国家标准 GB/T30744一2014 深海微生物样品前处理技术规范 Thetechnoogyspecifieationforthepre-Ireatmentofdeepsemieroorganism Samples 2014-06-09发布 2014-10-01实施国家质量监督检监检疫总局发布国家标准花管理委员会国家标准
GB/T30744一2014 目次前言范围规范性引用文件术语、定义和缩略语试剂和材料仪器与设备 -般规定样品现场处理深海微生物菌种分离深海微生物基因组DNA提取 10 l0 深海微生物宏基因组DNA提取 12 深海生物样品及微生物资源保存 ll1 13 附录A(资料性附录)深海微生物样品前处理记录表格式 22 附录B(资料性附录耐压菌株分离 28 附录c资料性附录微生物菌种分子鉴定 29 附录D(资料性附录)宏基因组Cosnmid文库构建 32 表A.1深海样品采样记录表 22 表A.2深海微生物分离鉴定记录表 22 表A.3深海微生物基因组DNA提取记录表 23 表A.4深海样品宏基因组DNA提取记录表 23 表A.5深海样品保藏记录表 214 表A.6深海细菌保藏记录表 214 表A.7深海放线菌保藏记录表 25 表A.8深海真菌保藏记录表 26 表A.9深海样品宏基因组DNA文库记录表 2 表C.116SrRNA基因通用引物的适用范围 29
GB/T30744一2014 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家海洋局提出本标准由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口本标雅起草单位;国家海洋局第三海洋研究所本标淮主要起草人;曾润颖,那宗泽、,叶德赞、陈新华、林荣澄、孙风芹,徐丽美,盖英宝
GB/T30744一2014 深海微生物样品前处理技术规范范围本标准规定了深海微生物样品前处理中的技术要求、工作条件、深海样品现场处理、微生物及遗传物质提取、保存及资料处理本标准适用于水深大于或等于1000m的深海微生物样品的现场处理、提取与保存规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T12763.4海洋调查规范第4部分;海洋化学要素调查 GB/T12763.6海洋调查规范第6部分:海洋生物调查 HY/T058海洋调查观测监测档案业务规范术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本文件 3.1术语和定义 3.1.1 深海 deep sea 水深大于或等于1000m的海洋区域 3.1.2 微生物样品microorganismsamples 已培养或已提取纯化的,具有一定科学意义,具有实际或潜在实用价值的,可直接应用于各种科学研究的各种菌株(包括细菌,真菌,放线菌等),DNA/RNA等遗传物质;以及包含上述菌株和遗传物质的深海样品,包括水样,沉积物样、岩石样等 3.1.3 前处理pretreatment 在开展深海微生物研究工作之前对采集自深海的各种微生物样品(见3.1.2)所进行的各种处理,包括,深海生物样品现场处理,深海微生物菌种分离、深海微生物基因组DNA提取、深海微生物宏基因组 DNA提取、深海生物样品及微生物资源保藏 3.1.4 低温微生物eold-adaptedmieroorganism 在37C以下的温度中生长良好的微生物(包括细菌,真菌、放线菌等),最适生长温度等于或低于 o 25 3.1.5 暗热微生物thermphile 在等于或高于55C的温度中生长良好的微生物包括细菌,真菌,放线菌等)
GB/T30744一2014 3.1.6 宏基因组 metagenome 不经菌株分离筛选步骤,直接从环境样品中提取的遗传物质(DNA或RNA,包含了样品中所有微生物的基因信息 3.1.7 寡营养培养基oligotraphicmedium 与正常培养基成分相同,但碳源、氮源营养物质浓度减为十分之一的培养基 3.2缩略语 16SrRNA;细菌染色体上编码核糖体RNA16S亚基的基因 18SrRNA:真核生物染色体上编码核糖体RNA18S亚基的基因 Amp;氨节青霉素(Ampieillin BOD;生化需氧量(Biochemicaloxygendemand) CTAB;十六婉基三甲基澳化铵(Cetyltriethylammnoniumbromide) dATP;脱氧腺苷三磷酸(Deoxyadenosinetriphosphate) dGTP;脱氧鸟苷三磷酸(Deoxyguanosinetriphosphate) DNA;脱氧核糖核酸(Deoxyribonueleicaeid DMF;二甲基酰胺(N,N-D)imethylformanmide) EDTA;乙二胺四乙酸(EthylenediaminetetraaceticAeid) GYT:甘油酵母膏蛋白胯培养基(Glycerolyeastextracttryptonemedium) PTG;异丙基--D硫代半乳糖苷(Isopropyl-D1-thiogalactopyranoside) IB;肉汤培养基(Luria-bertani) OD;光密度(Opticaldensity PFGE;脉冲场凝胶电泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis) PDA;马铃薯葡萄糖培养基(Potatodextroseagar) RNaseA:核糖核酸酶ARNAaseA SDS: 二炕基硫酸钠(Dodecylsulfate,sodiumsalt) SOC;含分解代谢抑制物的超级肉汤培养基Superoptimalbrothwithcataboliterepression Tris;三羟甲基氨基甲婉(2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) TE:Tris-Hcl和EDTA-Na配成的缓冲液 TBE;Tris-HC,砌酸和EDTA-Na，配成的缓冲液 Xgal;5-澳-4氧-3-呵嗓-D半乳糖苷(5-Bromo-4-choro-3indolyDgalactopyranoside) YPD酵母膏蛋白胯葡萄糖培养基(Yeast stextracetpeptonedextrosemedium) 入DNA/EcoRI十Hin皿:经EcoRI酶(4.1)和Hind酶(4.2)两种核酸内切酶消化后的入噬菌体DNA 试剂和材料 4.1 EoRI酶 4.2 Hin酶 4.3 BamHI酶阶非另有说明,在操作中仅使用分析纯试剂和电阻率大于18MQem的超纯水
GB/T30744一2014 4.4SalI酶 4.5Sau3AI酶 4.6Kenow酶 d 琼脂糖酶 4.8液体石蜡 4.9dATP(市售. 4.10dGTP(市售). 4.11琼脂糖凝胶:10g琼脂糖,缓慢加人1L水中,混匀,配制成10g/L的琼脂糖凝胶 4.12低熔点琼脂糖凝胶:l0g低熔点琼脂糖,缓慢加人1L水中,混匀,配制成10g/I的低熔点琼脂糖凝胶人工海水,按照GB/T12783.!的规定配制 4.13 乙醇溶液用水配制750mL/L(体积百分数为75%)的乙醉溶液 4.14 4.15稀酸溶液;量取83ml分析纯浓Hcl,缓慢加人917mL水中,混匀,制成浓度为1mol/L的稀酸溶液稀碱溶液.称取40g分析纯NaoH,溶解于水中,混匀,加水稀释至1L.制成浓度为1mol/儿的 4.16 稀碱溶液 NaI溶液;称取900区分析纯Nal.溶解于水中混匀加水稀释至1L.制成浓度为6mol几的 4.17 Nal溶液 4.18甘油溶液;量取800m分析纯甘油,溶解于200ml.水中配制成800mL/1的甘油溶液,混匀后灭菌处理 4.19Tris-Hcl贮液;称取121.14gTris,溶解于800mL.水中,用稀酸溶液(4.15)调节pH值为8.0,用水补足体积至1L,配成1mol/儿的贮液,使用时根据实验要求进行稀释 4.20TE溶液;称取0.373EDTA-Nae,量取10mlTris-HC贮液(4.19),将二者溶解于800ml.水中,用稀碱溶液(4.16)调节pH值为8.0,用水补足体积至1L.