土壤和雨水进行传播扩散 近似种:与冬生疫霉菌在形态上较为近似的是丁香疫霉菌(Phytophthorasyringae) A.1.2方法原理 根据冬生疫霉菌的形态学特征和目标片段的序列特征为鉴定依据 A.2寄主范围 病菌主要为害柑橘属(Citrusspp.)植物,如甜橙、橘子、胡柚、柠檬等,引起果实褐腐;还可侵染甜椒 L.)、番茄Lycopersiconesculenlw L.)、茄子(SolanumelongenaL.)、苹果 a7n7z7n (Cupsiu Malus mumindlicumL.、红花 milMil.),玫瑰(Rosasp.、杜鹃属(Rhododendron、芝麻(Sesan pum Cartham4s/inctoriusL.),贝壳杉(Agahisa4s/rali、Salisb.、白雪松(Chamaecypari、lawsoniana 等,造成枯萎根腐或溃疡 A.3病害症状 冬生疫霉菌可导致柑橘属植物果实褐腐,叶部和小枝呈枯萎症状 侵染初期,果实表皮出现浅褐色 变包,感染部位皮质坚硬,湿度适合时长出白色菌丝体(参见图A.1) 受害果实味苦,具腐臭味 杜鹏属植物受害的症状为叶片出现深褐色至黑色到卵形或圆形病斑,病斑可扩展到整个叶片直至 叶柄(参见图A.2). 玫瑰受害症状为叶部和小枝呈现枯萎,茎基部有深紫色到黑色病斑,病斑处组织深褐色到黑色 冬生疫霉还可导致苹果、番茄、茄子、红花和芝麻根部腐烂,贝壳杉、白雪松出现溃疡症状
GB/I31789一2015 注:引自CourtesyL.w.Timmer 图A.1柑橘属果实症状 注:引自C'herylBomquist 图A.2杜鹃属植物受害症状 A.4地理分布 以色列,土耳其,南非,法国,英国,西班牙、希腊、意大利,葡萄牙,美国、阿根廷、委内瑙拉、特立尼达 和多巴哥、澳大利亚、新西兰、斐济
GB/T31789?2015 ? B ?? B.1V8 V8?100mL,2.5??,15??,?900mL,85%pH7.2, B.2??CPA 50???,15g?1000mL??,85%pH7.2, B.3?PARP-8 V8?50mL,1.25g?,15g?,950ml?,121C,20min,? 50C,?ù0.005g,ù0.25g,?0.01g,0.025g B.4? V8?4000r/min20min,??177mL,0.03g?.0.02g?.0.1 ,0.001g??15g?,??1000mL,?50C
GB/I31789一2015 附 录 C 资料性附录 DNA提取方法 将刮取菌落上的菌丝体放人1.5mL浸在液氮里的离心管中,用塑料杵碾碎待用 离心管加人300nL500alLcTAB缓冲液(其中含0.1只蛋白酶K)混匀,65C水浴1h;13000发 离心5min10min,保留上清液;加500L三氯甲烧:异戊醇(体积比为24:1)混匀.13000离心 5min~10min,保留上清液;再加500l三氯甲炕:异戊醇(体积比为241)混匀,13000片离心 nmin~10min,保留上清液;加人1m异丙醉混匀,-20C过夜;l3000片离心30min,可见DNA沉 5 淀;70%乙醇洗DNA沉淀,室温干燥;用30l一50ALTris-EDTA缓冲液溶解DNA,待用
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GB/I31789一2015 附 录 E 资料性附录 冬生疫霉菌与丁香疫霉菌的形态区别 表E.1冬生疫霉菌与丁香疫霉菌的形态区别 病菌名称 菌落特征 袍子囊 菌丝膨大体 厚垣袍子 有性袍子 长卵圆形或椭圆形， 冬生疫霉菌 在V8培养基上菌落具较长的抱囊柄,易 Phyophhoru 呈玫瑰花瓣状,花瓣脱落,抱子囊较小 无 无 雄器多围生 区域较圆、较宽 大小平均40 hibealis AmX 194m长宽比较大 宽卵圆形或倒梨形 在V8培养基上菌落 丁香疫霉菌 至椭酬形，不易脱 呈星状、菊花花瓣 雄器多侧生 有 无 Phytophhora 落,抱子囊较大大 状,花瓣区域较小 × 小平均47am yringe 较窄 30m,长宽比较小 10o
GB/T31789一2015 参 考 文 献 CABInternational，2007 ProtectionCon [1 cCrop" ndium，2005Edition wallingford，UK ompen CABInternational UlrichR.WerresS.CookeD.，Ph 2phthorahibernalis一anewpathogenonroses.Nach- hytop richtenblattdesDeutschenPflanzenschutzdienstes.2008，60:5，113-114 [3 MontenegroD.， O.，PintosC.,SainzM.J ,MansillaJ P.，AseleetivePCR-basedl guin methodfortheidentificeationofPhyophhorahibernalisCarne.SpanishJournalofAgricult ural Research.2008，6:1)，78-84 AlvarezLA.，Perez-SierraA.，,Garcia-JimenezJ.，Abad-CamposP.，landerasE.，Alzuga- [4们 rayR.，FirstreportofleafspotandtwigblightoRhodlodlendlro causedbyPhytohthorahiber spp nali、inSpain.PlantDisease2007，9l:7)，909. [[5 WaterhouseG.M.，WaterstonJ.M.，Phytophthorahibernalis.IMIDeseriptionsofFungi andBacteria 1964，4，Sheet31 [6 HoH.H.，JongS.CPhytohthorahibernalisandPsyringae Mycotaxon.1993,47: 439-460. Erwin,D.,C.，Ribeiro,O.,K.PhytophthoraDiseasesWorldwide.St.Paul，Minnesota:The [7 AmericanPhytopathologicalSociety.1996，page:338-339. DanceM.H.，NewhookF.J..coleJ.s.，BioassayofPhytophthoraspp insoil Plant [8 DiseaseReporter.1975，59(6):523-527. 9 JeffersS.N.，MartinS.B.，ComparisonoftwomediaselectiveforPhytophthoraand Pythiumspecies，PlantD)sease.1986，70(11);1038-1043 TimmerL.w..Garnseys M..GrahamJ.H..CompendiumofCitrusDiseases，Second 10 edition.APs.UsA.2000，page:39.

