主要农作物品种真实性和纯度SSR分子标记检测稻

主要农作物品种真实性和纯度SSR分子标记检测稻

国家标准 GB/T39917一2021 主要农作物品种真实性和纯度SSR分子 标记检测稻 VarietygenuinenessandpuritytestingofmaincropswithSSRmarkers一Riee 2021-04-30发布 2021-11-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/39917一2021 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 3 术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 3.2缩略语 总则 5 检测方案 5.1总则 5.2引物 5.3检测平台 5.4样品 5.5检测条件 仪器设备、,试剂和溶液配制 6.1仪器设备 6.2试剂 6.3溶液配制 真实性检测程序 7.1引物合成 DNA提取 7.2 PCR扩增 7.3 7.4 扩增产物分离 l0 7.5 数据分析 品种纯度检测程序 8 13 8.1DNA提取 13 13 8.2引物筛选和合成 8.3PCR扩增 8.！扩增产物分离 8.5 数据分析 l4 结果计算与表示 9.1真实性鉴定 9.2纯度测定 15 0结果报告 15 0.1真实性鉴定 15 0.2纯度测定
GB/T39917一202 l6 附录A规范性附录溶液配制 19 附录B资料性附录等位基因扩增片段信息 表1真实性鉴定引物 表2PCR扩增反应体系 13 表3纯度测定候选引物 19 表B.1已知品种主要等位基因扩增片段信息
GB/39917一2021 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由农业农村部提出 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC37归口 本标准起草单位;全国农业技术推广服务中心、水稻研究所、农业部农作物种子质量监督检验 测试中心(深圳)、种子集团有限公司 本标准主要起草人:徐群、支巨振、魏兴华,刘丰泽、晋芳,邓汉超、董国兴
GB/39917一2021 主要农作物品种真实性和纯度SSR分子 标记检测稻 范围 本标准规定了稻(OryasativaL.)品种真实性和品种纯度sSSR分子标记的检测原则、检测方案、 检测程序和结果报告 本标准适用于稻品种真实性验证和真实性身份鉴定,不适用于实质性衍生品种(EDV)和转基因品 种的鉴定 本标准适用于稻常规种,杂交种及其亲本的品种纯度测定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 件 GB/T3543.1！农作物种子检验规程总则 GB/T3543.2农作物种子检验规程托样 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1.1 erifrication 品种真实性验证varietyver 与其对应品种名称的标准样品比较,检测证实供检样品品种名称标注是否名副其实 3.1.2 品种真实性身份鉴定yarietyidentifieationm 经SSR分子标记检测并通过审定品种SSR指纹数据比对平台(3.1.4)筛查比较,确定供检样品的真 实品种名称 3.1.3 标准样品standardsample 国家指定机构保存的经认定代表审定品种特征特性的实物种子样品 3.1.4 sSR指纹数据比对平台sSRfingerprintblastplatform 采用SSR分子标记的标准化方法对品种标准样品等位基因进行检测,并运用计算机数据库技术和 网络信息技术所构建的审定品种分子数据信息的检索比对载体 3.1.5 参照样品refereneecontrolsample 用于校准检测样品SSR等位基因已定义扩增产物片段大小的样品
GB/T39917一2021 3.1.6 引物primer -条互补结合在模板DNA链上的短单链,能提供3'-OH末端作为DNA合成的起始点,延伸合成 模板DNA的互补链 3.1.7 组合引物panel 能够组合在一起电泳的,具有不同颜色或相同颜色而扩增产物片段大小不同的荧光标记的一组 引物 3.1.8 等位基因allele 在一对同源染色体上同一基因座上的一对基因 注1:对于SsR检测,等位基因差异以扩增产物片段大小来表示 注2:对于荧光标记引物,扩增产物片段大小是指一个已定义片段大小的区间范围,本标准将之称为Bin 3.2缩胳语 下列缩略语适用于本文件 p;basepair,碱基对 CTAB 3;cetyltrimethylammoniumbromide,十六熔基三甲基祺化铵 DNA:deoxyri ,脱氧核糖核酸 yribonucleicacid deoxyribonucleoside triphosphates,脱氧核苷三磷酸 PAGE:polyacrylamidegelelectrophoresis,聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR;polymerasechainreaction， ,聚合酶链式反应 SDSsodiumdodeeylsulfate,十二烧基苯磺酸钠 SSR:simplesequencerepeat ,简单序列重复 Taq酶:Tag-DNApolymerase ,耐热DNA聚合酶 总则 稻的不同品种,其基因组存在着能够世代稳定遗传的简单序列重复(SSR)的重复次数差异 这种 差异可以通过从抽取有代表性的检测样品中提取DNA,用sSR引物进行扩增和电泳,从而通过其扩增 产物片段大小不同而加以区分品种 依据sSR检测原理,采用固定数目的ssR引物,通过与标准样品比较或与ssR指纹数据比对平台 比对的方式,对品种真实性进行验证或身份鉴定 真实性验证依据规定数目引物的ssR分子标记差异 数目而判定,品种真实性身份鉴定依据SSR分子标记数目没有差异的原则进行筛查、鉴定而确定 采用筛选能够准确识别品种异常个体指纹数据或图谐的适宜引物,通过对一定数量检测样品的异 常个体数目或百分率的品种纯度估测,从而对其整体的典型一致程度作出评价 检测方案 S 5.1总则 对于真实性鉴定和纯度测定,引物、检测平台、样品状况不同,其检测结果准确度、精确度可能有所 不同 应依据“适于检测目的”的原则,统筹考虑检测规模和检测能力,择定适宜的引物、检测平台、样品 状况,制定相应的检测方案