灭菌处理 4.21Amp溶液;将lgAmp溶解于5mL.水中,配制为0.2g/ml的溶液 4.22NA抽提缓冲液;称取37.3EDTA-Na2、,17.8gNa,HPO2H.O,15.6gNaH,PO2H.O 87.8只NaC和10gcTAB溶解于700m水中,加人100mlTris-HCl贮液,用稀酸溶液和稀碱溶液调节pH值为8.0,加水补足体积至1L 后灭菌处理 4.23凝胶回收洗涤液;称取2.4gTris,溶解于200mL水中,用稀酸溶液调节pH值为7.4 加人 292.5gNaCl,0.37gEDTA-Nag,用水补足体积至500mL,灭菌处理后,冷却至室温,在超净台中加人 500mL无水乙醇 4.24甘露醇缓冲液;称取182.2g甘露醇,37.3gEDTA-Nae,溶解于500mL.水中,用稀酸溶液和稀碱溶液调节pH值为7.5,灭菌处理 4.25GYT培养基;称取1.25g酵母膏,2.5g蛋白陈溶解于800ml水中,加人100ml甘油,用水补足体积至1L,灭菌处理 4.26S0c培养基,按以下步骤制备: 称取20g蛋白陈,5g酵母膏,0.5gNaCl,0.19gKCl,0.95gMgC 溶解于1L水中,灭菌处理,备用 b)称取10g葡萄糖,溶解于80ml.水中,用水补足体积至100mL.,用0.224m的滤膜过滤除菌备用; 在灭菌后的4.26a)溶液中加人36ml4.26b)溶液,混匀 4.27 甲醛溶液;用水配制370mL/儿一400mL/L.的甲醛溶液,0.224m的滤膜(见5.1)过滤 4.28[甲基-'H]胸腺密啶核苷工作液:取放射性比活度高于1.85TBq/mmol的[甲基-H]胸腺密核
GB/T30744一2014 苷,用水稀释成5nmol/mL的工作液 4.29[4,5-'H]亮氨酸工作液;取放射性比活度高于2.22TBq/mmol的[4,5-H]亮氨酸,用水稀释成 20nmol/ml.的工作液 4.30D-[UL-'c]葡萄糖工作液;取放射性比活度高于7.4GBq/mol的D[UI-'']葡萄糖,用35g/L 的NaCl溶液稀释成0.185MBq/mol的工作液,并按10g/ml的量加人非放射性葡萄糖,然后定量分装于安甄瓶中,封熔后于0.07MPa高压灭菌15min备用 4.31酚/氯仿/异戊醉溶液;量取500ml.经Tris饱和的苯酚,480ml氯仿,20ml异戊醉溶液,混合均匀,装于棕色玻璃瓶中,于4C保存,保存时间为两周 4.32盐酸呱溶液;称取573.2g盐酸肛,溶解于水中,混匀,加水稀释至1L,制成浓度为6mol/L的盐酸肌溶液 4.33sDs溶液;称取100gsDs,溶解于水中,混匀,加水稀释至1L,制成质量浓度为10%的sDs 溶液蛋白酶K溶液,称取20其蛋白酶K.溶解于水中,混匀,加水稀释至1L.制成浓度为20mg/mL 4.34 的蛋白K溶液 NaCl溶液.称取且gNaC,溶解于水中,混匀,加水稀释至1L.制成浓度为0.7mol/L的NaCl 4.35 溶液 CTAB溶液称取10gCTAB.溶解于水中混匀加水稀释至1L制成质量浓度为10%的 4.36 CTAB溶液 4.37蜗牛酶溶液;称取30g蜗牛酶,溶解于水中,混匀,加水稀释至1L,制成浓度为30g/1的蜗牛酶溶液 4.38醋酸钾溶液;称取490.7g醋酸钾,溶解于水中,混匀,加水稀释至1L,制成浓度为5nmol/L的醋酸钾溶液 4.39RNaseA贮液,按以下步骤配制 a)用水将Tris-HCI贮液稀释100倍,用稀酸溶液调节至pH值7.5,备用 0ml.4.39a)溶液中,配成浓度为10mg/mL 的溶 b称取1是RNweA.Q.09星Nacl.崩解于1o0 液,于100C加热15min,按每管1mL分装于小离心管中,于一20C保存 4.40Siliea浆液;每克硅土(Silicea)干粉加人3mL浓硝酸混匀,浸泡5h,然后反复用水洗至中性,去除上清液和中间不能沉淀的部分悬浊液后,保留沉淀,加人等体积水,于一20C保存 4.41溶菌酶贮液用水将Tris-HCI贮液稀释100倍后加人溶菌酶,配成溶菌酶浓度为10mg/mL的贮液,于一20C保存 4.42X-gal贮液;将X-gal溶解于DMF中,配成20mg/mL的贮液,按每管100分装于小离心管中,避光于-20C保存 4.43IPTG贮液;将IPTG溶解于水中,配成200g/L的贮液,用0.22m的滤膜过滤除菌,按每管 500AL分装于小离心管中,于 C保存 20 4.44TBE电泳缓冲液称取 108gTris,7.5gEDTA-Nag,55g砌酸,溶解于800mL水中,用稀酸溶液和稀碱溶液调节pH值为8.0,配制成贮液,使用时用水稀释20倍使用 4.45MgCl溶液;称取 0.95gMg(Cl溶解于10ml水中配制成1mol/儿的Mg(C溶液,灭菌处理按每管1mL分装于小离心管中,于 20C保存 4.46硫酸溶液;称取36.4g硫酸钰(MnSO H.O)溶于水中,稀释至100ml nmL水中,另称取15只碘化钾溶于 4.47碱性碘化钾溶液;称取50g氢氧化钠,溶解于30ml40 20mL水中,将此两部分混合,加水稀释至100ml 4.48LB培养基;称取10g蛋白陈,5g酵母膏,10gNaCI,18g琼脂粉溶解于1L水中,灭菌处理,制成LB固体培养基配制LB液体培养基时无需加人琼脂粉
GB/30744一2014 4.49含Amp的LB培养基:LB培养基灭菌后冷却至50C一60C,按50mL/L的比例加人Amp溶液,再按18g/L比例加人琼脂粉,灭菌处理,制成含Amp的LB固体培养基配制含Amp的LB液体培养基时无需加人琼脂粉 4.502216E培养基;称取5g蛋白陈,lg酵母膏,0.01gFePO,溶解于1L人工海水(见4.13)中,用稀碱溶液调节至pH值7.4一7.8,再按18g/L比例加人琼脂粉,灭菌处理,制成2216E固体培养基配制2216E液体培养基时无需加人琼脂粉 4.51 高氏一号培养基,按以下步骤制备称取20g可溶性淀粉,lgKNO.,0.5gK,HPO,lgMgSo7H.O,0.01迟FesO,溶解于 a 1L海水(4.l3)中,用稀碱溶液调节至pH值7.2~7.4,待用; b称取5g重铬酸钾溶于1L水中配制成重铬酸钾溶液; 按10mL/L的比例将重铬酸钾溶液加人4.51a)溶液中,再按18g/L比例加人琼脂粉,灭菌处 c 理,制成高氏一号固体培养基配制高氏一号液体培养基时无需加人琼脂粉 min,用纱布过滤,补加人 4.52PDA培养基;将200其去皮切块的马铃薯放人1L人工海水中煮沸30 工海水至1L.加人20！葡萄糖,再按18g/儿比例加人琼脂粉,灭菌处理,待冷却至50c 60C时,加人0m庆大霉素,制成DA因体培养基配制DA液体培养基时无需加人腺脂粉 4.53YD培养基;称取20g蛋白陈,20些葡萄糖,10【酵母膏,游解于1L人工海水中,用稀碱溶液调节至pH值7.4一7.8,再按18g/L比例加人琼脂粉,灭菌处理,制成YPD固体培养基配制YPD液体培养基时无需加人琼脂粉仪器与设备 5.1滤膜;材料为醋酸纤维或硝化纤维的微孔滤膜,直径25mm和47nmm,孔径包括0.22unm和 0.45am两种 5.2小离心管:材料为聚丙烯的离心管,容量为0.5mL、1.5nmL,2mL、5m和50mL 5.3枪头;材料为聚丙烯的微量加样器套头,规格为0.2ml、1ml 5.4超低温冰箱;最低保存温度为-80C的冰箱 5.5生化培养箱;培养室温度可在0C一60C范围内调节 5.6振荡培养箱培养室温度可在0C一60C范围内调节,转速可在0r/min一300r/min范围内调节 5.7电泳仪;最大输出电压为250V以上,最大输出电流为300mA以上 5.8高速冷冻离心机:离心可在4C20C范围内调节,离心管规格50mL,转速可在0r/min~ 18000r/min范围内调节 5.9湿盒;材料为聚丙烯或其他可耐121C高温灭菌的塑料,长×宽尺寸大于或等于130mm× 130 mm,内部放置若干用水润湿的棉球 5.10小离心机;可使用规格为0.5mL和1.5m的离心管,转速在0r/min一130oo r/min范围内调节 5.11分光光度计;波长范围190nm~1100nm可调,测量所用比色杯的光径为10 mm 1×110 5.12紫外投射仪;波长为280nm,观察面积为140mm mm 1×180 5.13玻璃试管;直径×长度为18mm mm的平口玻璃试管 .0.20mm.0.15 5.14金属网筛:孔径包括0.30mm、 mm. 5.15安瓶管;内径8mm,长度不小于100mm的中性玻璃管 5.16塑料冻存管;材料为聚丙烯,或其他可耐121C高温和液氮的塑料管,容积大于或等于5mL 5.17电转化仪:最大输出电压2500V,输出电压可在50V2500V范围内调整,最大输出电流
