国家标准 GB/35900.3一2018 动物流感检测第3部分:H1和H3亚型流感病毒核酸双重荧光RT-PCR检测方法 -Part3:Methodofduplexreal-timeRT-PCRfon Animalinfluenzadetection thedetectioofH1andH3subtypeinfluenzavirus 2018-02-06发布 2018-09-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T35900.3一2018 引言本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,可能涉及到本文件4.1.8与“H1和H3亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测引物和探针序列”相关的专利的使用本文件的发布机构对于该专利的真实性,有效性和范围无任何立场该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他愿意向任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案相关信息可以通过以下联系方式获得专利持有人:北京出人境检验检疫局地址:北京市朝阳区甜水园街6号请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任
GB;/T35900.3一2018 动物流感检测第3部分:H1和HH3亚型流感病毒核酸双重荧光RI-PCR检测方法范围 GB/T35900的本部分规定了同时检测H1和H3亚型流感病毒核酸的双重荧光RT-PCR操作方法本部分适用于禽和猪及其产品中H和H3亚型流感病毒核酸的检测规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19438.l一2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 GB19489实验室生物安全通用要求缩略语下列缩略语适用于本文件荧光RT-PCR实时荧光反转录聚合酶链反应(realtinmereversetranscriptpolymerasechainre- action BHQ1 无荧光淖灭基团(blackholequencher-1) C(或Cp)值每个反应管内的荧光信号量达到设定的值所经历的循环数(eyelethreshold,or erossingpoint cRNA RNA 互补RNA(complement DEPC 焦碳酸二乙酯(diethylpyroearbonate FAM oxyluorescein 叛基荧光素(carbo 血凝素(hemagglutinin) " 六氯-6-甲基荧光素(hexachlorofluorescein N 锁核酸(loekednucleicacid) MGn 小沟结合物(minorgroovebinder) PBs 磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline" RNA 核糖核酸(ribonucleicaeid) 试剂和材料 4.1试剂 4.1.1总则:除非另有说明,所用试剂均为分析纯,所用液体试剂均需使用无RNA酶的容器进行分装
GB/T35900.3一2018 4.1.2TRIzol;2C25C保存 4.1.3氯仿;2C8C预冷 4.1.4异丙醇一20C预冷 4.1.5DEPC水;见附录A中A.1 4.1.675%乙醉,用新开启的无水乙醇和DEPC水配制一20C预冷 4.1.7Ps(含牛血清白蛋白,青霉素和链霉素);配方见A.2. 4,1.8引物和探针序列及反应液配方,见附录B. 4.1.9阳性对照为灭活的H和H3亚型动物流感病毒混合液,或Hl和H3亚型流感病毒HA基因体外转录cRNA混合液;阴性对照为已知流感病毒阴性的禽或猪组织悬液 4.2仪器设备及耗材 4.2.1荧光PCR检测仪及配套反应管(板. 4.2.2高速台式冷冻离心机(最高离心速度不低于12000r/min) 4.2.3台式离心机 4.2.4振荡器 4.2.5组织匀浆器 4.2.6冰箱(2C~8C和一20两种). 4.2.7微量移液器(5AlL10AL、,100L、1000L)及配套吸头(无核酸酶) 4.2.81.5m .