GB/39917一2021 在严格控制条件下,合成选择的引物,对检测样品按DNA提取、PCR扩增、电泳、数据分析的程序 进行检测 按规定要求填报检测结果,检验报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息 5.2引物 5.2.1真实性鉴定 5.2.1.1检测引物数目越多,结果漏检和误判的概率降低,工作量也随之增加,这需要依据检测目的在 可接受结果准确率的前提下进行兼顾 经对我国审定通过稻品种进行全面试验后,依据高分辨率,染色 体均匀分布等筛选原则,本标准选选了48对作为品种真实性鉴定的检测引物,具体见表1,并据此构建 了已知品种的SSR指纹数据比对平台 表1引物可分为I、I两组,编号PR01PR24为I组,编号 PR25PR48为l组,每组包含24对 5.2.1.2品种真实性验证强调的是对结果的否定,相对而言对引物数量要求不高,检测允许采用序贯方 式 先采用I组引物进行检测,若未检测到或检测到可以判定不符结果的差异位点数的,可终止检测 对于采用I组引物进行检测,若检测到而未达到可以判定不符结果的差异位点数的,则继续完成I组引 物的检测 品种真实性身份鉴定强调的是对结果的肯定,在已具备已知审定品种的ssR指纹数据比对平 5.2.1.3 台的前提下,通过已知检测信息能够筛查确定至具体品种 为尽量降低误判检测时会对引物数量要求 较高,可采用序贯方式,也可直接采用表" 的48对SSR引物进行检测,直至与SSR指纹数据比对平台 比较后能够确定为止 经比较后仍与已知品种存在没有位点差异而无法得出结论的,允许采用其他能 够区分的ssR分子标记进行检测 5.2.2纯度测定 纯度测定要明确所检测的异常个体类型,异常个体的类型不同,所选引物和数目也有所不同 5.2.2.1 有时还需借助相应父母本的DNA指纹数据 杂交种异常个体主要类型为自交、异交、混杂;常规种和 杂交亲本种子异常个体为异交、混杂 5.2.2.2品种纯度测定所选的引物,应通过检测样品预试验,筛选出能够准确识别该样品品种的异常个 体 筛选时还需综合考虑引物的杂合度,DNA快速提取和多重组合电泳的潜力 筛选结果表明,样品 在个别位点存在遗传不稳定状况的可将其剔除,检测样品存在严重遗传不稳定状况的可终止纯度测定 5.3检测平台 5.3.1电泳是检测的关键环节,对于真实性鉴定,可选择采用PAGE电泳、毛细管电泳,但应注意 PAGE电泳检测数据与SSR指纹数据比对平台比对困难,难以进行真实性身份鉴定;对于纯度测定,可 以采用PAGE电泳、毛细管电泳,在选择等位基因扩增片段差异较大的引物前提下也可采用琼脂糖 电泳 5.3.2对于样品量较大的,可将样品粉碎仪、,DNA自动提取和移液工作站、高通量PCR扩增仪、多引物 组合的毛细管电泳进行组合,以提高检测的综合效率 5.3.3DNA提取、PCR扩增、电泳的技术条件要求,在适于检测目的和不影响检测质量的前提下,按照 检测平台的要求允许对本标准的规定做适宜的局部改进 5.4样品 5.4.1真实性鉴定 5.4.1.1 送验样品为种子,质量应不低于30g或不少于1000粒 在种子生产基地取样,送验样品可为
GB/T39917一202 稻穗,数量应不低于10个总粒数不少于1000粒) 注在种子生产基地取样,送验样品可以为幼苗.叶片等组织或器官,这时注意其检测比对对象 幼苗.叶片的数量 至少含有20个个体,采用混合样品检测的先单独提取DNA,再取等量DNA混合 从送验样品中分取有代表性的试样,采用混合样或单个个体进行检测 混合样试样来源应至 5.4.1.2 少含有20个个体,单个个体试样应至少含有5个个体 5.4.2纯度测定 5.4.2.1送验样品为种子,对于常规种,杂交种和亲本种子质量应不低于30g或不少于1000粒 与真 实性鉴定同时开展检测的,可以为同一送检样品 5.4.2.2从送验样品中分取规定数量的试样,试样采用单个个体进行独立检测 送验样品或试样的抽 取、分取应有代表性,符合GB/T3543.2的规定 试样的数量,对于常规种、,杂交种,应至少含有96(适 用时可含对照)×2粒种子;对于杂交亲本种子,应至少含有96(适用时可含对照)×4粒种子 5.5检测条件 真实性鉴定或纯度测定应在控制的条件下进行包括但不限于下列条件 -种子检验员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能; 所有仪器与使用的技术相适应,并已经过定期维护,验证和校准; -使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材; 使用校准影响检测结果评定的适宜参照样品 6 仪器设备,试剂和溶液配制 6.1仪器设备 6.1.1DNA提取 高速冷冻离心机、水浴锅或金属浴、紫外分光光度计或核酸浓度测定仪、组织研磨仪 6.1.2PCR扩增 PCR扩增仪 6.1.3电泳 6.1.3.1琼脂糖凝胶电泳 电泳仪、水平电泳槽及制胶附件、凝胶成像系统或紫外透射仪 6.1.3.2PAGE电泳 高压电泳仪、垂直电泳槽及制胶附件、水平摇床、胶片观察灯、凝胶成像系统或数码相机 6.1.3.3毛细管电泳 DNA分析仪 6.1.4其他器具 微量移液器、电子天平、高压灭菌锅、磁力搅拌器,微波炉,冰箱、染色盒
GB/39917一2021 6.2试剂 6.2.1DNA提取 CTAB,三氯甲熔、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2H,O)、三羚甲基氨基甲婉碱 Tris-base)、盐酸、氢氧化钠氯化钠 6.2.2PCR扩增 dNTPs、Taq酶、10×缓冲液、矿物油,ddH,O、引物和Mg" 6.2.3 电泳 6.2.3.1 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖、核酸染料指示剂(Goldview或潦化乙锭) 6.2.3.2PAGE电泳 去离子甲酰版(Formamide),澳励蓝(BrphBlue)、二甲苯青FF,甲叉双丙烯酷胺(Bisacrylamitde) 丙烁肤胶(Aerylamide),酬酸(BoreAcd)尿素.亲和硅烧(imdingsilane)疏水硅婉(Repesilme) DNA分子量标准、无水乙醇,四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APs)、冰醋酸、乙酸铵、,硝酸银、甲 醛、氢氧化钠 6.2.3.3毛细管电泳 DNA分析仪专用的丙烯酰胺胶、分子量内标、去离子甲酰胺、电泳缓冲液 6.3溶液配制 DNA提取,PCR扩增,电泳、银染的溶液按照附录A规定的要求进行配制,所用试剂均为分析纯 试剂配制所用水应符合GB/T6682规定的一级水的要求,其中银染溶液配制可以使用符合三级要 求的水 真实性检测程序 7.1引物合成 根据真实性验证或身份鉴定的要求,选定表1的引物 选用PAGE电泳,只需合成普通引物,采用 选用荧光毛细管电沫,需在正向引物的'蹦标记荧光染料合成引物,采用单引物或组合 单引物电泳 引物电泳 表1标记荧光栏所列的仅作为示例,只适用于某一检测平台使用 表1真实性鉴定引物 引物 染色体 退火温度 标记 引物序列(5'3' 编号 名称 位置p) 荧光 正向AGATcCATcccTGTGGAGAG PR01 RM583 18328860) 55 VIC 反向:GcGAACTcGcGTTGTAATc 正向:TTTGTGGCTCACCAGTTGAG PR02 55 NED RM424 2(l1388913) 反向:TGGcGcATTCATGTcATc