GB/T30744一2014 125A,电弧时限定值1500A 5.18脉冲场电泳仪系统:最高输出电压350V,电压连续可调,最大输出电流0.5A,转换范围50mm 到18h,转换角度为0?360',包括电泳仪,水浴循环仪、电泳槽 5.19其他生物实验常规仪器:热循环仪、超净工作台,漩涡振荡器、水浴锅、高压灭菌锅、酒精灯、普通家用冰箱、显微镜、硅胶塞、涂布棒、培养皿、剪刀、液氮罐、无菌采样瓶、脱脂棉花塞、纱布、接种针、微量注射器,筛子、毁子 -般规定 6.1深海微生物样品前处理工作程序包括;深海生物样品现场处理、深海微生物菌种分离和分类,深海微生物遗传物质提取、深海微生物宏基因组DNA提取、深海生物样品及微生物资源保藏 6.2深海微生物样品前处理程序中除了深海生物样品现场处理以外,其他操作均应在超净工作台中进行 6.3微生物样品应从原位海水或未与上层海水发生交换的深海沉积物中获取水样应选用cTD采水器采集的样品,沉积物样品应选用多管采样器、箱式采样器采集的样品 6.4在深海微生物样品前处理过程中,除特别说明,灭菌处理均指于高压灭菌锅中121笔灭菌20min 处理的过程样品现场处理 7.1技术要求 7.1.1采水器在人水前应用原位海水冲洗3次,采泥器在人水前应用原位海水将其上附着的泥样完全洗净,以防止不同站点之间样品的交叉污染 7.1.2用于分样的器具均应灭菌,如无法高压高温灭菌的,应用乙醇溶液处理后使用 7.1.3分样过程应于2h内完成,若无法立即处理,应暂时于4C保存,但不应超过24h 7.1.4分样后保存的沉积物样品每份不少于30g 7.2样品适用范围 7.2.1箱式采样器采集的样品不应用于需要分层次的微生物分析中 7.2.2多管采样器采集的沉积物样品及上覆水可应用于各种微生物分析 7.2.3CTD采水器采集的水样主要用于生态学分析,采集时应设计好采水的层次 7.3沉积物样品的现场处理 7.3.1箱式采样器样品的现场处理 7.3.1.1刮去表层3cm的沉积物样,插人无菌取样管(口径5cm15cm) 7.3.1.2将取样管拔出,用经灭菌处理过的50ml小离心管(见5.2)插人柱状样中取样后密封,分两份笔保存分别于4C和一20 7.3.1.3另取一份样品用于微生物的现场分离培养,分离步骤见8.3,8.4,8.5和8.6 7.3.2多管采样器样品的现场处理 7.3.2.1 将采样管置于超净工作台前,用灭菌后的导管吸出上覆水置于采水瓶中 7.3.2.2将沉积物样品顶出,每隔3cm用无菌不锈钢板分层取样,转移到超净工作台中
GB/T30744一2014 7.3.2.3去除外圈1cnm的沉积物样品,将中心的沉积物样品分成三份装人无菌采样瓶,分别于4C、 -20笔和液氮罐保存 7.3.2.4另取一份样品用于微生物的现场分离培养,分离步骤见8.3,8.4,8.5和8.6 7.4海水样品的现场处理 7.4.1采样层次根据水深设置采样层次,每个站位按500m间隔取样,例如;l000m、1500m、2000m,2500m、 3000m、离底200m、离底50m和离底5m 7.4.2样品分装 CTD采水器上甲板后,按水深设置用采样瓶从CTD采水器的各对应管中分装水样 7.4.3水样滤膜过滤每5L水样经0.45Am和0.22m滤膜两级过滤后,将0.22Am的滤膜放人冻存管中,分别于4C、 -四笔保存待分离培养 7.4.4用于荧光直接计数的水样处理按20mL/L的比例在50mL水样中加人入甲醛溶液(见4.27)固定样品,于2C一8C低温保存固定后的样品宜立即分析,或在4C中避光保存,保存期限不宜超过一周 7.4.5用于培养基平板计数的水样处理按10mL/L的比例在水样中加人灭菌处理过的吐温一80,于一20C保存 7.4.6用于细菌生产力分析的水样处理取3支50mL带盖培养管,各加人20mL水样,其中一管加1mL甲醛溶液混匀作为对照,再向各管加人[甲基-'H]胸腺噼核苷工作液(见4.28)作为示踪剂使其在样品中的最终浓度为250nmol/几L 混匀,置于原位现场温度下培养1h,再加人1mL甲醛溶液摇匀,保存于2C8C中上述步骤中示踪剂可用[4,5-'H]亮氨酸工作液(见4.29)代替 7.4.7用于微生物异养活性测定的水样处理取3个125mL培养瓶,各加人100mL水样,其中1瓶加人5ml.甲醛溶液作对照,再向各瓶中加 mL.D[Un-c]葡萄糖工作液(见4.30),混匀后置于原位现场温度下培养1h,加人5 人1 mL甲醛溶液,摇匀 7.4.8用于生态呼吸率测定的水样处理 7.4.8.1将水样按溶解氧测定方法的要求注人4个250mlBO)D培养瓶中 7.4.8.2其中两瓶立即进行溶解氧的固定,用吸管插人溶解氧瓶的液面下加人1nml硫酸溶液 (4.46)、2mL碱性碘化钾溶液(4.47),盖好瓶塞颠倒混合数次,静置待棕色沉淀物降至瓶内一半时,再颠倒混合1次,静置至沉淀物下降到瓶底 7.4.8.3另两瓶置暗处于原位现场温度下培养1d后,取出溶解氧的固定的BOD培养瓶 7.5资料处理将采样时间,采样站位的经纬度、水深、温度、盐度,采样方式,处理方式,样品体积,保存方式等相关
GB/T30744一2014 参数记录于深海样品采样记录表(参见表A.l) 数据资料处理记录应按HY/T058的要求归档深海微生物菌种分离 8.1 总则本章规定了从所采集的沉积物、水等样品中分离微生物菌株,包括低温菌、常温菌和嗜热菌菌种分离的工作程序包括:样品稀释、涂布于培养基平板、挑菌、复筛、菌株生长温度确定、菌株培养所有菌株操作均在常压下进行,如进行耐压微生物的分离可参见附录B 8.2技术要求 8.2.1进行微生物菌种分离应选用4保存的样品,或用刚采集的样品进行现场分离 8.2.2所有的小离心管(5.2)、枪头(5.3)配制的溶液均应灭菌处理,冷却后使用 8.2.3培养基的配置应采用下列海水之一进行 a)现场原位海水,经0.45Am滤膜过滤 b避光保存3个月以上的天然海水.经0.45m滤膜过滤的滤液人工海水 c 8.2.4分离菌株时除选用相应的培养基外,还应用寡营养培养基进行分离培养 8.3基本操作 8.3.1沉积物样品中微生物的分离培养沉积物样品中微生物的分离培养步骤如下取1mL的沉积物样品,用灭菌处理的海水稀释到10ml,制成10-'样品稀释液,振荡均匀备用; b)取1mL8.3.1a)溶液,用灭菌处理的海水稀释到10mL,制成10-'样品稀释液,振荡均匀. 备用; 按8.3.1a)和8.3.1b)的步骤依次稀释成10-了~10-"的样品梯度稀释液,振荡均匀,备用 D 取各梯度样品梯度稀释液分别涂布于培养基平板上进行培养,选取菌落在50个~100个之间的培养基平板进行分离培养低温菌培养温度为28C,高温菌培养温度为55,培养时间宜为72h以上 8.3.2含菌滤膜中微生物的分离培养取按7.4.3处理的含菌滤膜,在超净工作台中剪碎装人50mL.小离心管中,浸泡于经灭菌处理的海水中,充分振荡制成菌悬液,除去滤膜,菌悬液经8000r/min离心10min后除去上清液,另加人1ml 经灭菌处理的海水,将沉淀充分混匀,按8.3.1中的方法进行分离培养 8.3.3菌株生长温度的确定 8.3.3.1从培养基平板上分离得到的单菌落经镜检为纯种后,接种于LB液体培养基(见4.48)或2216E 液体培养基(4.50)中培养 8.3.3.2在0一40C的范围内进行培养,温度分别设置为4、10C、15,20C、25C,30 笔和40C,每个温度设三个平行样 37 8.3.3.3在菌株生长的第2h、4h、6h,8h,12h,16h,20h,24h、36h,48h、72h,84h和96h于超净工作台中吸出1mL菌液,测定600nm处的OD值
