基于生物效应含碳基纳米材料生物样品的透射电子显微镜检测方法

基于生物效应含碳基纳米材料生物样品的透射电子显微镜检测方法

国家标准 GB/T33839一2017 基于生物效应含碳基纳米材料 生物样品的透射电子显微镜检测方法 NMethodtsoftramsmissioneeronmierosopeforbiologieallspeeimeneomtaming earbon-baselnanomaterialsinvolvingbhologiealefftect 2017-05-31发布 2018-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/33839一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国微束分析标准化技术委员会(SAC/TC38)提出并归口 本标准起草单位:人民解放军第二军医大学、计量科学研究院、国家纳米科学中心 本标准主要起草人:杨勇骥、汤莹、高思田、任玲玲、王孝平、葛广路
GB/T33839一2017 引 言 广泛应用的碳基纳米材料是否会对生物系统造成危害目前还不清楚 其原因主要有三:一是对各 种尺度的碳基纳米材料的生物学效应不明确,包括:是否能进人生物体、如何进人生物体,进人生物体后 是否影响生物体的功能;二是对进人生物体的纳米材料的测试缺乏足够的技术及测试标准;三是纳米材 料对生物体的安全性效应测试也无标准可寻,造成纳米材料对生物体安全性的不明确 因此,制定这三 方面的标准体系是纳米材料在生命科学研究中的重要基础 目前用于碳基纳米材料生物效应研究的方法很多,但用电子显微镜观察细胞超微结构更加直观 因此,研究碳基纳米材料对生物组织细胞乃至生物体形态结构的影响,目前还是以电子显微镜为主,建 立其相关检测标准是碳基纳米材料应用于生物医学的关键 为了规范含碳基纳米材料生物样品的制备 程序,正确指导透射电镜检测工作,有必要制定本标准
GB/33839一2017 基于生物效应含碳基纳米材料 生物样品的透射电子显微镜检测方法 范围 本标准规定了用透射电子显微镜(以下简称透射电镜)检测含有碳基纳米材料的生物样品超微结构 的技术和规范 本标准适用于含碳基纳米材料的生物薄试样透射电镜分析检测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T188732008生物薄试样的透射电子显微镜-X射线能谱定量分析通则 GB/T19619-2004纳米材料术语 术语和定义 GB/T19619-2004界定的以及下列术语和定义适用于本文件 3.1 碳基纳米材料carbon-basednanomaterials 分散相尺度至少有一维小于100nm的碳材料 注，分散相由碳原子组成 碳基纳米材料主要包括三种类型,即一维碳基纳米材料(包括碳纳米管和碳纳米纤维 等),二维碳基纳米材料包括石墨烯和纳米石墨片等)以及零维碳基纳米材料包括碳纳米颗粒和富勒烯球 等 3.2 生物效应biologiealeffteet 纳米材料与生命过程的相互作用导致生物体形态结构及功能的变化 3.3 生物薄试样biologicalthinspeeimen 采用超薄切片机切片厚度为40nm~ -100nm的生物试样,用于透射电镜观察 方法原理 碳基纳米材料的表面理化特性使其易形成团聚,，经分散后与生物体接触 碳基纳米材料与生物体 接触后,需采用超微结构制样方法,制成生物薄试样 在透射电镜下检测碳基纳米材料作用于生物体后 产生的细胞及细胞器的超微结构变化,以确定碳基纳米材料对生物体的生物效应 用高能电子束照射 生物薄试样的微小区域,人射的电子束大部分透过薄试样,透射电子携带有生物薄试样内部信息,成像 形成生物薄试样的超微结构图像