GB/T39917一202 表1续 引物 染色体 退火温度 标记 编号 引物序列(5'一3' 名称 位置bp) 荧光 正向.ccAAAGATGAAAccTGGATTG PR03 RM85 3(36341095 55 FAM 反向:GCACAAGGTGAGCAGTCC 正向:ACGCACAAGCAGATGATGAG PR04 RM471 4(18824828 55 VIC 反向;G;GGAGAAGACGAATGTTTGC 正向:GAATcGCACACGTGATGAAC PR05 RM598 5(16751191 55 FAM 反向:ATGcGAcTG.ATcGGTAcTcc 正向CTTGTcTATCTCcAAGACAc PR06 RM190 6(1764740 55 VIC 反向:T'TGCAGATGT'TCT'TCCTGATG 正向;cTTACAGAGAAAcGGcATcG PR07 RM336 7(21871337 55 VIc 反向:GCTGGTTTGTTTCAGGTTcG 正向:CCGGCGATAAAACAATGAG RM72 PET PR08 86762710 55 反向;(GCATcG(GTccTAACTAAGGG; 正向:cGTcGGATGATGTAAAGcCT PR09 RM219 97887585 55 FAM 反向.CATATCGGcATTCGcTG 正向;CATcTccGcTcTcCATGc PR10 RM590 10(23043156) 55 PET 反向:GGAGTTGGGGTCTTGTTCG 正向:ATATGAGTTGCTGTCGTGCG PR11 RM209 l(17808441 55 VIc 反向:CAAcTTGCATcCTccccTcc 正向:CAAAAACAGAGCAGATGAC PR12 12(2432080) RM19 55 PET 反向:cTCAAG.ATGGAcGcCAAGA 正向ATGGAcCACAAAcGAcCTTc PR13 RM1195 1(6153019) 55 FAM 反向:CGACTCcCCTTGTTCTTCTGG 正向;TcTGcAAGccTrGTcTGATG PR14 RM208 2(35135946) 55 PET 反向:TAAGTCGATCATTGTGTGGACC 正向:CCGGTATCCTTCGATATTG;C PRl5 RM232 39754695 55 PT 反向;cCGACTTTTccTccTGAcG 正向CATCCCCCTGCTGCTGCTGCTG 67 PR16 RM1l19 4(21242569 PET 反向:CG;CCGGATGTGTGGGACTAG;CG 正向;TGcAGAcATAGAGAAGGAAGTG PR17 RM267 5(2881434 55 NED 反向:AGCAACAGCACAACTTGATG 正向:TCCTTCAAGAGTGCAAAACC PR18 RM253 6(5425498) PET 55 反向;(GCATTGTCATGTC(GAA(GCC
GB/39917一2021 表1(续 引物 染色体 退火温度 标记 编号 引物序列(5'一3' 名称 位置bp) 荧光 正向:TAGCTAGccGATTGAATGcc PRR19 RM481 7(2875315) 55 FAM 反向:CTCCACCTCCTATGTTGTTG 正向:GTAATcGATGCTGTGGGAAG PR20 RM339 8(17942468) 55 VC 反向:GAGTCATGTGATAGCCGATATG 正向;CTAGTTGGGCATACGATGGC PR21 RM316 9(1075107) 55 VIC 反向:AcGcTTATATGTTAcGTCAAC 正向;TGCGTTATGTAGCTcGcACc PR22 RM258 0(18014268 55 FAM 反向:TGGCCTTTAAAGCTGTCGC 正向;ATcGATcGATcTTcAcGAGG PR23 RM224 1127201740 55 NED 反向:TGCTATAAAAGGCATTCGGG 正向;TGCCCTG;TTATTTTCTTCTCTC PR24 RM17 12(26954814 55 NEID 反向;GGTGATcTTTccCATTTCA 正向:TAGCTcCAAcCAGGATcGAcc PR25 RM493 1(122801l6) 55 VIC GG;TG 反向.cGTAcGTA.AcccGA 正向;GAGcTGTTTTGGACTAcGGc PR26 RM561 2(18764122) 55 FAM 反向:(GAGTAGC'TTTCTCCCACCCC 正向:AGCACAAGTAGGTGCATTTC PR27 RM8277 3(28805073 55 NED 反向:ATTTGCCTGTGATGTAATAGC 正向:AGCCCAGACTAGCATGATTG 4(177078) 55 PR28 RM551 FAM 反向:GAAGGcGAGAAGGATcCACAG 正向.(ccTcGCTTATGAGAGcTTcG PR29 RM274 5(26848153) 的 VIC 反向:CT'TCTCCATCACTCCCATGG 正向:cGGcTcccGcTACG.AcGTcTcc 67 PR30 RM176 6(30265439) FAM 反向:AGCGATGCGCTGGAAGAGGTGC 正向:TTCTGTCTCACGCTGGATTG PR31 7(18958599 55 PET RM432 反向;AGcTcGTAC;TGATGAATG 正向:GAACCAGAGGACAAAAATGC NED PR32 RM331 8(12294291 55 反向:cATCATAcATTTGcAGccAG: 正向;AGcAGcTATAGcTTAGcTGG PR33 OSR28 9(19788251 NED 55 反向:ACTGCACATGAGCAGAGACA 正向:TGGTAGTATAGGTACTAAACAT PR34 RM311 10(9747442 VIc 55 反向:TCCTATACACATACAAACATAC