GB/T30744一2014 8.3.3.4根据测定结果确定菌株的最适生长温度和生长温度范围 8.4低温菌分离 8.4.1技术要求 8.4.1.1所有操作均应在无菌条件下进行 8.4.1.2所有操作应在低于10C的条件下进行 8.4.1.3用于分离筛选的沉积物样品、水样均应选用在4C保存的样品 8.4.1.4细菌的分离筛选采用2216E培养基,LB培养基和相应的寡营养培养基 8.4.1.5放线菌的分离筛选采用高民一号培养基(4.51)和相应的寡营养培养基 8.4.1.6真菌的分离筛选采用PDA培养基(4.52)、,YPD培养基(4.53)和相应的寡营养培养基 8.4.2菌株分离步骤 8.4.2.1按8.3.1和8..2的规定制备样品梯度稀释液,取200L各梯度样品梯度稀释液涂布于相应的培养基平板上 8.4.2.2在10C中放置直到涂布的样品梯度稀释液完全渗透人培养基中后,将培养基平板倒置,于 10丫培养直至长出菌落 8.4.2.3将长出的单菌落分别转接至新的相同培养基平板上,并做好相应的记号,于10C中培养 8.4.2.4将培养基平板上长出的单菌落多次划线分离培养,根据平板上的菌落形态和颜色,以及镜检检测,直至获得纯的单菌落 8.4.2.5根据菌落形态差别进行菌的区分,排除重复的菌株 8.4.2.6对形态近似的菌落,通过比较细菌和放线菌的16srRNA基因序列,或真菌的18srRNA基因序列,进行分子鉴定(步骤参见附录C),排除重复的菌株 8.5常温菌分离常温菌分离步骤按8.4的规定进行,其培养温度为37C 8.6嗜热菌分离 8.6.1技术要求 8.6.1.1用固体培养基培养时,所用的湿盒(5.9)应每天加水或更换湿棉球用液体培养基进行培养时,瓶口应采用通气的硅胶塞代替纱布进行密封 8.6.1.2选用的固体培养基应采用高熔点琼脂粉,其浓度为8g/L 8.6.1.3细菌的分离筛选采用2216E培养基、,LB培养基和相应的寡营养培养基 8.6.1.4放线菌的分离筛选采用高氏一号培养基和相应的寡营养培养基 8.6.1.5真菌的分离筛选采用PDA培养基、YPD培养基和相应的寡营养培养基 8.6.2菌株分离步骤 8.6.2.1吸取500AL10-'样品稀释液[8.3.1a)]于培养基平板上,用涂布棒涂抹均匀 8.6.2.2将培养基平板装人湿盒中,置于高温培养箱中进行培养,培养箱温度应根据采样现场的温度和研究需要进行选择，一般在55C90C 8.6.2.3待形成菌落后,挑单菌落进行多次划线转接,根据平板上的菌落形态和颜色,以及镜检检测,直至获得纯的单菌落 8.6.2.4对形态近似的菌落,通过比较细菌和放线菌的l6SrRNA基因序列,或真菌的18SrRNA基因
GB/T30744一2014 序列,进行分子鉴定后(步骤参见附录C),排除重复的菌株 8. 资料处理将所分离的菌株来源、种类、培养条件等相关参数记录于深海微生物分离鉴定记录表(参见表A.2) 数据资料处理记录应按HY/T058的要求归档深海微生物基因组DNA提取 9.1总则本章规定了从深海微生物菌株中提取基因组DNA的方法,包括细菌,放线菌、真菌提取的工作程序包括;培养,裂解,提取、纯化 9.2技术要求 9.2.1基因组DNA应达到的指标为OD,/OD的比值应在1.8一2.0之间,且OD.n/OD.的比值应大于2.0. 9.2.2经10g/L琼脂糖凝胶(4.11)电泳检测,以入DNA/EcoRI十Hin川为分子量标记,所提的 DNA大小应与标记物中最大的一条带位置相近 9.2.3所提取的微生物基因组DNA以每管20Al~50L的体积分装于小离心管中,于一80C保存，不应反复冻融 9.2.4所用的小离心管、枪头均应灭菌,冷却后使用 9.3基因组NA提取 9.3.1细菌基因组DNA提取 9.3.1.1按照8.3.3确定菌株生长温度,挑取菌落接种人5mL相应的液体培养基中,培养至对数期,装人1.5mL小离心管中,用小离心机5000r/min离心5min,弃上清液,重复分批进行离心,将5mL培养液的菌体完全收集下来 9.3.1.2在收集后的菌体沉淀物中加人1.5mL.水,悬浮菌体,用小离心机5000r/min离心5min,弃上清液重复操作1次 9.3.1.3加人500Al1mL盐酸肌溶液(4.32),轻轻混匀后静置5min,直至菌液裂解清亮,加人等体积的酚/氯仿/异戊醇(4.31),混匀.13000r/min离心5min.将上层水相移人新管,在新管内缓慢加人等体积异丙醉醇,混匀后放置5min 9.3.1.413000r/min离心15s,吸去上清液,用乙醇溶液(4.14)洗沉淀物两次,放置超净工作台内吹干,加人200ALTE溶液(4.20),放置5min溶解沉淀 9.3.1.5加人2AlRNaseA贮液(4.39),37C水浴中酶解1h 9.3.1.6等体积加人异丙醇,再按10mL/L的比例加人Mg(Cl溶液(4.45),轻轻混匀,于一20C中放置30min 9.3.1.713000r/min离心5min.去除上清液,加人200L无水乙醇,放置3s一5s后弃去无水乙醇并重复1次,然后将沉诧物放置超净工作台内吹干后加人5TE游液，于一20C保存 9.3.1.8用分光光度计测定纯度如纯度达不到9.2.1中所列要求,应按9.4的规定采用凝胶回收方法进行进一步纯化 9.3.1.9用10g/1.琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA的大小,如未达到9.2.2中要求,应重新提取DNA 注;细菌基因组DNA可采用商用试剂盒提取 10
GB/T30744一2014 9.3.2放线菌基因组NA提取 g.3.2.1按照8.3.3确定菌株生长温度,挑取菌落接种人5ml相应的液体培养基中,培养至对数期,装人1.5ml.小离心管中,用小离心机5000r/min离心5min,弃上清液,重复分批进行离心,将5ml.培养液的菌体完全收集下来 9.3.2.2在收集后的菌体沉淀物中加人1.5mL水,悬浮菌体,用小离心机5000r/min离心5 ,弃 min 上清液重复操作1次 9.3.2.3往沉淀物中加人567LTE溶液,悬浮菌体沉淀,加人30LSDS溶液(4.33)和3l蛋白酶 K溶液(4.34),混匀,于37C水浴1h. 9.3.2.4加人100AlLNaCl溶液,充分混匀,再加人80AlCTAB溶液(4.36),混匀,于65C水浴 10min， ,加人等体积的酚/氧仿/异戊醉,充分混匀,13000r/min离心51 min 9.3.2.5将上清液转人新管中,如果难以移出上清液,先用无菌接种针除去界面物质,加人等体积的酚氯仿/异戊醇,充分混匀,13000r/min离心5 n,将上清液转人新管中 min, 9.3.2.6按等体积加人异丙醇,按10mL/L的比例加人MgCl溶液,混匀,于一20C中放置30 min 9.3.2.713000r/min 离心5min,去除上清液,加人200L无水乙醇,放置3s5、后弃去无水乙醇并重复1次,然后将沉淀物用放置超净台内吹干后加人50ALTE溶液,于一20C保存 9.3.2.8用分光光度计测定纯度,如纯度达不到9.2.1中要求,应按9.4的规定采用凝胶回收方法进行进一步纯化 9.3.2.9用10g/L.琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA的大小,如未达到9.2.2中要求,应重新提取DNA 注:放线菌基因组DNA可采用商用试剂盒提取 9.3.3真菌基因组DNA提取 9.3.3.1按照8.3.3确定菌株生长温度,挑取菌落接种人5ml相应的液体培养基中,培养至对数期,装人1.5mL小离心管中,用小离心机5000r/min离心5min,弃上清液,重复分批进行离心,将5mL培养液的菌体完全收集下来 9.3.3.2在收集后的菌体沉淀物中加人1.5ml.水,悬浮菌体,用小离心机5000r/min离心5min,弃上清液重复操作1次 9.3.3.3往沉淀物中加人0.5ml甘露醇缓冲液(4.24),悬浮菌体沉淀,加人20A蛋白酶K溶液和 20aL蜗牛酶溶液,混匀.于37笔水浴2h 9.3.3.410000r/min离心2nmin,弃上清液,往沉淀中加人0.5ml TE溶液,悬浮菌体沉淀,加人 20aLsDs溶液.混匀,于65C水浴1h 9.3.3.5加人0.2ml醋酸钾溶液(4.38),于0C中水浴1h,14000r/min离心10min,移取上清液至新的小离心管中 9.3.3.6等体积加人异丙醉,按10mL/1的比例加人MgCl，溶液,混匀,于一20C中放置30min 9.3.3.713000r/min离心5nmin,去除上清液,加人200AL无水乙醇,放置3s5、后弃去无水乙醇，并重复1次,然后将沉淀物放置超净工作台内吹干后加人50alLTE溶液,于一20C保存 9.3.3.8用分光光度计测定纯度,如纯度达不到9.2.1中要求,应按9.4的规定采用凝胶回收方法进行进一步纯化 9.3.3.9用10g/1琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA的大小,如未达到9.2.2中要求,应重新提取DNA 注真菌基因组DNA可采用商用试剂盒进行提取 9.4DNA凝胶回收 9.4.1将凝胶放在紫外透射仪(5.12)上将目的基因所对应的条带切下,称重 11
