常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法

常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法

国家标准 GB/T38164一2019 常见畜禽动物源性成分检测方法 实时荧光PCR法 dentifieationofanimalingredientfrommeommonlivestoekandpoultry Real-timmePCR 2019-10-18发布 2019-10-18实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/38164一2019 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口 本标准起草单位:检验检疫科学研究院、大连海关、青岛海关、上海海关、沈阳海关 本标准主要起草人:陈颖、韩建勋、郑秋月、高宏伟、张舒亚、王妙、孙敏、邢冉再、张九凯、邓婷婷 王金玲、徐君怡
GB/38164一2019 常见畜禽动物源性成分检测方法 实时荧光CR法 范围 本标准规定了常见畜禽动物源性成分的实时荧光PCR检测方法 本标准适用于肉及加工品、内脏、乳、动物饲料中黄牛、耗牛,水牛、绵羊、山羊,猪、骆驼、马鹿、梅花 鹿、驯鹿、兔,狗、鸡、鸭、鹅、鹌鹑将鸽子、火鸡,猫、狐狸、水貂、骆、鼠物种成分的Taqman探针实时荧光 PCR定性检测 检出限(L.OD)1%(质量分数) 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 GB/T34796水溶液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法 GB/T35918动物制品中动物源性检测基因条码技术Sanger测序法 术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1.1 实时荧光PCRreal-timeCR 在PCR反应体系中加人荧光基团,通过荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程 3.1.2 Ct值eyelethreshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的值时所经历的循环数 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件 8 ATP8;ATP合成酶亚基8(ATPsynthasesubunit COI;细胞色素C氧化酶亚基I(CytoechromeCoxidase I！ CTAB;十六烧基三甲基澳化铵(Cetyltrithylammoniumbromide Pcb rromeb yb;细胞色素b(Cyto DNA;脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleieacd Dloop:D环区(Displacementloopregion) EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid)
GB/T38164一2019 ttetraaceticaciddisodiumsalt Na-EDTA乙二胶四乙酸二纳(Ehylencdiamne ND1;烟酰胺腺喋岭二核苷酸氧化还原酶亚基1(Nicotinamideadeninedinueleotideoxidoreductase subunit1 TuqDNA聚合酶.耐热DNA聚合酶(TanDNApalymstne Se Tris;三胫甲基氨基甲婉(Trishydroxymethyl aminomethane 原理 通过物种特异性引物及探针进行畜禽动物源性成分的实时荧光PCR扩增,根据PCR扩增反应中 每一个循环产物荧光信号进行判定,实现对常见畜禽动物源性成分的定性检测 5 检测用引物和探针 内参照引物探针序列和常见畜禽动物特异性引物探针序列见表1 表1引物探针序列 列 基因来源 目标物种 序 F;TcTGcccTATcCAAcTTTcGATGGTA 内参基因 R:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 18SrRNA基因 P;5'FAMCCGTTTC'TCAGGCTcCCCTC'TCCGAATCGAACC-3'TAMRA F;TGGAGTAATcCTTcTGcTcACAGT 黄牛 R:TGACTGTTG(CTCCTCAGAATGATA cyb基因 P;5'FAM-AGCATTTATAGGATACGTCC-3'MGBNFG F:GAcTAATATTcGAAAATcc 耗牛 R;CTCCTAGGAGGGAGCCGAAGTTTCAC cyb基因 P;5'FAM-CAAcGCATTCATTGAccTTcCAGCTcCAT-3'TAMRA F;TTcATTGAYcTCccTGCTcc 水牛 R:GGAATAGGCCGGTGAGGATT ATP8基因 P:5'FAM-ACTTTGGCTCTC'TCC-3'MGBNFG F;ATTcTTTGCcTTCcCAcTTcA 