GB/T39917一202 表1续 引物 退火温度 染色体 标记 编号 引物序列(5'-3 名称 位置bp) 荧光 正向ACAGTATTccGTAGcCACcG PR35 RM21 ll(19173027 55 FAM 反向:GCTcCATGAGGGTGGTAGAG 正向;CCTCC'TCCATGAGCTAATGC PR36 RM3331 12(23460827 50 VIC 反向;AGGAGGAGcGGATTTcTcTc 正向:GATGGTTTTCATCGGCTACG PR37 RM443 VIc 1(28339414 55 反向;AGTccCAGAATGTcG;TTTcG ATcTGCACAcTGCAAACACc 正向;A PR38 RM490 1(6676230) 55 FAM 反向:AGCAAGCAGTGCTTTCAGAG 正向CTAGAGGcGAAAACGAGATG PR39 RM71 28760537 55 FAM 反向:GGGTGGGCGAGGTAATAATG 正向;AGCACCCATGCCTTATGTTG; PR40 RM423 2(3836866 55 FAM 反向cCTTTTTCAGTAGcCCTccc 正向;(GGAGGTGAAAGCGAATCATG PR4n RM571 3(33150557 55 FAM 反向:cCTGCTGCTCTTTCATCAGC 正向.ccAG.ATTATTTccTGAGGTc PR42 RM231 3(2453256) 55 PET 反向:CACTTGCATAGTTCTGCATTG 正向:ATCAGGGAAATcCTGAAGGG 4(34533716 PR43 RM567 55 PET ;AAGGAGcAATcAcCAcTG 反向:GG 正向:TTCCATGGCACACAAGCC RM289 5(7807745 PET PR44 55 反向:CTGTGCAcGAACTTcCAAAG 正向:TGAATCAAGccccTcAcTAc PR45 RM542 7(12712074 55 VIC 反向:CTGCAACGAGTAAGGCAGAG 正向:GTAGTGAGcCTAAcAATAATc PR46 RM278 9(19320020) 55 NED 反向:;TCAACTCAGCATCTCTGTCC 正向;GCGAAGGCGAAGGTGAAG 55 PR47 RM332 11(2840361 VIC 反向;cATGAGTGATcTCAcTCAccc 正向:TAGGAGTGTTTAGAGTGCCA PR48 RM7102 55 12(13211362 PET 反向:TCGGTTTGCTTATACATCAG 7.2DNA提取 7.2.1总则 DNA提取方法应保证提取的DNA质量符合PCR扩增的要求,DNA无降解,溶液的紫外光吸光 度oD丽与oD的比值宜介于1.8一2.0之间
GB/39917一2021 DNA提取可任选7.2.2至7.2.4所列的一种方法 其中;CTAB和试剂盒法提取量大,质量好 可 长期保存;SDS法快速简单,提取量小,质量较好 7.2.2CTAB法 试样为幼苗或叶片,取200mg一300mg植物组织置于2.0mL离心管,加液氨充分研磨,或直接将叶 片剪碎放人2.0nml离心管,每管加人700经65C预热的CTAB提取液,研碎 试样为种子,将其充分 磨碎后移人2.0m离心管,每管加人700L经65C预热的CTAB提取液 65C水浴60min并多次颠 倒混匀 每管加人等体积的三氧甲烧/异戊醉(24:1)混合液,充分混合后静置10min,12000r/min离心 15min 吸取上清液转移至一新管,加人2倍体积预冷的异丙醇,颠倒混匀,-20C放置30min后在4C 12000r/min离心10min,弃上清液,用70%乙醇溶液洗涤2遍 自然条件下干燥后,加人TE缓冲液,充 分溶解,检测浓度后备用 7.2.3试剂盒法 选用适宜sSR分子标记法的商业试剂盒,并经验证合格后使用 DNA提取方法,按照提供的使用 说明进行操作 7.2.4SDS法 取试样的幼苗或叶片置于2.0mL离心管,加液氮充分研磨,或直接将叶片剪碎放人2.0mL离心 管,每管加人700L的sDS提取液,研碎 每管加人等体积的三氯甲烧/异戊醇(24:1)混合液,12000 rr/min离心5min 吸取上清液转移至一新管,加人2倍体积预冷的无水乙醇,颠倒混匀,12000r/min 离心10min,弃上清液,用70%乙醇溶液洗涤2遍 自然条件下干燥后,加人TE缓冲液,充分溶解,检 测浓度后备用 7.3PCR扩增 7.3.1 反应体系 PCR扩增反应体系的总体积和组分的终浓度参照表2进行配量,可以依据试验条件不同做相应调 整 表2中的缓冲液若含有MgCl,,不再加MgCl溶液,加等体积无菌水替代 表2PCR扩增反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 体积/a ddH.(O 4.35 10×缓冲液 10X MgC 25mmol/1 1.5mmol/I 0,6 dNTP 0.8 0,2mmol/几 2.5mmol/L 2U/L 0.05U/ 0,25 Tu彤 5mol/L 0.5tmol/L" 引物 DNA 25ng/1 2.5ng/1 每一种类的浓度 7.3.2反应程序 反应程序的反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等不同而做适当的调整 通常采用下列反
GB/T39917一2021 应程序 预变性;94C,4min a 扩增.94C变性45s,50C一67C根据表1的引物设定退火温度)退火45s,72C延伸 b) 1min,进行30次循环 终延伸;72C,8min. 形成的扩增产物于4C保存 7.4扩增产物分离 7.4.1非变性PAGE电泳 7.4.1.1 制胶 在一对玻璃板间插人1.0mm宽的间隔片,将玻璃板对齐夹紧,在封口处注人琼脂糖溶液,让其在 10min15min凝固密封 在烧杯中依次加人5mL5×TBE缓冲液,3.75ml 40%PAGE胶,搅拌并 用双蒸水定容至25mL;加人200AL过硫酸铵和12LTEMED.混匀后倒人凝胶板之间,随即插好样 品梳,使其在50min60min内聚合凝固,凝胶高度应不小于10em 7.4.1.2电泳 7.4.1.2.1去掉封口的琼脂糖胶,将玻璃板固定于垂直电泳槽上,在电泳槽中加人1×TBE缓冲液,小 心抽出样品梳 在10ALPCR样品中加人24L6×潦酚蓝-二甲苯青电泳指示剂混匀,然后向加样孔 中点人15l;同时在一侧样品孔中加人分子量标记 电冰选用的电压郁度为1v/cm一5vcm 般选用300VH600VH条件电泳 7.4.1.2.2电泳的适宜时间,参考二甲苯青指示带移动的位置和扩增产物预期片段大小范围(参见表B.1 加以确定 二甲苯青指示带在6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中,所移动的位置与120bp扩增产 物泳动的位置大致相当 扩增产物片段大小在(120士50)bp、(220士50)bp范围的,指示带从上到下应 分别到达胶板1/2、2/3处后,才可结束电泳 电泳结束后关闭电源,取下玻璃板并轻轻撬开,通常凝胶 附着在无凹槽的玻璃板上 7.4.1.3染色 将附着凝胶的玻璃板用双燕水冲洗30s一60s后,放人染色液中,轻摇5min10nmin进行染色 从染色液中取出用水快速漂洗,放人显影液中,轻摇至显色出清晰带纹;取出凝胶用双蒸水冲洗两遍， 沥干后进行扫描或拍照 .4.2变性PAGE电泳 7 7.4.2.1制胶 将玻璃板清洗干净,用双蒸水冲洗后晾干 用无水乙醇擦洗两遍,吸水纸擦干 在长板上涂上 0.5ml亲和硅烧工作液,带凹槽的短板上涂0.5ml剥离硅烧工作液 操作过程中防止两块玻璃板互 相污染 待玻璃板彻底干燥后组装成电泳装置,并用水平仪调平 垫片厚度为0.4mm 在100 m 6.0%聚丙烯酰胺凝胶中加人新配制的10%过硫酸铵溶液500L、TEMED50AL,迅速混匀后灌胶 待胶液充满玻璃板夹层,将0.4mm厚鲨鱼齿梳子平齐端向里轻轻插人胶液约0.4cem 灌胶过程中防 止出现气泡 使胶液聚合至少1h以上 胶聚合后,清理胶板表面溢出的胶液,轻轻拔出梳子,用水清 洗干净备用 10