GB/T30744一2014 9.4.2每克条带加人3mLNal溶液(4.17),55C水浴至胶完全溶解 9.4.3加人5LSiica浆液(4.40),在0C水浴301 ,充分振荡数次 min， g.4.414000r/min离心20s,弃上清液 g.4.5加人400L凝胶回收洗涤液(4.23),充分悬浮沉淀物,l4000r/min离心20s,弃上清液重复步骤9.4.5一次,吸干液体,并放置于超净工作台内,进一步吹干残余液体 9.4.6 9.4.7 加人10lL水,55仑水浴5min后1400/min离心5nmin. 9.4.8吸取上清液至新的小离心管中,用分光光度计(5.l1)测定DNA含量,于一20C保存注;DNA凝胶回收也可采用商用试剂盒进行 9.5资料处理将所抛取的微生物种类,DNA浓度、,纯度等相关参数记录于深海微生物基因组DNA提取记录表见表A.3) 数据资料处理记录应按HY/T058的要求归档深海微生物宏基因组DNA提取 10 10.1总则本章规定了从深海沉积物、含菌滤膜,大型生物中提取微生物宏基因组DNA的方法工作程序包括;裂解、提取、纯化 10.2技术要求 10.2.1合格的宏基因组DNA应达到的指标为ODm/OD的比值应在1.82.0之间,且ODen/ OD.的比值应大于2.0 10.2.2用于构建Cosmid或者Fosnmid文库的宏基因组DNA大小经脉冲电泳检测后应在35kb 45kb之间 10.2.3用于构建小片段(小于10kb)基因文库的宏基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳检测,以入DNA EcoRI十Hin皿为分子量标记,所提的DNA大小应与标记物中最大的一条带位置相近 10.2.4用于宏基因组DNA提取的深海样品,宜采用-80C或液氮罐保存,不应采用常温保存 10.3样品前处理沉积物样品可直接用于提取宏基因组DNA,每次提取所用的沉积物量宜为2《一5x(煤重) 0.3.1 10.3.2将含菌滤膜(7.4.3)剪成约1cnm×1em的小片,浸泡于装有水的50mL小离心管中,充分振荡制成菌悬液,除去滤膜,菌悬液经8000r/min离心10min后除去上清液,加人1ml水将沉淀充分混匀 10.3.3虾,鱼、蟹等样品应首先在水中充分洗净,取其消化道组织,用水洗净外表,在解剖镜下剪开,浸泡于水中,用毛刷将消化道内部的附着物洗至水中,除去组织,将混合液经8000r/min离心10min后除去上清液,加人1nmlL水,将沉淀充分混匀 10.3.4管状蠕虫样品应先在超净工作台中去除外壳,用水洗净虫体,用灭菌后的剪刀剪开虫体,将虫体浸泡于水中,用毛刷将虫体内部的附着物洗至水中,除去虫体,将混合液经8000r/min离心10nminm 后除去上清液,加人1ml水,将沉淀物充分混匀 10.4宏基因组NA提取 10.4.1在处理好的样品(10.3)中加人5ml.DNA抽提缓冲液(4.4l),混匀,于37C,225r/min条件下振荡301 min 12
GB/T30744一2014 10.4.2加人1mLTE溶液和0.5mL溶菌酶贮液,继续振荡30min,加人0.5mLSDS溶液,65C水浴 30 min 10.4.36000r/min离心10min,将上清液移人新的小离心管 10.4.4往沉淀中加人5mlNA抽提缓冲液(4.22)和0.5ml.SDS溶液,65C水浴10min,6000r/min 离心10min,将上清液与10.4.2中的上清液合并于同一离心管中 10.4.5重复10.4.3步骤,将上清液与10.4.3中的上清液合并于同一离心管中 10.4.6测量合并后的上清液体积,加人RNaseA贮液至RNaseA的终浓度为2004g/mL,37C水浴 15min,等体积加人酚/氯仿/异戊醇,轻轻混匀,13000r/min离心15min,将上层水相移人新的离心管 10.4.7等体积加人异丙醇,于一20中沉淀1h,4C13000r/nmin离心10min,弃上清液 10.4.8加人200L无水乙醉,放置3;一5;后弃去无水乙醉,并重复1次,然后将沉淀物放置超净工作台内吹干后溶解于50l.TE溶液或水中,即为DNA粗提液,于-20笔保存 10.4.9DNA粗提液的大片段DNA(大于等于35kb)应采用10g/L低熔点琼脂糖凝胶(4.13)电泳检测,用琼脂糖酶(4.7)进行回收纯化 DNA粗提液的小片段DNA(小于35kb)按9.4的要求采用凝胶回收纯化注1:小片段DNA(小于35kb)也可用商用试剂盒进行纯化注2:宏基因组DNA也可采用商用试剂盒进行提取注3:琼胶糖酶回收纯化的方法可参见琼胶糖酶商品的说明书 10.5资料处理将所提取宏基因组DNA的来源、站位、大小、纯度、图谱等数据记录于深海样品宏基因组DNA提取记录表(参见表A.4) 数据资料处理记录应按HY/T058的要求归档深海生物样品及微生物资源保存 11 技术要求 111.1 深海生物样品、微生物菌株、,DNA资源的保存应有详细的记录,资源的共享应有人库、出库 111.1.1 记录同一菌株应选用两种或两种以上方式进行保藏只能采用一种保藏方法的菌株,DNA资源应备份并存放于两个以上的保藏设备中 1.1.4菌株应定期检查保藏效果,有污染或退化迹象时,应及时纯化分离、复壮,每次检查均应有详细记录 1.1.5微生物菌株和DNA资源的分离、提取,保存和分装等所有操作均应在无菌条件下进行 11.2深海生物样品保藏 11 1.2.1船上现场分样并按不同温度保存的沉积物样品,水样品,热液烟囱样品,在运输转移人样品库的过程中应保持温度不变,一80C保存的样品应采用干冰运输 11.2.2深海小型虾,鱼,蟹等样品应首先在无菌水中充分洗净,取含有微生物的消化道组织进行保存，保存时应加人的甘油溶液(4.18),使甘油的终浓度为150mL/L,于一80C保存 11.2.3样品出库时如需进一步分样操作,应在各自保存温度下进行 1.2.4保存条件应包括4笔、一20C、一80丫和液氮等四种在样品量较少的情况下,应优先保证 4C保存和一80笔保存的样品 13