离心管(无核酸酶)和5ml.采样管 5 实验室的标准化设置与生物安全管理本方法的实验室设置与管理见G;B/T19438.1一2004附录C;实验室生物安全管理见GB19489 6 样品的采集与前处理 6.1总则采样过程中样本不得交叉污染,采样及样品前处理过程中应戴一次性手套 6.2采样及处理工具 6.2.1采样专用商品化棉拭子,剪刀、锻子,研钵,5mL采样管、一次性采样袋 6.2.2除棉拭子和采样袋外，上述取样工具应经121C士2C,15min高压灭菌并烘干或经160C干烤 2h 6.3样品采集 6.3.1拭子样品活动物采集拭子样品根据动物种类可采集咽喉拭子、泄殖腔拭子禽类)或鼻拭子(猪) 采集方法如下取咽喉拭子时将拭子深人喉头及上颗裂来回刮2次一3次并旋转,取分泌液; -取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便; -取鼻拭子时将拭子深人鼻腔来回刮2次~3次并旋转,取分泌物将采样后的拭子放人盛有2.0mLPBs(含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素)的采样管中,编号
GB;/T35900.3一2018 6.3.2组织样品病死动物采集肺脏或气管等组织用无菌剪、锻采集待检组织,装人一次性采样袋或其他灭菌容器,编号 6.4样品贮运样品采集后置保温箱中,加人预冷的冰袋,密封,24h内送实验室 6.5样品处理 6.5.1拭子样品样品在振荡器上充分混合后,将拭子中的液体挤出,3000r/min 离心5min,吸取上清液1.0ml转人无菌的1.5mL离心管中,编号备用 6.5.2组织样品用无菌的剪刀和镀子剪取待检样品2.0g于研钵或组织匀浆器中充分研磨,再加10.0ml.PBS(含 S 牛血清白蛋白、青霉素和链霉素)混匀,3000r/min离心5min后,取1.0ml.上清液转人无菌1.5 m 灭菌离心管中,编号备用 6.6样品存放采集或处理好的样品在28C条件下保存应不超过24h;若需长期保存,应放置一70C冰箱但应避免反复冻融(冻融不超过3次) 操作方法 7.1样品核酸提取 7.1.1在样本制备区进行,采取TRRIzol裂解法提取;也可采用其他等效的RNA提取方法 7.1.2待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示,取n个灭菌1.5mL离心管,逐管编号 7.1.3每管加人600L.TRlol. 7.1.4每管对应编号分别加人200L待检样品、阳性对照或阴性对照,混匀 715 每管加人200L氯仿,充分颠倒混匀于4、12000r/min离心15” min 7.1 新取"个灭菌的1smL离心管,逐管编号.每管加人300异丙(一2七预冷 7.1.7吸取本标准7.1.5各管中的上清液500L..转移至7.1.5相应的管中,避免吸出中间层,颠倒混匀 7.1.8于4、120001 1离心15min,轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,沥干液体,不同样品应在吸 r/min 水纸不同地方沥干 7.1.9每管加人600AL.75%乙醇(一20笔预冷),颠倒洗涤 7.1.10于4C、12000r/min离心l0min,轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,沥干液体,不同样品应在吸水纸不同地方沥干 7.1.11400r/min离心10s.将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量移液器尽量将其吸干注意一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面 7.1.12室温干燥3min 不宜过于干燥,以免RNA不溶 7.1.13每管加人11lALDEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000r/min离心5s,获得RNA溶
