饲料中氯霉素的测定高效液相色谱串联质谱法

饲料中氯霉素的测定高效液相色谱串联质谱法

国家标准 GB/21108一2007 饲料中氯霉素的测定 高效液相色谱串联质谱法 Determinationofchoramphenieolinfeeds一 Highperformaneeliquidchromatographytandemmassspeetometry 2007-10-24发布 2008-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21108一2007 前 言 本标准的附录A,附录B为资料性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 本标准起草单位:农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、国家饲料质量监督检验中心 北京). 本标准主要起草人:赵根龙、高生、宋荣、张发旺 本标准首次发布
GB/T21108一2007 饲料中氯霉素的测定 高效液相色谱串联质谱法 范围 本标准规定了测定饲料中氯霉素的高效液相色谱串联质谱法(LC/MS/MS) 本标准适用于配合饲料和预混合饲料中氯霉素的测定,其最低定量限为104g/kg,最低检测浓度 为54g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样(GB/T14699.1一2005,IsO6497;2002,IDT) 原理 饲料中的氯霉素用乙酸乙酯提取.取部分提取液用氨气吹干 残渣溶于甲醇氯化钠溶液,用正己婉 萃取除去脂溶性杂质 再将氯霉素回提至乙酸乙酯,吹干 用乙睛水溶液溶解,过C小柱净化 最后 用Ic/MS/MS法分离、检测和定量 试剂与材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂 水为蒸水,色谱用水符合GB/T6682的一级用水的规定 乙睛:色谱纯 甲醇;色谱纯 4.了乙酸乙雕 我4正己榄 4.5三氧甲烧 4.6乙睛溶液 4.6.1乙睛溶液I取5.0ml乙睛加水95ml 4.6.2乙腊裕液l吸取乙腊50mL加水50mL 4.7氯化钠 4.8氨化钠溶液:浓度为40g/L,称取40.0g氯化钠(4.7)加水溶解定容到1000ml 4.9氧化钠甲醇溶液;取200ml甲醉(4.2)加氯化钠溶液(4.8)800ml 4.10氯霉素标准品:纯度大于98% 4.11氯霉素标准液 4.11.1标准贮备液;准确称取100mg士0.1mg氯霉索标准品(4.10)用乙腊溶解,定容到100ml,该 溶液氯霉素浓度为1mg/ml,密封贮于冰箱内,有效期为一年 4.11.2标准中间液I:吸取标准贮备液(4.11.1)5.00mL,于50mL容量瓶内,用乙晴溶液I(4.6.2 定容至50mL,该溶液氯霉素浓度为100g/mL,密封贮于冰箱内,有效期3个月
GB/T21108一2007 4.11.3标准中间液I:吸取标准中间液I4.11.2)1.00mL于100mL容量瓶内,用乙睛溶液I (4.6.2)定容至100mlL,该溶液氯霉素浓度为1.04g/ml,密封贮于冰箱内,有效期为3个月 4.11.4标准中间液川:吸取标准中间液I(4.ll.3)10.00mL于100ml容量瓶内,用乙睛溶液I 4.6.2)定容至100ml 该溶液氯霉素浓度为100ng/ml,密封贮于冰箱内,有效期为7天 4.11.5标准工作溶液;用移液管分别吸取标准中间液I(4.l1.4)1,5、10,50ml于4个100ml容量 瓶内,用乙睛溶液I(4.6.2)定容至刻度 该溶液氯霉素浓度为1.0,5.0、10,50ng/mL 4.12C固相萃取(SPE)小柱;载体200mg、承载液体体积3ml 仪器 5.1离心机:转速为4000r/min以上 5.2超声波提取器 5.3涡旋混合器 5.4密封盖塑料离心管;50mL 5.5液相色谱串联质谱仪;配备电喷雾离子源(EsD)的液相色谱串联质谱仪 试样的制备 按GB/T14699.1选取有代表性的实验室样品,用四分法缩分至约200g,粉碎过0.45mm孔径 筛,混合均匀,装人磨口瓶中备用 分析步骤 提取 称取一定量的试样(配合饲料5g,预混合饲料1g,精确至0.001g),置于50ml 塑料离心管内 5.4)加40.0mL乙酸乙酯(4.3)盖好密封盖于涡旋混合器上混合2min 放人超声波提取器中提取 20nmin,其间用手摇动两次 将离心管取出,置离心机上(5.1)4000r/min离心分离4min 用移液管 取上清液20ml,于50C加热器上用氮气吹至近干,待净化 7.2净化 7 .2.1液-液分配净化 用氯化钠甲醇溶液(4.9)2、1、1ml分三次溶解残渣(7.1),均转移到同一个l0ml.