GB/T30744一2014 11.3微生物菌种资源保藏 11.3.1定期移植法保藏 11.3.1.1适用范围本方法适用于大多数细菌和真菌的短期保存 1.3.1.2保藏培养基的配制 11.3.1.2.1有效时间空白斜面培养基应尽快使用,放置时间不应超过7d 11.3.1.2.2操作步骤 11.3.1.2.2.1选择所保存菌株的最适生长培养基,先在烧杯中放适量海水,按培养基配方称取各种材料,依次将缓冲化合物、主要元素,微量元素、维生素等材料加人水中溶解,最后加足水量,搅拌均匀,可加热溶解 1.3.1.2.2.2配料溶解后将培养基冷却至室温,根据要求用稀酸溶液或稀碱溶液调节pH至所需要的规定值,加酸或碱液时应缓慢,少量、多次搅拌,防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏 11.3.1.2.2.3将琼脂加人相应的液体培养基中,加热并不断搅拌至溶解,再补足所燕发水分,在二层纱布中间夹人脱脂棉,将配好的培养基趁热过滤并分装斜面培养基分装量应为玻璃试管高度的1/A 4mL一5mL),穿刺培养基分装量应为玻璃试管高度的1/2,玻璃试管加棉塞后,外面包扎一层牛皮纸或解简并注明培养基名称及配制日期,分装过程中培养基不应沾污到管口或棉塞上 11.3.1.2.2.4将制好的固体培养基经灭菌处理,及时摆放斜面,斜面长度不应超过玻璃试管管长的 1/2,将灭菌的固体培养基放人培养箱中作无菌检验,通常为30笔培养1d3d,无菌检查合格后将其保存于4下备用 11.3.1.3接种方式斜面接种 11.3.1.3.1 斜面接种分为以下几种点接;把得保藏幽种点接在斜面培养基中部偏下方处此方法适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌如毛霉、根霉等) b)中央划线;从斜面培养基中央自下而上划一直线此方法适用于细菌和酵母菌等稀波状蜿蜒划线法:从斜面培养基底部自下而上划之字形线此方法适用于易扩散的细菌,也适用于部分真菌密波状蜿蜒划线法;从斜面培养基底部自下而上划密之字形线能充分利用斜面获得大量菌体细胞,此方法适用于细菌和酵母菌等挖块接种法;挖取菌丝体连同少量培养基,转接到斜面培养基上此方法适用担子菌类真菌 11.3.1.3.2穿刺接种用接种针从待保藏菌种挑取少量菌体,从柱状培养基中心自上而下刺人,直到接近管底(勿穿到管底),然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针此方法适用于细菌和酵母菌等 14
GB/T30744一2014 11.3.1.3.3液体接种挑取少量待保藏菌种或用无菌滴管吸取液体待保藏菌种(接种量与接种体积比不超过100mL/L 接种于空白液体培养基中 1.3.1.4培养接种后的培养基放人培养箱中,在各菌株的最适生长温度下培养至细胞稳定期或得到成熟袍子 11.3.1.5保藏培养好的黄种于4C保存,相对湿度应为50%一70% 视菌株在培养基上的生长状况每两个月移植1次,菌种应保藏相继三代的培养物以便对照,防止因意外和污染所造成的损失 11.3.2液体石蜡法保藏 1.3.2.1适用范围本方法适用于不能分解液体石蜡的酵母菌,某些细菌(如芽抱杆菌属、醋酸杆菌属等)和某些丝状真菌(如青霉属、曲霉属等) 但以下细菌和真菌不应用此方法保藏,包括;固氮菌、乳杆菌,明串珠菌,分枝杆菌、红螺菌、沙门氏菌,布拉霉,丝枝霉,卷霉,小克银汉霉,毛霉、,根霉等属 11.3.2.2液体石蜡的准备 11.3.2.2.1选用液体石蜡(4.8),将其分装到玻璃试管中,加塞,并用牛皮纸包好,采用以下两种方式进行灭菌 a)灭菌处理,置40C恒温箱中干燥2h; 160C干热灭菌2h b 11.3.2.2.2将灭菌的液体石蜡冷却至室温,随机选取三管液体石蜡,无菌条件下用无菌吸管吸取少量液体石蜡滴人空白麦芽汁平板上,涂布后于30C条件下培养1d3d,检查无菌落长出后方可使用,如有杂菌长出则需重新灭菌 11.3.2.3灌注石蜡在无菌条件下将液体石蜡注人按11.3.1.3和11.3.1.4处理的斜面菌种上,液面高出斜面顶部1cn 左右,使菌体与空气隔绝 11.3.2.4保藏注人液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温(4C)干燥处保藏,保藏时间2年10年保藏期间应定期检查,如培养基露出液面,应及时补充灭菌的液体石蜡如发现异常应选新的斜面菌种按 11.3.1.4和11.3.2.3的规定处理后重新保藏 11.3.2.5恢复培养恢复培养时,挑取少量菌体转接在适宜的空白培养基上,生长繁殖后,再重新转接1次 1.3.3沙土管法保藏 113.3.1适用范围本方法适用于产弛类放线菌、芽抱杆菌、梭菌、曲霉属、青霉属及少数酵母如隐球酵母和红酵母等 15
GB/T30744一2014 1.3.3.2沙土管制备 1.3.3.2.1将河沙过0.3mm(60目)筛,弃去大颗粒及杂质,再过0.2mm(80目)筛,去掉细沙,用吸铁石吸去铁质,放人容器中用1mol/儿盐酸浸泡,如河沙中有机物较多应用2mol/L盐酸浸泡24h后倒去盐酸,用水洗泡数次至中性,将沙子烘干或晒干 11.3.3.2.2另取地面下40em~ 60cm非耕作层,贫瘠且黏性较小的土,研碎,过0.15mm(100目)筛水洗至中性,烘干 11.3.3.2.3将处理后的沙、土按质量比2:1混合,混匀的沙土分装人安瓶管(5.15)或玻璃试管中,高度 1cm,塞好棉塞,经高压灭菌锅中121C湿热灭菌30min随机选取三支灭菌好的沙土管,无菌条件下取少许沙土至LB培养基中,30C培养24h,检查无微生物生长后方可使用 11.3.3.3接种过程菌悬液制备 11.3.3.3.1 按11.3.1.3和11.3.1.4的要求培养待保藏菌种,如培养基为固体培养基则注人3ml一5ml.水,洗下细胞或袍子制成菌悬液如培养基为液体培养基,离心后弃去部分上清液,将菌体沉淀悬浮制成菌悬液 11.3.3.3.2接种用无菌吸管吸取菌悬液,均匀滴人沙土管中,每管0.2ml0.5ml.,用真空泵连续抽气3h一4h 加速干燥,用手轻拍可使沙土均匀散开则为完全干燥,放线菌和霉菌可直接挑取袍子拌人沙土管中 11.3.3.4保藏将沙土管用火焰熔封后存放于低温(4C)干燥处保藏,每隔半年检查1次菌种存活性及纯度,或将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好,置干燥器内保存,保藏时间2年10年 1.3.3.5恢复培养在无菌条件下打开保藏的沙土管,取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上,长出菌落后再转接1次或取沙土粒于适宜的液体培养基中,按11.3.1.3.3和1l.3.1.4的规定增殖培养后再转接斜面培养基 11.3.4冷冻干燥保藏 11.3.4.1适用范围冷冻干燥法保藏适用于大多数细菌,放线菌、病毒,噬菌体,部分丝状真菌和酵母菌等 -般要求 11.3.4.2 保护剂的种类,搭配,浓度及pH值应根据所保藏的菌种进行选择与配制 11.3.4.2.1 厌氧微生物冷冻干燥所用的保护剂在使用前应在100C的沸水中煮沸15min左有,脱气 11.3.4.2.2 后放人0C的冰水混合物中急冷 11.3.4.3常用保护剂及制备方法 113.4.3.1常用保护剂常用保护剂类型及种类包括以下几种 16
GB/T30744一2014 a酸性化合物:谷氨酸,天冬氨酸、苹果酸等 b)中性化合物;葡苟糖、乳糖,蔗糖、棉籽糖,山梨醉,木糖醇,肌醇等; 高分子物质及其分解物:白蛋白、明胶、各种陈,藻类; c d天然混合物;脱脂乳,血清等; 其他;抗坏血酸、组胺等 11.3.4.3.2脱脂乳的准备 11.3.4.3.2.1 直接采用牛奶作为保护剂时,按0.2g/L的浓度加人碳酸钙溶液煮沸20min30min,冷却至室温,3500r/min离心l0min,去除上层油脂分装后用常压或高压法灭菌,常压法在100C间歇高压法为用高压灭菌锅于16C灭菌20mn,取出后置于煮沸2次一3次,每次10min一30min C保温箱中培养24h做无菌检验,检验无菌后于4C保存 37 11.3.4.3.2.2将脱脂奶粉按0.2g/mL的比例加水溶解,然后用高压灭菌锅于116C灭菌15min~ 20min,灭菌后于37培养24h,检查是否灭菌彻底,检验无菌后于4C保存 11.3.4.3.3 血清的准备将30g葡萄糖溶于400ml牛血清中,用0.224m的滤膜过滤灭菌,备用 11.3.4.4冷冻干燥保藏操作步骤 1.3.4.4.1冷冻干燥宜选用安瓶管,清洗安瓶管时,先用0.65mol/L的盐酸浸泡过夜,然后用自来水冲洗3次以上,最后用水冲洗、浸泡至pH中性,然后干燥; 11.3.4.4.2在所保藏菌株的最适培养条件下,用液体培养基将细胞培养至静止期或成熟期,6000r/nmin 离心10min,收集菌体,弃去上清液,加人保护剂每毫升培养物加1mL2mL),将培养物与保护剂混匀,采用滴管直接将菌液滴人安瓶管或冻存管底部,注意不要溅污上部管壁,每管分装量0.1ml~ 0.2mL 若是球形安甄管,装量为半个球部; 11.3.4.4.3分装后用脱脂棉堵住安瓶管管口,分装时间尽量要短,最好在1h2h内分装完毕;对安瓶管进行预冻2h以上,温度达到一40左右,将预冻后的样品安瓶管迅速置于已充分预冷的冷冻干燥机样品舱内,按冷冻干燥机的操作说明完成冷冻干燥操作; 11.3.4.4.4确认冷冻干燥完毕后,缓慢打开放气阀,取出样品安瓶管,置于干燥器内备用,冷冻干燥时间一般为8h一20h.冷冻干燥判断已完全的指标如下 a)安管内冻干物呈酥松块状或松散片状; 真空度接近空载时的最高值; b 冷冻干燥机显示的样品温度与舱内温度接近; d)蒸水对照管中的水分已完全挥发掉; 从干燥器中取出冷冻干燥完全的安瓶管,在距管口5em左右用喷射火焰(喷灯,焊枪等)将安管拉细,然后将安管口连接到与真空安管泵相连的橡皮管上,打开真空泵,在真空条件下(一般真空度达到2.7Pa),用喷射火焰对准安瓶管细颈部加热熔封,熔封后的干燥管应采用高频电火花真空测定仪检测真空度 1.3.4.5保藏时间封口完全的冷冻干燥管应在4笔中避光保藏,保藏周期可超过10年 11.3.4.6指标检测每种菌株保存10管平行样,每两年随即抽取一支按1l.3.1.3和11.3.1.4的要求接种培养后,进行 17