GB/T33839一2017 5 仪器设备、,试剂和环境条件 5.1仪器设备 5.1.1透射电镜 5.1.2超薄切片机 5.1.3制刀机 5.1.4玻璃刀或钻石刀 5.1.5恒温烘箱 5.1.6超声波清洗仪 5.2试剂 5.2.1戊二醛 5.2.2四氧化锻 5.2.3乙醇 5.2.4丙酮 5.2.5环氧树脂包埋剂 5.2.6醋酸双氧铀 5.2.7枸橡酸铅 5.3环境条件 超薄切片机、透射电镜的工作环境应符合以下要求: 超薄切片机相对湿度小于60%,温度(20士5)C,电源电压(220士22)V a b) 透射电镜;相对湿度小于60%,温度(20士5)C,电源电压稳定(220士22)V,具备仪器专用地 线,接地电阻值参照仪器说明书的要求 6 含碳基纳米材料的生物薄试样制备 6.1碳基纳米材料的分散 6.1.1将碳基纳米材料与溶剂按一定的比例充分混和 6.1.2采用超声波进行分散 6.1.3将不同浓度、已分散的碳基纳米材料悬液约10aL滴在有支持膜(Fomvar膜或碳膜)的透射电 镜专用载网上,干燥后待检 6.2含碳基纳米材料的生物组织 6.2.1取材;将含碳基纳米材料的生物组织在2%或3%戊二醛固定液(4C)中迅速切成小于1 mm” 的小块 配制戊二醛固定液可参考附录A . 6.2.2前固定;将小块组织浸泡在20倍体积、4C的2%或3%戊二醛固定液中固定1h4h,用 0.lmol/L磷酸缓冲液充分漂洗 6.2.3后固定:将生物小块组织浸泡在1%四氧化锻固定液,4C固定2h 配置四氧化俄固定液可参 考附录B 6.2.4脱水;用乙醇或丙酮梯度脱水 建议乙醇或丙酮梯度脱水的顺序为30%,50%、70%,90%乙醇
GB/33839一2017 15 各一次;90%丙削1次,100%丙酮3次;每次10min~ mmina 6.2.5包埋:在按比例配制好的Epon812环氧树脂包埋剂中浸透后,在胶囊(或硅胶包埋板)内进行包 埋 建议浸透比例为,丙酮:包埋剂浸透时间:1:1(1h2h);1:2(12h);纯包埋剂(1h). Epon812环氧树脂包埋剂配制比例可参考附录C 6.2.6聚合:在恒温烘箱内进行聚合,37C聚合12h后,升温至60C聚合36h48h 修块;包埋块在进行超薄切片之前,将分析部位修成易于超薄切片的形状 6.2.7 6.2.8超薄切片;采用超薄切片机将已修好的包埋块切成超薄切片,并将切片捞至载网晾干,切片厚度 般要求在40nm~100nm 6.2.9染色;采用醋酸双氧铀和枸橡酸铅对超薄切片进行重金属盐染色后待检 6.3含碳基纳米材料的培养细胞 6.3.1前固定;用细胞刮将细胞从培养皿底部刮下或胰酶消化下来,低速离心(2500r/min,5tmin)成 小团块于离心管底部,弃上清液,加人3%戊二醛,吹散细胞团块,4C冰箱固定1 4h. h 6.3.2凝块:用1mol/L磷酸缓冲液漂洗3次后,加人小牛血清,使细胞悬浮于血清中后，离心 (40001 r/min,5min)成小团块,弃上清液,沿管壁加人2%或3%戊二醛固定液,放人4C冰箱固定过 夜 将细胞团块切成小于1mm'的小块,用1mol/1磷酸缓冲液轻轻充分漂洗 6.3.3后固定;将细胞小块浸泡于1%四氧化俄,放人4C冰箱固定1.5h~2h 6.3.4脱水(同6.2.4. 6.35包埋(同6.25) 6.3.6聚合(同6.2.6). 6.3.7修块(同6.2.7) 6.3.8超薄切片同6.2.8) 6.3.9重金属盐染色(同6.2.9)后待检 测量方法 7.1测量前的准备 7.1.1透射电镜准备工作 7.1.1.1开机,抽真空至电镜正常工作所需的高真空后再稳定30min以上 7.1.1.2选择加速电压,检测生物薄试样所需的加速电压选择在60kV120kV之间 7.1.1.3调节电子枪的灯丝电流,使束流处于稳定饱和状态 7.1.1.4对电子光学系统进行对中调整,消除像散,使透射电镜处于最佳工作状态 7.2测量步骤 7.2.1碳基纳米材料 7.2.1.1将干燥的碳基纳米材料试样放人透射电镜 7.2.1.2在低倍(3000倍一4000倍)下寻找合适的试样部位,要求被分析试样无损、,无污染 7.2.1.3在高倍(40000倍50000倍)时观察碳基纳米材料的分散情况和形貌,测量其尺寸并记录实 验结果 7.2.2生物薄试样 7.2.2.1在低倍(小于4000倍)下寻找合适的生物薄试样部位,要求被分析试样无破损、无污染、无振
