动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法实时荧光PCR方法

动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法实时荧光PCR方法

国家标准 GB/21102一2007 动物源性饲料中兔源性成分定性 检测方法实时荧光PCR方法 Identificationofrabbitderivedmaterialsinanimal-originatedlfeedstufs一 timePCRmethot Real 2007-10-24发布 2008-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21102一2007 前 言 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 本标准主要起草单位:辽宁出人境检验检疫局、宝生物工程(大连)有限公司、 检验检疫科学研究院、山东出人境检验检疫局、深圳出人境检验检疫 局、上海出人境检验检疫局 本标准主要起草人;郑秋月、李晶泉、王玉萍、徐昊、曹际娟、于爱丽、张舒亚、陈颖、徐宝梁、高宏伟、 宗卉、金东权 本标准首次发布
GB/T21102一2007 动物源性饲料中兔源性成分定性 检测方法实时荧光PCR方法 范围 本标准规定了动物源性饲料中兔源性成分实时荧光PCR检测方法,该检测方法的检出限为 0.1% 本标准适用于动物源性饲料中兔源性成分的定性检测 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样(GB/Tl4699.1 -2005,ISO6497;2002,IDT) SN/Tl193基因检验实验室技术要求 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 实时荧光CRrealtimePCR 实时荧光聚合酶链式反应 3.2 Ct值eyeletime 每个反应管内的荧光信号达到设定的阂值时所经历的循环数 原理 采用TaqMan实时荧光PCR技术,根据线粒体DNA的细胞色素C氧化酶亚单位I(cytochrome oxidasesubunitI,COXI)基因上动物种间多态性的差异而进行兔源性成分鉴定 利用裂解液破碎细 胞,三氯甲烧抽提蛋白质,异丙醇沉淀得到DNA;以提取的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增 本 标准应用多色荧光检测技术,采用多重PCR方法.将所用试剂配制成预混合形式,组建成实时荧光 PCR兔DNA检测试剂盒 对反应液中含有的两种不同荧光染料进行双通道同步检测,在同一反应管 内对兔的cOXI基因及内参照基因同时进行扩增,并通过标记两种不同荧光物质6-拨基荧光素(G-car boxyfluorescein,FAMI),5-六氯荧光素(5-hexachloro-fluorescein,HEX)的探针进行特异性杂交,两色荧 光同步检测 其中,对内参照反应的检测,可以监控反应是否正常进行,防止假阴性结果 观察实时荧 光PCR的增幅曲线,从而对饲料中兔源性成分进行快速检测 5 试剂与材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,实验用水符合GB6682的要求 5.1DNA提取用试剂 5.1.1 三氯甲婉
GB/T21102一2007 1.2异戊醇 5. 5.1.3异丙醉 5. 1.470%乙醇 nmide,十六婉基三甲基澳化铵).0.05nmolL 5.1.5裂解液;1%CTAB(cetyl IK thylammonid umbrom Tris-HCl(pH8.0)[Tris-;trishydroxymethylaminomethane,三(胫甲基)氨基甲婉]，0.7mol/儿L NaCl.0.01mol/LEDTApH8.0)(ethylenediaminetetraaceticaeid,乙二胺四乙酸) 5.1.6TE缓冲液(Tris-HCI、EDTA缓冲液);10mmol/LTris-HClpH8.0),1mmol/L EDTA (pH8.0) 5.2实时荧光PCR兔DNA检测试剂盒 5.2.12×兔源性检测预混合液:含有ExTaHs(终浓度1.25U/25L.),dNTPs(终浓度各 0.4mmol/I)、Mg十终浓度3mmol/L) 兔源性检测引物混合液了含有扩增兔基因组DNA及内参照的引物(序列详见表1)内参照 5.2.2 入DNA 各引物终浓度0.14mol/Ll.0丛mol/L 表1兔及内参照引物序列 名 称 序 列 兔5'-引物 5’'-TAATCGTCACCGCACATGCC-3 5'-cTATG;TCAGG;AG;ccccAATTATcA-3 兔3'-引物 内参照5'-引物 5'-GGCTGATTGACCGGCAGATTA-3" 内参照3'-引物 5'-GCGGGTATAGGTTTTATTGATGGC3 5.2.3兔源性检测探针混合液;检测兔基因组DNA的探针及检测内参照的探针(序列详见表2) 探 