骆驼 R:AGCGTATGCGAATAGGAAAT cyb基因 P:5'FAM-CCTACAC(GAAACAGGC'TCTAATAACCCGAC-3'TAMRA F:ccTAccAccGAAGCAATAG;TGG 梅花鹿 R:GGTGCACTCTCAATAACTTCTGAGA COI基因 P;5'FAM-CAcTGTAGCTACTCAAGAAGC3'TAMRA F;TAG;TTATGTAAACcAAGAcTG 马鹿 R:ATAGACTGTAGTAGCAAGGAA 12SrRNA基因 P;5'FAM-AGGACTTGGCGGTGCTTTAT-3'TAMRA F;cTcCcAGTACGAAAGGAcCA 驯鹿 R:GGGCGGGATATGTTTGTGTA 16SrRNA基因 P;5'FAM-CCAACTTTAATCAAGCGCCT-3'TAMRA
GB/38164一2019 表1(续 目标物种 序 列 基因来源 F:TGGAGTAATcCTcCCTGCTC 山羊 R;(GGATTGCTGAAAGAAG,ATTA eyb基因 P5'FAM-CATAGGcTATG;TTTTAcCATGAG;3'TAMRA F:CGGAGTAATCCTCCTATTTGC 绵羊 RCTAGGCTTGTGCCAATATATGGA cyt基因 P5'FAM-TATTAcCAAccTccTTT-3'MGBNFG F.GA AACCCCTCAACGTACT 鸽子 R:ACCTCCTCGTCGATATGGACTC 16SrRNA基因 P5'FAMccccTcAAcGTAcTAAcAGTAAccAGACc-3'TAMRN F:GGCCACACAAATCCTCACAG 鸭 eytb基因 P;5'FAMc(CTAcTGGcTATGcACTACAccGcAGAc-3'Eclpse F:CCACCGCGAATCCTCAAT 鹅 R;TCT TTGGAGGATTTG:TTCTC 16SrRNA基因 ;kcccTccrcGATATTTTT?'Edlinpe P5'FAM-CCATCGCAG F:GGATCACTTTGCCCACTTTAA 鹌鹑 R:GGGTGACGGGCGGTATG 12SrRNA基因 \c8'Ealipse P5'FAM-ATGGCCCTGAGGC F;GCTTCAATCCTCTATTTCATAA 水貂 R:GCTTCTTCCTTGAGTCTTA cytb基因 P5'FAM-C CTcCTAGTCTTcATGccAATcGT3'Eelipse F:CTGCTGTCTTACTACTTCTA 猫 R:GGTG;TTTAGGTTTcGAT COI基因 P.5'FAMcAcTTccAGTcTTAGcAGccG3Ealipe F:TAATCGTCACCGCACATGCC 兔 R:CTATGTCAGGAGCCCCAATTATCA COI基因 月,;TAM.AcAccAGrTtGiAcrcA了'Eaine F:ATCTACATGATTCATTACAATTAC 猪 RCTATGTTTTTGAGTTTTGAGTTCA ATP8基因 AAAcTAcTcATAcccA3'TAMRN P5'FAM-ATCTCAA F;TCCAGGTAAACCCTTCTTCCC 狗 R:TTACGAGCAAGGGTTGATGGT！ Dloop基因 P,5'FAM-ATCACTTAG;TCcA ATA.AGiG3MciBNRCG F:TGGAGCATCAGTAGACCTTACAATTT 狐狸 R:GGcGGGAGGTTTTATATTGATAATAG coI基因 P.5'FAMcccTGcAccTGGccGGAGTc3'TAMRN F;AATCTTGCCTGGGT'TTGGAA 貂 R:CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA COI基因 P,5'FAMcATACTAcTccGGGAAAA3'MGBNFG
GB/T38164一2019 表1续 目标物种 序 基因来源 F:CCCTCCTCCTTTCATCCTCAT 鸡 R:GTCATAGCGGAACcGTGGATA ND1基因 P;5'FAM-CTATGAATccGGGCcTC-3'TAMRA F.GcccTAAccccTTAAGAAAAGAAT 火鸡 R;A(GTTGCTATGGCTAAGTCAAGTTTACAC 12SrRNA基因 P;5'FAM-CTTGcTTG;AGcCACAcc3'MGBNFG F:CCG;CCCAATCACCCAAA 鼠 R;(GCCTCCGATTCATGTTAAGA cyt/基因 P;5'FAM-TAcTG;AATYcTAG;TAGcCAAccT-3'MGBNFG 注F代表上游引物;R代表下游引物;P代表探针 6 试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯 试验用水符合GB/T6682中一级水的要求 三叙甲烧 6.1 6.2异丙醇 6.3无水乙醇 6.4氢氧化钠溶液(10mol/L);在160mL双蒸水中加人80.0g氢氧化钠(NaOH),溶解后,冷却至室 温,再加双蒸水定容至200ml 6.5Na-EDTA游液(GS00mmal/L,piH8.0);称取18.b区Na-EDTA,加人70ml双燕水中再加人适 