GB/39917一2021 7.4.2.2变性 取10L扩增产物(见7.3.2),加人2AL6×加样缓冲液,混匀 在PCR扩增仪上运行95C变性 5min,取出立即置于冰上,冷却10min以上后供备用 7.4.2.3电泳 将胶板安装于电泳槽上,向上槽中加人约800mL预热至65C的0.5×TBE缓冲液,使其超过凝胶 顶部约3em,向下槽中加人800mlL1×TBE缓冲液 在6ow恒功率下,预电泳10min20min;用移 液器吹吸加样槽,清除气泡和杂质 将鲨鱼齿梳子梳齿端插人凝胶1mm~2mm 每一个加样孔点人 8L5AL样品 除检测样品外,还应同时加人参照样品 以30V/em一40V/em的电压电泳,使凝 胶温度保持在约50 电泳时间的确定执行7.4.1.2.2的规定 7.4.2.4染色 将附着凝胶的长玻璃板放人固定液中,轻摇3min;用水快迷漂洗，再取出放人染色液中轻摇 5min 1;从染色液中取出后用水快速漂洗,放人预冷的显影液中轻摇至条带清晰,再迅速放人固定液中定 影5min. n,取出后用双蒸水中漂洗1min;将胶板沥干后,进行扫描或拍照 注:固定液染色液、双蒸水和显影液的用量,可依据胶板数量和大小调整,以淹没胶面为准 7.4.3荧光毛细管电泳 7.4.3.1对于稻,SSR分子标记扩增片段大小范围较窄,可以依据不同仪器选择采用不多于4重的组合 引物进行电泳 按照预先确定的组合引物,分别取等体积的同一组合引物的不同荧光标记的扩增产物 见7.3.2),充分混匀 从混合液中吸取1AL,加人DNA分析仪专用96孔板孔中 各孔再分别加人 0.1L.分子量内标和8.9lL去离子甲酰胺,在PCR仪上95C变性5min,取出立即置于冰上,冷却 10 nmin以上 瞬时离心10s后供备用 7.4.3.2打开DNA分析仪,检查仪器工作状态和试剂状态 7.4.3.3将装有样品的微孔板放置于样品架基座上,打开数据收集软件,按照DNA分析仪使用手册进 行操作 DNA分析仪将自动运行参数,并保存电泳原始数据文件 7.5数据分析 7.5.1总则 7.5.1.1为了获得一致的比对结果,电泳结果特别是毛细管电泳,需要通过规定程序进行数据分析 在 引物等位基因片段大小范围内(参见表B.1),对于毛细管电泳,特异峰呈现为稳定的尖锐峰型,纯合位 点显示为单峰,杂合位点显示为双峰;对于PAGE电泳,特异谱带呈现明显,纯合位点显示为单条,杂合 位点显示为双条 7.5.1.2对于毛细管电泳,由于引物扩增表现不同、引物不对称扩增、试验条件干扰等因素,可能出现不 同状况的峰型,按照以峰高为主、兼顾峰型的原则依据下列规则进行甄别、过滤处置 一位置其他颜色荧光 对于连带(pullup)峰,即因某一位置某一颜色荧光的峰值较高而引起同一 蜂值升高的,应预先将其干扰消除后再进行分析 b 对于(n+1)峰,即同一位置出现两个相距1bp左右的峰,应视为单峰; 对于连续多峰,即峰高递增或峰高接近的相差一个重复序列的连续多个峰,应视为单峰,取其 最右边的峰,峰高值为连续多个峰的叠加值; d)对于多个特异峰,峰高值应只采集位于前两位的两个峰,不采集其他峰; 1
GB/T39917一202 对于高低峰,应通过设定一定阀值不予采集低于阀值的峰 e 7.5.1.3对于PAGE电泳,位于其相应的等位基因扩增片段大小范围之外的谱带需要甄别是非特异性 扩增带还是新增的稀有等位基因谱带 采用单个个体提取的,出现双带以上的多带则可能为非特异性 扩增带;采用混合样提取的,某些位点出现三带、强弱带等状况,则需要通过单个个体提取进行甄别 77.5.1.4采用混合样检测,无论是毛细管电泳还是PAGE电泳,结果表明在引物位点出现异质性而无 法识别特异谱带或特异峰的,应采用单个个体独立检测,试样至少含有20个个体的数量 若样品在 半以上的引物位点中呈现明显的异质性,可终止真实性鉴定 7.5.2数据分析和读取 毛细管电泳 7.5.2.1 导出电泳原始数据文件,采用数据分析软件按照下列步骤进行数据甄别: a 设置参数:在数据分析软件中预先设置好panel分子量内标、panel的相应引物的Bin; b导人原始数据文件;将电泳原始数据文件导人分析软件,选择panel,分子量内标,Bin,质量控 制参数等进行分析; 甄别过滤处置数据:执行7.5.1的规定 c 分析软件会对检测质量赋以颜色标志进行评分,绿色表示质量可靠无需干预,红色表示质量不过关 或未落人Bin范围内,黄色表示有疑问需要查验原始图像进行确认 数据比对采用7.5.3.1、7.5.3.2方式的,应分别通过同时进行试验的标准样品,参照样品依据引物 选择少量的对照),校准不同电泳板间的数据偏差后再读取扩增片段大小 甄别后的特异峰落人Bin范 围内,直接读取扩增片段大小;若其峰大多不在Bin范围内,可将其整体平移尽量使峰落人Bin设置范 围内后读取数据 7.5.2.2PAGE电泳 对甄别后的特异谱带(见7.5.1)进行读取 扩增片段大小的读取,统一采用两段式数据记录方式 纯合位点数据记录为x/>.杂合位点数据记录为x/Y其中x.Y分别为该位点两个等位基因扩增片 段),小片段数据在前,大片段数据在后,缺失位点数据记录为0/0 7.5.3数据比对 7.5.3.1采用与标准样品比较的,对甄别后的特异谱带(见7.5.2.2)或特异峰(见7.5.2.1),按照在同一 电泳板上的检测样品与标准样品逐个位点进行两两比较,确定其位点差异 7.5.3.2采用毛细管电泳与sSR指纹数据比对平台比对的,按照数据导人模板的要求,将数据及其指 纹截图上传到SSR指纹数据比对平台,进行逐个位点在线比对,核实确定相互间的指纹数据的异同 7.5.3.3采用PAGE电泳与 比对的,按照数据导人模板的要求,将数据上传到 SSR R指纹数据比对平台 SSR指纹数据比对平台,进行逐个位点的两两比对,核实确定相互间的指纹数据的异同 注;采用PAGE电沫与ssR指纹数据比对平台比对较为困难,建议作为参考使用,比对前采取以下措施; a 读取扩增产物片段大小数据的,检测样品与参照样品(附录B)同时在同一电泳板上电泳; b 电泳时间足够,符合7.4.1.2,2的要求; 检测样品存在扩增片段差异较小的,按片段大小顺序重新电泳进行复核确定后读取 7.5.4数据记录 数据比对后,按照位点存在差异或完全相同、数据缺失、无法判定等情形,记录每个引物的位点 状况 12