针浓度与使用的实时荧光PCR扩增仪,荧光标记物质种类有关,实际使用时请参照仪器说明书,或各荧 光探针的具体使用要求进行 表2兔及内参照探针序列 名 称 列 兔探针 5'(FAMM)-ACAAGcCAGTTcccGAAccTccA-3'(Edlipse) 内参照探针 5'HEX)-CCGCCACGACGATGAACAGAcGCT-3'Eclipse 5.2 阳性对照;用已知含哺乳动物源性成分的样品作阳性对照 5.2.5双蒸水 仪器设备 6.1实时荧光PCR检测系统 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 电子天平;感量0." g 6 离心机:离心力12o00g 微量移液器:0.5l10L,10l100L,10l200AL,100L1000L 实时荧光PCR反应管 恒温水浴箱 试样选取与制备 按照GB/T14699.1采样,将实验室样品粉碎,充分混合均匀后待用
GB/T21102一2007 检验步骤 8.1样品的总NA提取 称取适量饲料(饲料粒度为100目称取50mg;60目称取100mg;20目称取200mg)于1.5mL离 min,吸 心管中,加人600l800l裂解液,65C30min,每隔10min振荡混匀;12000r/min离心51 取上清液至一新离心管中,加400L三氯甲婉十异戊醉(24+1),充分混匀;12000r/min离心5min 吸取上清液至一新离心管中,加0.8倍体积异丙醇,室温下沉淀1h~2h;12000r/min离心10min,弃 上清液;70%乙醇洗涤一次,晾干;加人50LTE,溶解沉淀 也可用等效的DNA提取试剂盒提取模板DNA 8.2DNA浓度和纯度的测定 nm和 取5lDNA溶液加双蒸水稀释至1ml使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260 280nm处的吸光值A和A DNA的浓度按式(I)计算 c=A×N×50/100o0 式中: -DNA浓度,单位为微克每微升4g/AL); -260nm处的吸光值; 核酸稀释倍数 N 当A/A比值在1.7一1.9之间时,适宜于cR扩增. 8 实时荧光CR检测 8.3.1反应体系的体积为25L.2×兔源性检测预混合液加12.5L.兔源性检测引物混合液和兔源 性检测探针混合液各加lAl,样品DNA(ng/Al100ng/AL)lL,加双蒸水至25Al 在各实时荧光PCR反应管中加人上述试剂后，盖紧管,离心5s一10s 8 3. .2 8.3.3将离心后的实时荧光PCR反应管放人实时荧光PCR检测系统内,记录样本摆放顺序 8.3.4实时荧光PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整 一般的反应程序为: 95C10s,1个循环;95C5s,60C30s,40个循环,在每次循环的退火时收集荧光 8.3.5检测结束后,根据扩增曲线和C值判定结果 8.3.6检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照 用已知含兔源性成分的样品作阳性对照 用已知不含兔源性成分的样品作阴性对照,用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照 注，也可用等效的兔源性成分实时荧光PCR检测试剂盒进行实时荧光CR检测 结果判断与表述 9 结果分析条件设定 直接读取检测结果 值设定原则根据仪器噪声情况进行调整 结果判定 9.2.1对照结果 空白对照;无FAM荧光信号检出 有HEX荧光信号检出,Ct值应<35.0 阴性对照;无FAM荧光信号检出 有HEx荧光信号检出.C'值应<35.O. 阳性对照:有FAM和HEX荧光信号检出 且FAM通道出现典型的扩增曲线,Ct值<28.0 否则,实验视为无效 9.2.2检测结果的判定 Ct值<35为有效值,Ct值>35为无效值(详见表3).
GB/T21102一2007 表3结果的判定情况 FAM荧光 HEX荧光 结果判定情况 同时进行的阴性、阳性,空白对照实验结果正常,检测实际样品时,如果有FAM 荧光和HEx荧光检出,且ct值<35,判定为含有兔源性成分;如果c值> 35， 可视为不含有兔源性成分 同时进行的阴性、阳性,空白对照实验结果正常,检渊实际样品时,HEx荧光信 号未检出,Ct值>35(如果检测样品浓度高会抑制内参照DNA的扩增);如果有 FAM荧光检出,且Ct值<35,判定为含有兔源性成分;如果FAM荧光Ct值 35,可视为不含有兔源性成分 同时进行的阴性、阳性,空白对照实验结果正常,检测实际样品时有HEx荧光 检出,无FAM荧光检出,判定为不含有兔源性成分 PCR反应失败 注意以下儿个方面后再次进行反应 如果同时进行的阳性对照实验结果正常,则可能是样品DNA制备有问题,如 样品中可能存在PCR反应的抑制物等 如果同时进行的阳性对照实验结果不正常,则可能是实验操作失败或试剂 失活 9.3结果表述 检出免源性成分 未检出免源性成分 10检测过程中防止交叉污染的措施 按照sN/T1193执行 11 废弃物处理 检测过程中的废弃物,收集后在焚烧炉中焚烧处理