量氢氧化钠溶液(6.4),加热至完全溶解后,冷却至室温,用氢氧化钠溶液(6.4)调pH至8.0,加双燕水定 容至100mL 在103.4kPa(121)条件下灭菌20min. 6.6Tris-HCl溶液(1 mol/L,pH8.0);称取121.1gTris溶解于800ml 双燕水中,用HCIl调pH至 8.0,加双蒸水定容至1000ml 在103.4kPa(121)条件下灭菌20min 6.7cTAB提取缓冲液(pH8.0)称取4.0gcTAB.,l6.364gNaCl,加人20ml1mol儿TisHcl游 液pH8.0)6,6),8ml.500 Na--EDTA溶液(pH8.0),先用70ml 双蒸水溶解，再定容至 200ml,在103.4kPa(121C)条件下灭菌20min 6.8CTAB沉淀液;称取1.0gCTAB.,0.467gNaCl,先用70ml双蒸水溶解，再定容至200ml,在 103.4kPa(121C)条件下灭菌20min 6.9蛋白酶K(670U/mL);称取0.10只酶活为33.5U/mg(Unit,酶学单位)的蛋白酶K干粉,加人 5mL双蒸水,轻轻摇动,直至蛋白酶K完全溶解,分装成小份贮存于一20C 6.10PCRMasterMix(2×),也可用等效的实时荧光PCR预混液 仪器设备 7.1实时荧光PCR仪 7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 7.3恒温水浴锅 7.4离心机:离心力>12000g
GB/38164一2019 7.5pH计:0.01级 7.6天平;:感量0.1g,0.01g,0.001g 检验步骤 8.1样品前处理 8.1.1 总则 对样品进行前处理,处理后的样品分成三等份,包括待检样品、复检样品和留存样品 8.1.2固体样品 依次用70%乙醇和双蒸水冲洗2次3次,收集到干净50ml离心管或干净密封袋中,-20C以 下冻存 半固体、液体样品 8.1.3 混匀后直接分装到干净50mL离心管或干净密封袋中,一20以下冻存 8.2DNA提取 按照GB/T35918的方法提取 也可用等效DNA提取试剂盒提取DNA 8.3DNA浓度和纯度的测定 按照GB/T34796方法测定并计算DNA的浓度,判定DNA和纯度 注实测荧光RCR扩增试验前,宜将DNA浓度稀释至5ng/l一50ng/L范围 8.4实时荧光CR扩增 检测过程中设置阳性对照、阴性对照和空白对照 用含目标成分的样品或含目标片段的阳性质粒作为阳性对照,以不含目标成分的样品或不含目标 片段的阴性质粒作为阴性对照,以双蒸水为空白对照 样品和对照设置2个平行的反应体系,分别进行靶向基因和内参基因扩增,以ct平均值作为最终 结果 反应体系的体积为25L,体系组成见表2,反应参数见表3 表2实时荧光PCR反应体系组成 试剂名称 终浓度 体积/l PCRMasterMix(2×) 12.5 上游引物104mol/L 200nmol/L 0.5 下游引物10Amol/L 200nmol/L 0.5 探针(10Mmol/L) 200nol/1 0,5 DNA模板(5ng/L一50ng/AL) 5,0 双蒸水 6.0
GB/T38164一2019 表3实时荧光CR反应参数 待测物 反应参数 内参照 95C10min;95C15s,601min,40个循环 黄牛 95C10min;95C15s,601min,40个循环 耗牛 nmin;95C15s,601min,40个循环 95C10 95C10min;95C15s.60" 1min,0个循环 水牛 15s,601min,40 骆驼 95"Cl0min;95 个循环 95C10min;95 15s,60C1min,40个循环 梅花鹿 95C10min;95 15s,60C1nmin,40个循环 马鹿 驯鹿 9510min;95C15s,60'C1nmin,40个循环 山羊 9510min;95 15s,60 min,40个循环 绵羊 9510min;95 15s,62C1min,40个循环 9510min;9515s,60 猪 个循环 min,40 15s,60c1min,40 9510min;95 狗 个循环 9510min;95 15s,601nmin,40个循环 鸽子 火鸡 9510min;95 15s,60C1nmin,40个循环 C 狐狸 95 5 min;95 15s,6040s,40个循环 95 骆 5min;9515s,60 40s,40个循环 95 15s,60C40s,40个循环 鸡 5min;95 鼠 15s,62C40s,40个循环 95C10min;95 鸭 95 2min;95 15s,65C80s,40个循环 C 95 2min;95 15s,6580s,40个循环 鹅 C 鹌鹑 95 2min;95 15s,65"80s,40个循环 5 兔 95 10s;95 s,60C30s,40个循环 水貂 9510s;955s,5210s,7234s,40个循环 95 10s;955s,52C10s,72C34s,0个循环 猫 质量控制 9 以下条件有一条不满足时,试验视为无效: a 内参照:荧光通道有荧光信号检出,且出现典型的扩增曲线,Ct值<30.0; b空白对照;荧光通道无荧光信号检出,Ct值应>40.0 c 阴性对照;荧光通道无荧光信号检出,ct值应>40.0 阳性对照;荧光通道有荧光信号检出.且出现典型的扩增曲线,Ct值<35.0 d 10结果判定及表述 0.1结果判定 在符合第9章的情况下,检测结果按以下进行判定:
GB/38164一2019 如C值<35.0,则判定为被检样品阳性,扩增靶标序列参见附录A; a b)如Ct值>40.0,则判定为被检样品阴性; 如35.040.0,则判定被检样品阴性 10.2结果表述 0.2.1结果为阳性者,表述为“检出×××目标物种)成分” 10.2.2结果为阴性者,表述为“未检出×××目标物种)成分” 检测过程中防止交叉污染的措施 按照GB/T27403一2008中附录D的规定执行
GB/T38164一2019 附 录 A 资料性附录) 各动物源性成分基因扩增靶标序列 黄牛成分的基因扩增靶标参考序列(GenBank;MK028750.1);tggagtaatecttctgetcacagtaatagccacagcattt ataggatacgtcctaccatgaggacaaatatcattctgaggagcaacagtca 托牛成分的基因扩增粑标参考序列(GenBank;GQ464309.1);gactaatattegaaaatcccatccaetaataaaaattgtaa acaacgcattcattgaccttccagctccatcaaacatttcatcatggtgaaacttcggctccctcctaggag GenBankMH880269.1 水牛成分的基因扩增靶标参考序列(G :ttcattgatctccctgctccatcaaacatctcatcatgatg aaactttggctctctcctaggcatctgcctaattctgcaaatcctcaccggcctattcc 骆驼成分的基因扩增靶标参考序列 GenBank 110007 :attctttgccttccacttcatcctgccatttattatcacggC cctagtagccgtacacctattattcctacacgaaacaggctctaataacccgacaggaatctcctcagacatagacaaaatcccattccacccctactaca caattaaagacatcctaggagcactgctactaatattaattctccttattctcgtactgttctcaccagacttattaggagatcctgacaactatactcccgc taaccccctcaatacaccaccacacattaagccggaatgatatttcctattcgcatacgct 梅花鹿成分的基因扩增靶标参考序列(GenBank;D14379.2):cctaccaccgaagcaatagtggacactgtagctactcaag aagctttctcagaagttattgagagtgcacc 马鹿成分的基因扩增靶标参考序列GenBank:NC_039923.1);tagttatgtaaacaagactgttcgccagagtactaccgg caatagcttaaaactcaaaggacttggcggtgctttatacccttctagaggagcctgttctataatcgataaaccccgataaacctcaccattccttgcta ctacagtctat 驯鹿成分的基因扩增靶标参考序列(GenBank:GU220719.1);ctcccagtacgaaaggaccagagaaataaggccaacttt aatcaagCgccttaaat attaactaatgatttcatcttaattagatacacaaacatatccCgccC 山羊成分的基因扩增靶标参考序列(GenBank:LS992662.1 :tggagtaatcCtcCtgCtCgCgaCaatggCCaCagCat CattCa aggctatgttttaccatgaggacaaatatcattttgaggggG gcaacagtcatcactaatcttct 绵羊成分的基因扩增靶标参考序列(GenBank:KY786037 tgCgacaatagccacagcattca taggctaCgtcttaccatgaggacaaatatcattctgaggagcaacagttattaccaacctcct 成分的基因扩增靶标参考序列(GenBank:GQ240309.l CaaCgtactaacagtaacCagacccaata taattgaccaatggaccaagctaccccagggataacagCgcaatctcctccaagagtccatatCgaCgaggaggt 鸭成分的基因扩增靶标参考序列(GenBank:EU914150.1);ggccacacaaatcctcacaggcctcctactggctatgcactac acCgcagacacatcccttgctttctcctcagtagccaacaca 鹅成分的基因扩增靶标参考序列(GenBank;AF363031):ccaceggaa TTaa0 caaccccactggggccactaccatcgc aagagcctggtcgatatttttcggttggggcgaccttggaggagaacaaatcctccaaaaacaaga 