GB/39917一2021 品种纯度检测程序 8.1DNA提取 DNA提取可任选7.2所列方法 8.2引物筛选和合成 8.2.1针对杂交种品种纯度不同类型异常个体的引物筛选,可参照下列规则进行确定: 对于鉴定自交个体,识别特征为该等位基因具有母本而父本缺失,筛选1对能检测杂合位点 通常表现为双亲互补带)的引物; -对于鉴定异交个体,识别特征为该等位基因具有母本而父本错误,在具备父母本对照或其 SSR指纹数据的条件下,筛选2对以上的引物; 对于鉴定混杂个体,识别特征为该等位基因具有父本而母本错误或不具有父母本,在具备父母 本对照或其SSR指纹数据的条件下,筛选2对以上的引物; -对于同时鉴定自交、异交、混杂个体或者其中两者的,应综合考虑筛选3对以上的引物 对于常规种和杂交亲本种子纯度测定,鉴定异交个体、混杂个体的,各需筛选2对以上的引物 8.2.2本标准推荐了8对品种纯度测定引物(见表3),作为优先筛选的候选引物 筛选时,可用至少含 20粒的小样品进行试验,依据5.2.2的要求,确定适宜的引物或引物组合 推荐8对引物仍未达到筛选 效果的,可选择表1另外40对引物或其他引物进行筛选 表3纯度测定候选引物 染色体 退火温度 标记 引物序列(5'3' 编号 引物 位置bp) 荧光 正向CTTACAGAGAAAcCGGCATcG PR07 RM336 7(21871337 55 VIC 反向.ccTuGTTTGTTTcAGGTTG 正向;CGTCGGATGATGTAAAGCCT PRo9 RM219 FAM 9(7887585 55 反向.CATATcGGcATTcGcCTG 正向;cAAAAAcAGiAGcAGATGAc PR12 RM19 2(2432080 55 PET 反向:CTCAAGATGGACGCCAAGA 正向ATGGAcC'ACAAAcGAcCTTc PR13 RMl195 1(6153019) 55 FAM 反向:CGACTCCCT'TGT'TCTTCTGG 正向:TCTGCAAGCCTTGTCTGATG PR14 RM208 2(35135946 55 PET 反向;TAAGTcGATcATTGTGTGGAcC 正向:TCCTTCAAGAGTGCAAAACC PR18 RM253 6(5425498 PET 55 反向:GCATTGTCATGTC(GAAGCC ATcGATcGATCTTCAcGAGG 正向:A PR23 RM224 11(27201740 55 NED 反向:TGCTATAAAAGGCATTCGGG 正向;AGCACAAGTAGGTGCATTTC PR27 RM8277 328805073) 55 NED 反向;ATTTGccTGTGATGTAATAGc 13
GB/T39917一202 8.2.3选定引物后,按照电泳方法的不同,依据7.1要求合成引物 8.3PCR扩增 反应体系和反应程序执行7.3的要求,形成扩增产物 8.4扩增产物分离 8.4.1琼脂糖凝胶电泳 8.4.1.1制胶 按琼脂糖浓度为2.0%比例的要求,称取一定量琼脂糖,加人1×TAE电泳缓冲液,混合煮沸溶解 溶液冷却至60C,加人核酸染色剂混匀,倒人已封好的凝胶灌制平台上,插上样品梳 待凝胶完全凝固 后,从制胶平台上除去封带,拔出梳子,置人盛有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中,缓冲液液面高出凝 胶表面约1mm 8.4.1.2电泳 取10L扩增产物(见8.3),加人2L核酸染料指示剂,混匀,用微量移液器加到样品孔中 接通 电极,在最高电压不超过5V/cem(100V~150V恒压电泳)下进行电泳,使扩增产物从负极向正极移 动 当祺酚蓝迁移的位置表明已足够分离DNA扩增片段时,关闭电源 8.4.1.3鉴定 取下凝胶,在凝胶成像系统或紫外投射仪上观察鉴定,并照相保存 8.4.2荧光毛细管电泳 荧光毛细管电泳执行7.4.3的要求 8.5数据分析 通过电泳后呈现的特异谱带(见8.4.1.3)或特异峰(见8.4.2),依据8.2.1的规则,准确识别该品种正 常个体、异常个体指纹图谱或数据,记录每个检测引物位点的信息 结果计算与表示 g.1真实性鉴定 统计位点差异记录的结果,计算差异位点数,核实差异位点的引物编号 检测结果用检测样品和标准样品比较的位点差异数目表示,检测结果的容许差距不能大于2个等 位位点 9.2纯度测定 检测结果根据检测目的,可使用检测样品的自交个体,其他异常个体数目表示,也可使用正常个体 数目(检测试样总数减去异常个体数目)占检测试样总数的百分率表示 统计与检测样品正常表现不一致的异常个体数,计数个体数目或计算其百分率,检测结果的容许差 距应符合GB/T3543.1的要求 14
GB/39917一2021 0结果报告 10.1真实性鉴定 10.1.1按照GB/T3543.1的检验报告要求,对品种真实性验证或身份鉴定的检测结果进行填报 10.1.2对于真实性验证,选择下列方式之一进行填报 通过 对引物,使用混合样(或单个个体),采用 电泳方法进行检测,与标准样品比 a 较未能检测出位点差异 b通过 对引物,使用混合样(或单个个体),采用 电泳方法进行检测,与标准样品比 较检测出差异位点数 个,差异位点的引物编号为 10.1.3对于真实性身份鉴定,采用下列方式进行填报 对引物,采用 通过 电泳方法进行检测,经与DNA指纹数据比对平台筛查并鉴定,检 测样品属于×××品种,或者属于Xx×、 、××××其中的一个 10.1.4属于下列情形之一的,需在检验报告中注明: -送验样品低于5.4.l.1规定数量的; 与DNA指纹比对平台进行数据比对的; 检测样品遗传不稳定严重的位点(引物编号)清单; 检测采用了其他sSR引物的名称及序列 10.2纯度测定 10.2.1按照GB/T3543.1的检验报告要求,可以选择下列方式之一进行品种纯度检测结果的填报 通过编号为 的引物,检测了 个个体,采用 电泳方法,检测出自交个体 aa 其他类型杂株个体 的引物,检测了 b)通过编号为 个个体,采用 电泳方法,检测出自交个体和其 他类型杂株个体 个,品种纯度为 % 0.2.2属于下列情形之一的,需在检验报告中注明 送验样品低于5.4.2.1规定数量的 异常个体仅检测自交个体的; 检测样品遗传不稳定严重的位点(引物编号)清单; 检测采用了其他ssR引物的名称及序列 15
GB/T39917一2021 附 录 A 规范性附录) 溶液配制 DNA提取 A.1 A.1.10.5mmo/LEDTA溶液 Na,EDTA2H,o186.1g溶于800mL水中,加固体Na(oH调pH至8.0,加水定容至1000mL 高压灭菌 A.1.21mol/LTris-HHC溶液 Tris碱60.55g溶于适量水中,加HCl调pH至8.0,加水定容至500mL,高压灭菌 A.1.30.5mol/L，IHCI溶液 浓盐酸(36%38%25ml,加水定容至500mL A.1,45mol/LNaC溶液 固体NaCl146.0g溶于水中,加水定容至500ml A.1.5CTAB提取液 固体NaCl81.7g、CTAB20.0g、1mol/儿LTris-HCl100ml和0.5mol/几EDTA40ml,加水定容 至1000ml,高压灭菌,4C贮存 A.1.6SDS提取液 1mol/LTris-HCl50mL,0.5mol/LEDTA40ml,5mol/儿NaCl50ml和SDs7.5g,加水定容 至500ml,高压灭菌,4贮存 A.1.7TE缓冲液 lmol/LTris-HCl5mL和0.5mol/LEDTA1mL,加HCIl调pH至8.0,加水定容至500mL,高 压灭菌,4C贮存 A.2PCR扩增 A.2.1dNTP 用TE缓冲液分别配制dATP,dTTP,dGTP,dCTP终浓度为100mmol/L的储存液 各取20L混 合,用120ALTE缓冲液定容,配制成每种核苷酸终浓度为10mmol/的工作液 高压灭菌,一20 贮存 A.2.2sSSR引物 用TE缓冲液分别配制正向引物和反向引物至浓度为5mol/L的工作液 16