具塞试管内 加4mL正己炕,涡旋混合2min,放人离心机于4000r/min离心4min,弃去上层正已炕,重复上述操 作一次 水相加乙酸乙酯(4.3)3mL,涡旋混合2min,放人离心机4000r/min离心4min 吸取上层 乙酸乙酯,水相置另一个5mL具塞试管内,加乙酸乙酯(4.3)2mL重复上述操作一次 吸取上层乙酸 乙酯,置于上述同一个水相具塞试管内,置加热器上50C下,用氮气吹干 用3ml乙腊溶液I(4.6.1) 溶解,待SPE小柱净化 7.2.2SPE柱净化 每 -试样各准备一支C小柱(4.12),顺序用5ml甲醇,5ml三氯甲婉,5ml甲醇和10ml.水预 清洗C柱 将样液(7.2.1)过此小柱流速<1mL/min),用5mL乙睛溶液I(4.6.1)淋洗,最后用 3ml乙睛溶液I(4.6.2)洗脱,收集洗脱液于10ml具塞试管内 洗脱液加5ml乙酸乙酯涡旋混合 min,2000r/nmin离心,下层水相用乙酸乙酯重复萃取一次,合并乙酸乙酯提取液于5mL具塞试管 内 在加热器上(50C)用氮气吹干,用2ml乙睛溶液l(4.6.2)溶解,调节试样溶液浓度,使上机浓度 不高于100ng/ml 7.3测定 液相色谱条件 色谱柱:C柱,柱长150mm,柱内径2.1mm,粒度3.5am或性能类似的分析柱
GB/T21108一2007 柱温;室温 流动相组成:乙腊十水=30+70(V+V). 流动相流速;250AL/min. 进样量l0AL 7.3.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI)负离子方式检测 喷雾电压3500V 壳气流速:0.68L/min 辅助气流速;3.6L/min. 毛细管温度:300C 母离子321,二级子离子为257,152,121 碰撞电压如表1: 表1氯霉素的子离子及其碰撞电压 母离子 子离子 碰撞压力/eV 321 257 23 321 152 18 12 321 121 7.3.3试样的测定 在上述仪器条件下,分别注人标准工作液(4.11.5)和试样溶液(7.2.2)10L.以保留时间和二级子 离子(m/z)257、l52、121进行定性,其相对丰度比见表2 以152作为定量子离子,并用氯霉素标准工 作液做单点或多点校准,以峰面积比较进行定量计算 表2氯霉素的子离子及相对丰度比 257 152 121 子离子(G m/z 相对丰度/% 00 90士18 8士4 结果计算与表述 8 结果计算 试样中氯霉素的含量X,以质量分数微克每千克(g/kg)表示,单点校准时可用式(1)计算 V×c×V×n x-旦 P×m×V 式中: P -试样溶液对应的色谱峰面积响应值; V -加人定容液的体积,单位为毫升(mL); 氯霉素标准溶液的浓度,单位为纳克每毫升(ng/ml); 氯霉素标准溶液的进样体积,单位为微升(L): 稀释倍数; 氯霉素标准溶液对应的色谱峰面积响应值; -试样质量,单位为克(g); n V 试样溶液的进样体积,单位为微升(L) 多点校准时可用式(2)计算 Xc.XX" X= 2 m×V
GB/T21108一2007 式中: V -加人定容液的体积,单位为毫升(mL); 标准曲线上查得的试样中氧霉素的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL) G V 氯霉素标准溶液的进样体积,单位为微升(aL); 稀释倍数; -试样质量,单位为克(g); n V -试样溶液的进样体积,单位为微升(AL) 8.2结果表示 结果以平行测定结果的算术平均值表示,保留三位有效数字 重复性 在同一实验室由同一操作人员使用同一仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于10%
GB/T21108?2007 ?A ?? ù?? 321.09 I 0 O a 70 256.95 5 60 a 45 " 241.99 s 217.10 171.17 0 383.89 472.88 317.87 357.88 423,31 25 279.18 494.19 387.07 430.97 0 194.ll 464.76 435.07 l0д 200 250 300 350 400 450 500 m/z ?A.1ù??
GB/T21108一2007 B 附 录 资料性附录 氯霉素特征离子色谱图 RT:4.18 TIC AA;36612 100 0 60- 40- 20 RT:4.15 m/z=256.50-257.50 AA18660 100 805 605 40- 20 RT;4.18 mz=151.50-152.50 AA;16572 100- 800- 60- 0- R RT;4.20 m/么=120.50-121.50 AA:1394 100 80 0 40- 20- min 注;RT为保留时间,单位为分钟(min)AA为峰面积 图B.1氯霉素特征离子色谱图