鹌鹑成分的基因扩增靶标参考序列(GenBank:AM902516);ggatcactttgcccacttaagatggccctgaggcacgtace taccgcccgtcacce 水貂成分的基因扩增靶标参考序列(GenBank:AB052720.1l):gcttcaatcetctatttcataatectcetagtcttcatgccaa tcgtcagyattattgaaaataatctattaaaatgaagagtctttgtagtatatcaattacyttggtcttgtaaaccaaaaatggagaaccetatctccctaal gactcaaggaagaagc 猫成分的基因扩增靶标参考序列(GenBank:U20753.1):ctgctgtcttactacttctatcacttccagtettagcagcgggaate actatattattaacagategaaacctaaacacc 兔成分的基因扩增靶标参考序列(GenBank:NC_001913.1COX1) ;taatcgtcaccgcacatgcetttgtaataatcttctt tatagtcatgcctattataattggaggcttcgggaactggcttgtccccctgataattggggctcctgacatag 猪成分的基因扩增粑标参考序列(Genbank;KY964306.1) :;atctacatgattcattacaattacatcaataattataacattatt tattttattccaactaaaaatctcaaactactcatacccagcaagcccagaatcaaccgaactcaaaactcaaaaacatag
GB/38164一2019 enbankKY700649.1 狗成分的基因扩增靶标参考序列(Gen );tccaggtaaacccttcttccctcccctatgtacgtcgtgcatta atggtttgccccatgcatataagcatgtacataatattatattcttacataggacatatcaactcaatctcacaattcattgatctgtcagcagtatcaaatg catatcacttagtccaataagggcttaatcaccatgcctcgagaaaccatcaacccttgctcgtaa 狐狸成分的基因扩增粑标参考序列G ggagcatcagtagaccttacaattttctccctgcacctgge cggagtctcttcaattttaggagctattaatttcatcactactattatcaatataaaacctcccgcG 籍成分的基因扩增靶标参考序列G aatcttgcC ggaataatttcccatatcgttacatact caccacatatttactg actccgggaaaaaagaaccttttggttacataggaatagtctgagcaataatatctattgga 鼠成分的基因扩增靶标参考序列(GenBank:KY611388.1):attccgcccaatcacccaaacc ccctatactgaattctagtagcg aacctcttcattttaacatgaatcggaggccaa 鸡成分的基因扩增靶标参考序列(Genbank:KY039437):ccctcctecttte catcctcatttctatgaatcCgggcctcatatcca cggttccgctatgaCc 火鸡成分的基因扩增靶标参考序列GenBank:U83741.1): ;gccctaaccccttaagaaaagaat aataaaggagcaggtatcagg cacactctaatgtagcccaagacgccttgcttgagccacacccccacgggtattcagcagtaattaaccttaagcaataagtgtaaacttgacttagccat agcaact

常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法GB/T38164-2019

实时荧光PCR法是一种快速、灵敏、特异的分子生物学技术。它利用PCR扩增技术，结合荧光探针技术，能够在单个PCR反应中同时完成DNA扩增和检测过程，具有高通量、高灵敏度、高特异性等特点。

相较于传统的PCR技术，实时荧光PCR法不需要后续的电泳分析步骤，大大缩短了检测时间，且避免了电泳分离和检测过程中可能存在的污染风险。

在畜禽动物源性成分的检测中，实时荧光PCR法已经被广泛应用。该技术可以检测鸡、鸭、猪、牛等常见的畜禽动物源性成分，同时也可以较好地区分不同种类的动物源性成分。

GB/T38164-2019标准是我国在实时荧光PCR技术应用于食品中畜禽动物源性成分检测方面的第一个国家标准。该标准规定了实时荧光PCR技术在样品处理、反应条件、数据分析等方面的各项要求和指导原则，为实时荧光PCR法在畜禽动物源性成分检测中的应用提供了重要的技术支持。

总之，实时荧光PCR法是一种快速、灵敏、特异的畜禽动物源性成分检测方法，已被列入GB/T38164-2019标准。该技术对于保障食品安全、促进食品质量监管具有重要意义。

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