GB/39917?2021 A.2.325mmol/L??(MlgCl)? MgCl11.19g,?500nmL??20C档 A.3? A.3.140%PAGE ?190.0?????10.0g,?500ml A.3.26.0%PAGE 400.0g10TBE?100ml.40%PAGE150mL,?1000ml A.3.3???? ??49.75ml?250AL,?50mL A.3.4???? ?????1m??迻??5l.? A.3.5??? 2%??? A.3.625%? 0.25g1ml? A.3.710TBE? Tris108.0g55.00.5mol/LEDTA37mL,?1000mL A.3.81TBE? 10TBE?500ml.,?5000ml A.3.96?-???? 0.25g?FF0.25g40.0g,?100mL A.3.106? ??49ml,0.5mol/EDTA1nml?0.125g??FF0.125g? A.3.1150xTAE? Tris242g,57.1mL0.05mol/LEDTA100mL,?1000mL A.3.121TAE? 0xTAE?100mL,?5000mL 17
GB/T39917一2021 A.4银染溶液 A.4.1固定液 冰醋酸100mL,加水定容至10o0mL A.4.2染色液 硝酸银1.0g,加水定容至1000mL A.4.3显影液 固体NaOH15g和甲醛5ml,加水定容至1000mlL 18
GB/39917一2021 附录 B 资料性附录 等位基因扩增片段信息 表B1列出了48对引物在已知稻品种中扩增的片段长度范围、主要等位基因扩增片段大小,以及参 照样品对应的扩增片段信息 其中参照样品只是列举,考虑到在某一SSR位点多个品种存在相同的扩增 片段大小,确认某一品种在该位点扩增片段大小与参照样品是相同的,该品种也可替代相应的参照样品 表B.1已知品种主要等位基因扩增片段信息 引物 等位基因扩增片段 参照样品 编号 名称 范围/bp 片段定义/bp 名称 扩增片段/bp 号 159 川7 159/159 162 白芒稻 162/162 80 180/195 金优1398 183 PR01 RM583 159198 186 元子占稻 186/186 189 天优华占 189/192 92 协优084 92/195 95 R30 95/195 198 239 239/239 合江18 248 263 金优1398 263/278 269 272 PR02 RM424 239287 275 278 278/278 竹云糯 281 281/281 浙场9号 284 广陆矮4号 284/284 287 川7号 287/287 80 紫香糯 80/8o 89 川7号 89/89 PR03 RM85 80~104 安育早1号 95 95/95 104 齐粒丝前 104/104 02 102/102 元子占稻 PR04 RM471 102~12o 104 104/104 竹云糯 106 川7号 106/106 19
GB/T39917一2021 表B.1续 等位基因扩增片段 参照样品 引物 编号 范围/bp 片段定义/bp 扩增片段/bp 名称 名称 108 110o 川 PR04 RM471 102120 ll4 号 l4/1l4 ll6 120 153 153/156 金优1398 156 156/162 协优084 PR05 RM598 153~165 159 162 三香628 162/162 165 l03 106 川7号 106/106 108 金优1398 108/122 112 PR06 RM190 l03126 120 120/120 竹云糯 122 合江18 122/122 124 桂花黄 124/124 126 127 130 136/136 136 Daelipl 139 139/193 宜香101 142 145 旱轮稻 145/145 148 合江18 148/148 151 陆川早1号 151/151 协优084 154 54/193 PR07 RM336 127~196 157 桂花黄 57/157 160/160 l60 红壳老来青 163 元子占稻 163/163 CPY2199 166 166/166 169 172 175 154/175 天优华占 193 193/193 轮回01 196 20
GB/39917一2021 表B.1续 等位基因扩增片段 参照样品 引物 编号 范围/bp 片段定义/bp 扩增片段/bp 名称 名称 151 154 154/163 协优084 16o 白芒稻 160/16o 163 金优1398 163/169 66 紫香糯 66/166 169 Yumetoiro 69/169 172 1727" 172 轮回01 175 175/175 红壳老来青 178 Tsukushiakamochi 178/178 PR08 RM72 151214 181 184 187 CPY2199 187/187 190 合江18 90/190 193 Kosilikar 93/193 96 199 199/199 Dasanbyeo 202 205 214 182 84 190 CPY2199 190/190 192 192/192 白芒稻 94 天优华占 94/214 196 PR09 RM219 182248 200 Yumetoiro 200/200 202 桂花黄 202/202 208 214 214/220 金优1398 220 R3o 220/220 232 248 21
GB/T39917一2021 表B.1续 等位基因扩增片段 参照样品 引物 编号 范围/bp 片段定义/bp 扩增片段/bp 名称 名称 130 丽水糯 136/136 136 139 金优1398 139/145 PR10 RM590 130148 l42 中|168 142/142 145 陆川早1号 145/145 148/148 148 Yumetoiro 126/126 126 合江18 128 130 132 132/152 金优1398 34 PR11 RM209 126~162 144 150 CPY2199 150/150 152 竹云糯 152/152 154 158/158 158 川7号 162 213 216 216/216 合江18 219 222 昌米01l1 222/222 PR12 RM19 213252 228 228/228 川7号 237 246 金优1398 246/252 249 249/249 竹云糯 252 齐粒丝苗 252/252 138 140 金优1398 l40/148 142 天优华占 142/146 144 桂花黄 144/144 PR13 RM1195 138152 浙场9 146 号 146/146 丽水糯 l48/148 148 150 合江18 150/150 152 鄂糯10号 152/152 22