GB/T30744一2014 存活、形态变异、杂菌污染的指标检测 1.3.4.7复苏方法先用乙醉溶液擦拭安瓶管的上部,将安瓶管顶部烧热,用无菌棉签沾水,在顶部擦一圈,使顶部出现裂纹,用刀或子颈部轻敲下已开裂的安甄管的顶端,用水溶解菌块,转移人新配制的液体培养基中按照所复苏菌株的最适生长条件进行培养 11.3.5低温冷冻保藏 11.3.5.1适用范围低温冷冻保藏方法适用于各类微生物 11.3.5.2低温冷冻保藏操作步骤 1.3.5.2.1选用安瓶管或螺旋口的塑料冻存管(5.16) 清洗安瓶管时,先用0.65mol/L盐酸溶液浸泡过夜,然后用自来水冲洗3次以上,最后用水冲洗,浸泡至pHH中性,然后干燥塑料冻存管用水浸泡冲洗干净,干燥后灭菌处理; 11.3.5.2.2在所保藏菌株的最适培养条件下,用液体培养基将细胞培养至对数生长期,与保护剂混匀无菌滴管吸取后滴人安瓶管或冻存管底部,不应溅污上部管壁,每管分装量0.1ml0.2mL,若是球形安瓶管,装量为半个球部;若为塑料冻存管,装量不应超过总体积的2/3 1.3.5.2.3用脱脂棉堵住分装后的安管管口,应在1h2h内分装完毕,预冻分装后的安瓶管或塑料冻存管,冷冻速度应控制在1C/min;温度达到一40C后,将预冻的样品安瓶管或塑料冻存管迅速置于液氮罐中,或于一80C保藏 1.3.5.3保藏时间 C保藏周期一般为1一2年液氮中保藏周期可为10年以上，一80o 1.3.5.4复苏方法从一80C保存或液氮中取出安瓶管或塑料冻存管,迅速放置在38C一40C温水中快速复苏并适当摇动90s,取出于室温中至完全溶解,在无菌条件下开启安瓶管或塑料冻存管,将管内保藏物接种至所复苏菌株的最适培养基上进行培养 11.4宏基因组文库资源保藏 11.4.1DNA保藏所提取的深海样品宏基因组DNA分装成每管20l一50Al,于一80C保藏,不应反复冻融保藏期限不应超过1年 11.4.2小片段宏基因组DNA文库构建及保藏 11.4.2.1适用范围小于35kb的宏基因组DNA适用于构建小片段(5kb10kb)宏基因组DNA文库,所用的载体可为表达载体,例如pET-GST,pET-His,pTrc-CKS,pLLPOmpA,pLLPSTII,pMBPP,pQE等 11.4.2.2DNA制备 1.4.2.2.1取54g10gDNA,加人90L水,混合均匀后分成两份,编号为A,B,每份为45AL,置 18
GB/T30744一2014 冰浴中 11.4.2.2.2在A管溶液中,加5AL.10倍Sau3AI酶(4.5)反应缓冲液,混匀取5个小管,编号15. 1号管取溶液9MLl,加lL.上样缓冲液,混匀,作为酶切时间为零的对照实验,置冰浴中在上述A溶液中,加2个单位San3AI酶,温和混匀,置37C水浴,分别于5min.10min.15min.20min取出游被 gy l,加1Al.上样缓冲液,混匀,置4C水浴,待样品取完后,用10g/儿琼脂糖凝胶进行电泳检测,所用分子量标准为入DNA/EcoRI十Hlinl皿,根据分子量标准的大小分析结果,观察5kb10kb范围内片段产量最多的管号,得到最适的酶切时间,一般最适的酶切时间宜为15min,应根据酶切预实验的时间,调整酶的加人量 11.4.2.2.3根据预酶切实验结果,确定合适的酶量,酶切时间,然后将B管溶液进行酶解反应反应结束后立即加人等体积异丙醉醇,并加人Mg(Cl，溶液至终浓度为10mmol/L,混匀,于一20C中放置 30min,13000r/min 1离心10min,DNA沉淀物用乙醉溶液洗3次,吸干乙醇,置超净工作台吹5 min 加10Al~15L.水溶解 1.4.2.2.4用Kleote酶(见4.6)酶切后的DNA进行半补齐反应,在小离心管中加人50ngDNNA沉诧物,?L.dATP(见4.9),2LdGTP(见4.10).5L.Kew酶反应缓冲液,5个单位Kenw酶,用水补足体积至50AL,在37反应3h 1.4.2.2.5半补齐产物用低熔点琼脂糖电泳检测,用琼脂糖酶回收5kb10kb的DNA片段注:上样缓冲液、反应缓冲液均为购买商品酶时的配套溶液 1.4.2.3载体DA酶切处理将载体的DNA用限制性核酸内切酶完全酶切,所用酶应视所用载体的多克隆位点序列进行选择应选择酶切后能产生-TC碱基末端的酶,例如BamHI(4.3)或SalI(4.4) 如所用载体中无该类酶切位点,应选取半补齐后能产生-TC碱基末端的酶 11 4.2.4电转化感受态细胞的制备 11.4.2.4.1从新鲜的琼脂板上挑取一个大肠杆菌单菌落,接种于50mLLB液体培养基中,37C, 250r/min振荡培养12h 11.4.2.4.2将两份25m的上述培养物分别接种到盛有500ml经37C预热的LB液体培养基中,于 37C,250r/min振荡培养,每隔20min测量一次600n处的OD值,当oD值达到0.4时,迅速将培 30 养物置于冰浴中15min min,不时缓慢摇匀直至完全冷却 1.4.2.4.3将细菌转移至已在冰上预冷的离心管中,4C下1000r/min离心15min,弃上清液,用 500nmlL 4C的水重悬沉淀 11.4.2.4.44C下1000r/nin离心20min,弃上清液,用30mL 4C的甘油溶液重悬沉淀，4C下 1000r/min离心20min,弃上清液,用1ml4C的甘油溶液重悬沉淀,4C下1000 r/min离心 20min，，缓慢倒掉上清液,吸去管壁上的残留液体,加1mL4C的GYT培养基(4.25)重悬沉淀 11.4.2.4.5用4C的GYT培养基稀释至600nm处OD值为0.81 1.4.2.4.6将40AL上述悬液转移到4C的电转化仪(5.17)的电击杯中(0.2cm间隙),检查电击时是否有短路现象,如果有,则剩下的细胞悬液用4C的GYT培养基洗一次,使细菌悬液的电导小于5mEg 再进行分装 1.4.2.4.7感受态细胞悬液按40AL/管的体积分装,保藏于一80C中备用需要用时,从-80c保存中取出,室温下完全融解后将管转移至冰上备用 11.4.2.5连接及文库构建 11.4.2.5.1在离心管中加人制备好的DNA,载体,连接酶、缓冲液,混匀后在16C下连接过夜,所用的 19