GB/T35900.3一2018 液,冰浴保存备用(4C保存不超过8h,若需长期保存应放置一70C冰箱》 7.2扩增试剂的准备与配制 7.2.1反应混合物配制区进行 7.2.2每个检测反应体系需使用40L荧光RT-PCR反应液根据7.1.2中提到的"值,按表B.2配制反应液,充分混匀后分装,每个反应管40L 转移反应管至样本制备区 7.3加样 7.3.1在样本制备区进行 7.3.2在上述7.2.2的反应管中分别加人7.1.13中制备的RNA溶液10AL,使每管总体积达到50L 记录反应管对应的样品编号盖紧管盖后,瞬时离心 7.4荧光Rr-PCR反应 7.4.1在检测区进行 7.4.2应使用能采集并区分FAM和HEX这两种不同荧光信号的多通道荧光PCR仪 7.4.3将7.3.2中加样后的反应管放人荧光PCR检测仪内,编辑样品表后,选定FAM检测通道读取 H3亚型流感病毒核酸的检测结果,并选择MGB无荧光淬灭基团;选定HEX检测通道读取H1亚型流感病毒核酸的检测结果,并选择BHQ1作为无荧光淬灭基团反应参数设置如下: 第一阶段,反转录42C/30min; 第二阶段,预变性94C/3min; -第三阶段,94/15s,50C/10s,60C/35s,40个循环,在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光试验结束后,根据收集的荧光曲线和C(或Cp)值判定结果 8 结果判定 8.1结果分析条件设定值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以闵值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准 8.2实验成立的条件 8.2.1阴性对照两个检测通道均无C'(或Cp)值并且无扩增曲线 8.2.2阳性对照两个检测通道均出现典型扩增曲线(参见附录C),且C'(或Cp)值均应<30 8.2.3如阴性和阳性对照不满足以上条件,此次试验视为无效 8.3结果描述及判定 8.3.1阴性两个检测通道均无C(或C)值并且无典型扩增曲线,表示样品中无H1亚型和H3亚型流感病毒核酸 8.3.2双检测通道阳性两个检测通道出现两条对应的典型扩增曲线,且C(或Cp)值<30,表示样品中同时存在Hl亚型和H3亚型流感病毒核酸
GB;/T35900.3一2018 8.3.3单检测通道阳性如仅FAM检测通道出现典型扩增曲线,且C'(或Cp)值<30,而HEX检测通道无C(或Cp)值并且无扩增曲线,表示样品中存在H3亚型流感病毒核酸,但不含有H亚型流感病毒核酸如仅HEX检测通道出现典型扩增曲线,且C(或Cp)值<30,而FAM检测通道无C(或Cp)值并且无扩增曲线,表示样品中存在Hl亚型流感病毒核酸,但不含有H3亚型流感病毒核酸上述结果描述及判定可参见表1 表1结果描述与判定 FAM检测通道 HEx检测通道结果描述判定阳性阳性同时存在Hl亚型和H3亚型流感病毒核酸阴性阳性存在H3亚型流感病毒核酸,但不含有Hl亚型流感病毒核胶阴性阳性存在Hl亚型流感病毒核酸,但不含有H3亚型流感病毒核酸阴性阴性无Hl亚型和H3亚型流感病毒核酸 8.3.4有效原则任一检测通道的C(或Cp)值>30,且出现典型扩增曲线的样品建议复检复检仍出现上述结果的,判相应检测通道的流感亚型为阳性,否则判为阴性
GB/T35900.3一2018 附录 A 规范性附录) 溶液配制 DEPC水配方 A.1 将DE:PC加人去离子水(符合GB/T6682要求)中至终浓度为0.1%体积比),充分混合均匀后作用12h,分装,121C土2C高压灭菌30min.冷却后冷藏备用 A.2磷酸盐缓冲液(Ps)配方(含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素) A.2.1A液 0.2mol/儿磷酸二氢钠水溶液:NaHPOH.O.7.6g,溶于燕僧水中,最后定容至1000mL A.2.2B液 0.2mol/儿磷酸氢二钠水溶液Na,HPO 7H,O53.6g或NaHPO12H.,O71.6g或 NaHPO2H.035.6g),加蒸水溶解,最后定容至1000mL A.2.30.01mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)(含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素)的配制取A液14mL,B液36mL.,加NaCl8.5g,牛血清白蛋白5g,用蒸僧水定容至1000ml 经过滤除菌后,无菌条件下分别按10000U/mL加人青霉素和链霉素