GB/39917一2021 表B.1续 等位基因扩增片段 参照样品 引物 编号 范围/bp 片段定义/bp 扩增片段/bp 名称 名称 159 165 竹云糊 165/165 167 金优1398 167/179 17 合江18 171/17 PR14 RM208 159~181 175 广陆矮4号 175/175 177 179 179/179 轮回0 181 181/181 紫香糊 138 Tsukushiakamochi 138/138 44 金优1398 144/160 146 50 浙场9号 50/150 152 桂花黄 52/152 7号 154 么 154/154 PR15 RM232 138168 158 合江 18 158/158 16o 160/160o 轮回01 陆川早1号 62 62/162 164 矮糯 164/164 66 168 163 166 166/169 宜香101 163172 PR16 RMl19 169 169/169 轮回0 72 浙场9号 72/172 138 元子占稻 138/138 50 Dasanbyeo 50/150 154 金优1398 154/156 PR17 RM267 138~168 156 浙场9 号 156 156/ 62 162/162 矮糯 168 川7号 168/168 117 PR18 117~l49 119 RM253 123 23
GB/T39917一2021 表B.1续 等位基因扩增片段 参照样品 引物 编号 范围/bp 片段定义/bp 扩增片段/bp 名称 名称 27 129 131 合江18 131/131 133 金优1398 133/14 135 元子占稻 135/135 PR18 RM253 117149 37 浙场9 号 14 141/141 143 145 149 旱轮稻 149/149 138 l4 l44 14打7 147/162 金优1398 15o 153 156 159 轮回01 159/159 162 陆川早1号 162/162 PR19 RM481 138189 165 竹云糯 165/165 l68 合江18 168/168 171/171 171 元子占稻 174 川7号 174/174 77 180 183 浙场9号 183/183 186 广陆矮4号 186/186 广灿2 号 189/189 189 140 合江 18 140/140 143 143/143 轮回on1 PR20 RM339 140182 146 天优华占 146/158 149/149 149 紫香糯 158 陆川早1号 158/158 24
GB/39917一2021 表B.1续 等位基因扩增片段 参照样品 引物 编号 范围/bp 片段定义/bp 扩增片段/bp 名称 名称 176 PR20 RM339 140182 179 182 白芒稻 182/182 196 金优1398 196/200 198 轮回01 98/198 200 合江18 200/200 PR21 RM316 196~214 202 紫香糯 202/202 204 204/204 Yumetoiro 214 28 金优1398 128/136 130 PR22 RM258 128~146 32 陆川早1号 32/132 136 广陆矮4号 36/136 146 轮回01 146/146 117 20 120/120 合江18 23 125 元子占稻 125/125 28 协优084 28/143 131 陆川早1号 131/131 134 PR23 RM224 117159 37 139 43 川7号 143/143 153 金优1398 153/155 55 紫香糯 55/155 157 竹云糯 157/157 159 159 159/185 协优 084 161 CPY2199 161/16 PR24 RM17 159189 69 桂花黄 69/169 171 川7号 171/171 177 25
GB/T39917一2021 表B.1续 等位基因扩增片段 参照样品 引物 编号 范围/bp 片段定义/bp 扩增片段/bp 名称 名称 183 159~189 广陆矮4号 PR24 RM17 185 185/185 189 元子占稻 212 212/212 宜香101 224/239 224 233 236 金优1398 236/245 239 R30 239/239 212~266 PR25 RM493 245 轮回01 245/245 248 248/248 浙场9号 254 263 263/263 竹云糯 266 81 185 竹云糯 185/185 187 合江18 87/187 PR26 RM561 181195 9 Dasanbyeo 91/191 193 195 195/195 桂花黄 167 CPY2199 67/167 170 179 182 185 浙场9号 185/185 金优 188 1398 188/191 轮回01 191 91/191 194 PR27 RM8277 167一217 197 200 桂花黄 200/200 丹糯2号 203 203/203 206 209 209/209 元子占稻 212 合江18 212/212 215 217 川7号 217/217 26

主要农作物品种真实性和纯度SSR分子标记检测稻GB/T39917-2021

随着我国农业生产的不断发展，保证农作物品种的真实性和纯度越来越受到关注。其中，基于分子标记技术的检测方法因其高效、准确等特点，成为了保证农作物品种真实性和纯度的重要手段之一。针对稻作这一主要农作物，最新发布的《主要农作物品种真实性和纯度SSR分子标记检测稻GB/T39917-2021》旨在为相关领域提供更加科学、规范的操作指南。

该标准明确了检测的目的、原则和适用范围，并提供了一系列检测方法和标准。其中，最为重要的是对于SSR分子标记技术的详细介绍和操作指导。该技术针对稻作中常见的品种特征进行检测，可以快速、准确地鉴定稻作品种的真实性和纯度。

此外，该标准还对于样品的采集、保存和预处理等方面进行了规范，并且明确了检测结果的判定标准和质量控制要求。通过建立科学规范的操作流程和监管机制，可以保证稻作品种信息的准确性，有助于促进农业生产的发展和优化。

总之，《主要农作物品种真实性和纯度SSR分子标记检测稻GB/T39917-2021》的发布，为保障我国农作物品种信息的真实性和纯度提供了更加有效和可靠的技术支持。希望广大从事相关领域的专业人士能够深入研究和应用该标准，推动我国农业生产和科学技术的发展。

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