GB/T33839一2017 颤条纹 7.2.2.2将确定的试样分析部位置于电子显微镜的观察中心 7.2.2.3逐步增加放大倍数(一般放大倍数在10000倍50000倍即可),寻找细胞内外,细胞器内外 有无碳基纳米材料 7.2.2.4仔细分析纳米材料分布的位置,注意区分样品制备过程中引人的污染物和碳基纳米材料 无 法判别时,建议按GB/T18873一2008规定的X射线能谱分析方法对颗粒物进行定性分析 7.2.2.5精确聚焦图像并存储实验结果 8 检测报告 分析结果报告应包括以下信息: a 分析报告的唯一编号; b 送样人姓名、单位和地址; 样品的接收日期 分析仪器及其工作条件 d 分析结果和必要的说明 分析报告负责人的签字; 分析报告的页码; g h 实验室名称和地址; 分析报告的日期
GB/33839?2017 ? A ?? ??? 2.0%???(??,pH7.3) A.1 ?0.2mol/L??(pH7.3)50ml,?25%???8mL,?? 100mL?? A.23.0%???(??,pH7.3): ?0.2mol/L??(pH7.3)50mL,?25%???12mL,?? 100ml?? ?:???á
GB/T33839一2017 附 录 B 资料性附录) 四氧化锻固定液配制 B.1配制2%四氧化饿贮存液: 将装有四氧化饿的安部(共2g)洗净,用玻璃划割器刻痕,再用双蒸水冲洗几次,放人洁净棕色广口 玻璃瓶内,加上100ml双蒸水,用洁净玻璃棒捣破安瓶 然后用封口膜将广口玻璃封口,贴上标签,置 于干燥器中，4C保存备用 B.2配制1%四氧化锻固定液(磷酸缓冲液,pH7.3) 等量0.2mol/儿磷酸缓冲液(pH7.3)与2%四氧化俄贮存液混合,现配现用
GB/33839?2017 ? C ?? ?Epon812 ?Epon812?c.1 c.1?Epon812? DDSA MNA Epon812 DMP-30 3" 5g 0.16mL 2g 0ml. 4g 6g 0" 0.32ml 20ml. 6g 9g 15g 0.48ml 30ml n812-DMP-30 ?:?Epon812?:DDsA?MNA- +Epon8

基于生物效应含碳基纳米材料生物样品的透射电子显微镜检测方法GB/T33839-2017

含碳基纳米材料因其具有良好的生物相容性和多种生物效应而成为生物医学领域中备受关注的新型材料。在研究这些材料时，准确、可靠的检测方法至关重要。GB/T33839-2017标准规定了一种透射电子显微镜检测方法，用于对含碳基纳米材料在生物样品中的形貌、大小、分布等进行分析。

该方法的主要流程如下：

1. 制备含碳基纳米材料生物样品，并采取合适的方式将样品固定在网格上。
2. 使用透射电子显微镜对样品进行观察和拍摄。
3. 利用软件或者其他方式处理得到的图像，对含碳基纳米材料的形貌、大小、分布等进行分析。

在该方法中，需要注意的是样品制备和观察过程中的一些细节问题，如样品固定的方式、透射电子显微镜参数的设置等。此外，对于具有生物效应的含碳基纳米材料生物样品，在透射电子显微镜检测前还需进行必要的生物安全评估。

总之，GB/T33839-2017标准规定的透射电子显微镜检测方法是一种较为科学、可靠的含碳基纳米材料生物样品分析方法，对于研究这些材料的性质和应用具有重要意义。

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