GB;/T35900.3一2018 附录 B 规范性附录引物探针序列及荧光RI-PCR反应液配方引物探针序列 B.1 H1和H3亚型流感病毒核酸双重荧光RT-PCR检测方法所用的引物探针序列见表B1 表B.1引物探针序列引物或探针名称序列(5'-3) 基因组位置检测粑基因 H1上游引物 l617nt~l636nt CAGATTY'TGGCGATCTAYTC GAcccATTAGARCACATcCAG 1688nt~1708nt H1亚型流感病毒HA基因 H1下游引物短探针 [HEx]ccccAGcG.AGAc[BHQ1] Hl1INA 1665nt~1676nt H3上游引物 TGGATTTcMTrYGccATATcAT l597nt~1618nt H3下游引物 GCAAATGTTGCAYCTRATRTTG l674nt~1695nt H3亚型流感病毒HA基因 H3MGB短探针 [FAM们TGGCARGcCCACAT[MGB 654nt~1667nt 注1:Hl和H3的上游、下游引物均为简并引物,Hl短探针为LNA修饰的荧光素双标记短探针,斜体加粗字母表示该碱基用LNA进行修饰;H3探针为MGB修饰的短探针注2:引物和探针可由生物公司合成,纯度为HPLC级,用DEPC水溶解并稀释至终浓度10mol/I,-20保存备用注3引物探针是根据已发布的毒株序列进行设计,H1引物探针的基因组位置参考毒株A/swine/Jiangsu/s16/" 2011(HlN1)HA序列(GenBank登录号JF820285);H3引物探针的基因组位置参考毒株A/Swine/Minne ota/593/99(H3N2y 序列(GenBank登录号AF251427.2) HAN B.2荧光RT-pPCR反应液配方 H和HH3亚型流感病毒核酸双重荧光RT-PCR反应液配方见表B.2 表B.2荧光RT-PCR反应液配方 1个检测体系的加人量组分 5×RT缓冲液 10.0l. MgCl,25mmol/L 4.0L dNTP(2.5mmol/L 2.,0 H1上游引物(10Mmol/L 2.0A Hl下游引物(104mol/L 2.0Al H1lNA短探针(10mol/L 1.5Al H3上游引物(104mol/L) 2.0Al
GB/T35900.3一2018 表B.2(续组 1个检测体系的加人量下游引物(10nmol/ H3 1I 2.04l. 7 H3NGB短探针0m/L AL 1.0Al M-M1V反转录酶(200U/gAl) RNA酶抑制剂(40U/al 0.5Al Ta酶"(5U/AL) 0.5wL DEPC水 l1.0L 5×RT缓冲液的组成为375mmol/L.KCl、15mmol/1MgCl、50mmol/LDTT、250mmol/1Tis-HClpH8.3. 25 Ta酶,具有5'--3'外切活性 B.3注意事项在检测过程中,应严防不同样品间的交叉污染反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器
GB;/T35900.3一2018 录附 C 资料性附录典型扩增曲线示意图 H和H3亚型流感病毒核酸双重荧光RT-PCR检测方法阳性和阴性典型扩增曲线见图c.1 4.300E+ HEX通道 3.800E+ H亚型阳性 3.300E FAM通道 2.800E- H3业型阳性 8.000 阴性 2o 30 35 扩增循环数图c.1H1和H3亚型流感病毒核酸双重荧光RT-PCR典型扩增曲线示意图

动物流感检测第3部分：H1和H3亚型流感病毒核酸双重荧光RT-PCR检测方法GB/T35900.3-2018

一、什么是H1和H3亚型流感病毒？

H1和H3亚型流感病毒是流感病毒的两种亚型，都可以感染人类和动物。这两种亚型的流行程度有时会随季节、地区和年龄而异。

二、什么是核酸双重荧光RT-PCR检测方法？

核酸双重荧光RT-PCR检测方法是一种基于RNA特异性PCR扩增技术的检测方法。该方法可以高度特异性地检测目标病原体的RNA，同时通过对特定探针的荧光检测，实现对扩增产物的定量和鉴定。

三、GB/T35900.3-2018是什么？

GB/T35900.3-2018是我国农业部制定的“动物流感检测技术规范”的第三部分。该部分详细描述了H1和H3亚型流感病毒核酸双重荧光RT-PCR检测方法的操作步骤、试剂盒配制、质控要求等方面的内容。

四、好的，我会记得结尾加上“