冬生疫霉菌检疫鉴定方法GB/T31789-2015

1. 检疫目的

冬生疫霉菌检疫鉴定的目的在于防止由于冬生疫霉菌引起的植物疫情的发生和蔓延，保护我国植物的生产、出口和转移。

2. 检疫对象

冬生疫霉菌检疫对象包括以下内容：

a. 感染或疑似感染冬生疫霉菌的植物及其种子、果实、茎叶等。

b. 上述植物及其制品可能连接的土壤、培养基及其他供菌的物质。

3. 检疫方法

冬生疫霉菌检疫方法主要包括实验室检测和田间监测两部分。

（1）实验室检测

实验室检测主要包括对样品中的疫菌进行鉴定。具体步骤如下：

a. 取样：从植物或其制品中取出一定数量的样品。

b. 处理：将样品进行处理，去除干扰物。

c. 鉴定：通过PCR技术、TaqMan等检测试剂盒、荧光显微镜等方法，对样品中是否含有疫菌进行检测。

d. 结果判断：根据检测结果，结合相关标准，判断样品是否符合检疫要求。

（2）田间监测

田间监测主要是指对植物生长期间可能感染疫菌的区域进行监测。具体步骤如下：

a. 选择监测区域：根据相关标准，选择可能感染疫菌的植物和地点进行监测。

b. 收集样品：从监测区域的植物或土壤中，收集可能含有疫菌的样品。

c. 实验室检测：将收集到的样品送至实验室进行检测。

4. 检疫结论

经过上述检疫方法，检测结果符合《冬生疫霉菌检疫鉴定方法GB/T31789-2015》标准的，可判定为合格；不符合该标准的，应当被拒绝入境或转移。

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2022/10/25 0:39:56 现行