GB/T30744一2014 DNA和载体的摩尔比为(3:1)(10:1) 11.4.2.5.2将连接产物用电转化转人感受态细胞,转化条件应按照所用电转化仪的操作说明书设定，脉冲电击结束后,尽可能快地取出样品池，室温下加人1mlsocC培养基(4.26),将细胞在37 100r/min振荡培养1h 1.4.2.5.3取100L200AL培养液涂布于已预先涂布了40AlLX-gal贮液(4.42)和7LIPTG贮液(4.43)的含Amp的LB固体培养基平板上,放置于室温下,待培养基平板中的液体被完全吸收后,倒置培养基平板于37C培养,转化克隆应在12h16h内出现 11.4.2.6文库质量评估按式(1)进行文库质量评估,插人的外源片段大小按7.5kb计算,基因组片段大小按25kb计算 P值需达到90%以上方为合格 N=ln(1一P)/In(1一F 1 式中任意段DNA顺序在文库中出现的几率; 插人片段的长度与基因组片段长度的比值; 重组克隆总数 N 11.4.2.7文库的保藏将转化后的培养液进行涂布,每50AL培养液用水稀释成200L后涂布于含Amp的LB固体培养基平板上,放置于室温下,待培养基平板中的液体被完全吸收后,倒置培养基平板于37笔培养12h 6h将各平板上长出的菌落用含Amp的LB液体培养基洗下,按500l一管分装于小离心管,每管中加人115l.甘油溶液,混匀后于一80C保存 1.4.3大片段宏基因组DNA文库(大于或等于35kb)构建及保藏 11.4.3.1适用范围大于或等于35kb的宏基因组DNA可用于构建大片段宏基因组文库 11.43.2NA制备 1.4.3.2.1采用直径10m的微量注射器对深海微生物宏基因组DNA进行吸打,通过调整吸打次数来获得最佳大小范围的DNA片段,预实验的结果需通过PFGE进行DNA大小的验证根据预实验结果用微量注射器对深海样品宏基因组DNA进行吸打,并与花青素核酸染料混匀 11.4.3.2.2配制低熔点琼脂糖凝胶,设定脉冲场电泳仪系统(5.18)的相应运行程序;电压450V,脉冲时间0.8s,电流110 120mA,时间3h一4h mA 启动脉冲场电泳仪配套的电泳系统中的水浴循环仪,使水冷却至8.5C,倒人已预冷至 11.4.3.2.3 8.5C的TBE电泳缓冲液(4.44),保持电泳槽四壁通电处干燥在凝胶加样孔中加人已与花青素核酸染料混合的DNA样品,在相邻加样孔中加人试剂盒配套的分子量标准,将凝胶放人电泳槽内,启动水浴循环功能,打开高压电源和脉冲电场电源,运行预先设定好的程序,运行结束后,退出程序,关闭脉冲场电泳仪系统将低熔点琼脂糖凝胶从托盘上割下放置于保鲜膜上,并在可观察花青素核酸染料的凝胶观 11.4.3.2.5 察仪上进行观察,将30kb45kb之间的目的DNA胶条切割下来将含有目的DNA片段的胶条用TE溶液洗涤3次,移除上清液,用琼脂糖酶进行回收,将 11.4.3.2.6 所得的DNA溶解于50AL水中,用分光光度计测定DNA的浓度及纯度 20
GB/T30744一2014 11.4.3.2.7用末端补平酶对所获得的DNA片段进行末端补平,在25C下反应45 将反应液转移 min，至70C水浴10min 1.4.3.2.8然后加人100l无水乙醉、0.5ALMg(Cl 溶液,混匀后于-80C保存2h,用40l.水溶解沉淀物,用分光光度计测定DNA浓度 1.4.3.3宏基因组文库的构建参照附录D,将制备好的DNA与载体连接、包装,文库评估和保藏注，所用载体可为cosmid,Fosmid等各载体均有成熟的试剂盒,可按照试剂盒说明书操作,附录c给出了用 Epirentre公司的pwEB::TNCTMcosmidCloningKit构建宏基因组文库的步骤,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品 11.5资料处理 11.5.1数据资料处理记录应按HY/T058要求归档 1.5.2将所保藏的深海样品类型,来源,数量、出人库等信息整理记录于深海样品保藏记录表(参见表 A.5 1.5.3将所保存的深海细菌菌种,来源、保存方式等信息进行整理,将信息记录于深海细菌保藏记录表(参见表A.6) 1.5.4将所保存的深海放线菌菌种,来源、保存方式等信息进行整理,将信息记录于深海放线菌保藏记录表(参见表A.7) 1.5.5将所保存的深海真菌菌种,来源、保存方式等信息进行整理,将信息记录于深海真菌保藏记录表(参见表A.8) 11.5.6将所构建的宏基因组文库大小、所用载体,宿主菌,效率等信息整理记录于深海样品宏基因组 DNA文库记录表(参见表A.9) 21
GB/T30744一2014 附录A 资料性附录深海微生物样品前处理记录表格式表A.l一表A.9给出了深海微生物样品采集、提取、保藏记录表格式表A.1深海样品采样记录表第页页共海区: 船号: 航次: 站位采样方式采样时间采样器型号规格纬度经度沉积环境类型水深/mm 温度/ 盐度分样方式样品体积(水样样品重量沉积物样保存方式备注采样人记录人校对人表A.2深海微生物分离鉴定记录表第面页共菌株编号菌株来源培养基培养温度培养压力 22
GB/T30744一2014 表A.2(续第共页菌株种属 16SrRNA基因序列编号分离日期分离人鉴定日期鉴定人校对人表A.3深海微生物基因组DNA提取记录表第共页菌株编号菌株种属站位 DNA浓度 OD/2so OD. 260/23 电泳图谱提取日期备注提取人校对人表A.4深海样品宏基因组DNA提取记录表第页页共 DNA编号样品类型站位 DNA浓度 OD0/0 OD. 60/230 电泳图谱 DNA片段大小提取日期备油提取人校对人 23
GB/T30744一2014 表A.5深海样品保藏记录表样品类型站位数量保存位置采集日期人库日期日期数量取用人经手人样品用途出样品使用成果记日期录数量取用人经手人样品用途样品使用成果表A.6深海细菌保藏记录表基本信息菌株保藏编号采集地学名分离基物中文名称培养基收藏时间培养温度,pH等条件保存方式生物危害程度 16srRNA基因序列号分离人鉴定人功能特性 2
GB/T30744一2014 表A.6(续特征特性信息形状,大小菌落形态芽袍,荚膜菌落质地表培体运动性菌落颜色型形养态菌落大小鞭毛息特革兰氏染色反应其他培养特征征其他形态特征其他信息菌落形态图细胞形态图表A.7深海放线菌保藏记录表基本信息菌株保藏编号采集地学名分离基物中文名称培养基收藏时间培养温度、pH等条件保存方式生物危害程度分离人 16SrRNA基因序列号功能特性鉴定人特征特性信息菌落形态基内菌丝大小有无横隔,是否断裂表面状况直径大小颜色袍囊形状气生菌丝基丝颜色个表体有无气生菌丝可溶性色素型形直径大小其他态颜色抱子特征抱子着生方式抱子形状袍子丝袍子表面特征形态抱囊颜色抱囊特征其他特征形态描述所用培养基 25
GB/T30744一2014 表A.7(续特征特性信息所用的培养基在培养基上生长状况与颜色表培气丝型养物基丝征息可溶性色素其他培养特征其他信息菌落形态图细胞形态图菌丝形态图表A.8深海真菌保藏记录表基本信息菌株保藏编号采集地学名分离基物中文名称培养基收藏时间培养温度、pH等条件保存方式生物危害程度 16srRNA基因序列号分离人鉴定人功能特性特征特性信息菌落形态菌丝形态产袍特征培养温度最高 ;最适 ;最低培养pH 最高最适最低生长速度生理生化特征特殊遗传标记其他信息菌落形态图细胞形态图菌丝形态图 26
GB/T30744一2014 表A.9深海样品宏基因组DNA文库记录表编号 NA来源所用载体插人片段大小文库滴度总克隆数保存的单克隆数构建日期构建校对人 27

深海微生物样品前处理技术规范GB/T30744-2014解读

深海微生物是指分布在深海海底或水体中的微生物种群，具有很高的生物多样性和生态重要性。在深海微生物研究中，样品前处理是研究的关键环节。因此，制定一套标准的深海微生物样品前处理技术规范对于研究具有重要意义。

GB/T30744-2014原则与应用范围

GB/T30744-2014主要包含以下内容：

深海微生物样品的采集、传输、处理及保存方法；
样品前处理过程中的试剂、仪器设备的选择和使用；
样品前处理过程中应注意的事项和注意事项。

该技术规范适用于深海微生物样品的前处理过程，旨在规范深海微生物研究中的样品前处理操作，保证研究数据的可靠性和准确性。

GB/T30744-2014内容解析

GB/T30744-2014在深海微生物样品前处理过程中，提出了以下要求：

采集：采集深海微生物样品时应注意避免污染。采集后，样品应尽快进行处理。
传输：样品在传输过程中应避免受到辐射、高温等影响。
处理：样品处理过程中应根据实验目的选择合适的方法，注意避免污染和误差。
保存：样品保存应注意避免冻融循环，以免影响样品质量。
试剂与仪器设备的选择与使用：在样品前处理过程中，应选择质量可靠的试剂和仪器设备，并根据实验需要进行合理使用。
注意事项：样品前处理过程中，应注意操作规范，避免误差的发生。

在GB/T30744-2014标准的指导下，深海微生物样品的前处理技术能够规范化、标准化地进行操作，从而保证了研究数据的可靠性和准确性。同时，该技术规范也为深海微生物研究提供了一份科学、严谨的参考标准。