H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法

H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法

国家标准 GB/T19438.2一2004 H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法 Methodofthereal-timeRT-PrCRforthedeteetionof avianinfluenzavirussubtypeH5 2004-02-14发布 2004-02-15实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 小 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T19438.2一2004 前 言 GB/T19438一2004《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分: GB/T19438.1一2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》; GB/T19438.2一2004《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》; GB/T19438.3一2004《H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》; GB/T19438.4一2004《H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》. 本部分的附录A是资料性附录 本部分由国家质量监督检验检疫总局提出 本部分起草单位;北京出人境检验检疫局,深圳市匹基生物工程股份有限公司 本部分主要起草人:刘环、张鹤晓、赖平安、周琦、刘宁
GB/T19438.2一2004 H5亚型禽流感病毒荧光RI-PCR检测方法 范围 本部分规定了H5亚型禽流感病毒荻光RT-PCR操作方法 本部分适用于活禽及其产品中H5亚型禽流感病毒的检测 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本部分 GB/T19438.1一2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 缩略语 下列缩略语适用于本部分 3.1 荧光Rr-CR 荧光反转录-聚合酶链反应 3.2 Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的闵值时所经历的循环数 3.3 RNA 核糖核酸 3.4 Taq酶 TagDNA聚合酶 3.5 PBS 磷酸盐缓冲生理盐水 3.6 DEPC 焦碳酸乙二酯 原理 采用TaqMan方法,在比对禽流感病毒血凝素基因的基础上,设计一对仅在H5亚型禽流感病毒血 凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针 该探针的结合部位位于目的扩增片段 内部 其中5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团(用R表示),3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光 基团(用Q表示),它在近距离内能吸收5'端荧光基团发出的荧光信号 反应进人退火阶段时,引物和 探针同时与目的基因片段结合,此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到荧 光信号;而反应进行到延伸阶段时,Taq酶发挥5'-3'的外切核酸酶功能,将探针降解 这样探针上的
GB/T19438.2一2004 R基团游离出来,所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收 随着PCR反应的循环往复,PCR 产物呈指数形式增长,荧光信号也相应增长,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步 试剂和材料 5.1试剂 除另有说明,所用试剂均为分析纯;所有试剂均用无RNA酶的容器(用DEPC水处理后高压灭菌 分装 5.1.1三氯甲婉 5.1.2异丙醇;一20C预冷 5.1.375%乙醇;用新开启的无水乙醇和DE:PC水配制,一20C预冷 5.1.40.01mol/L(pH7.2)的PBS;配方见GB/T19438.12004中附录A 121C士2C,15min高 压灭菌冷却后,无菌条件下加人青霉素,链霉素各10000IU/mL 5.1.5H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒'试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附 录A 5.2仪器设备 高速台式冷冻离心机;最大离心力12000r/nin以上 5.2.2荧光PCR检测仪、计算机 2C一4C冰箱和一20C冰箱 5.2.4 微量加样器;.0.反AlloL.Sl~0,L.20l.一200,L..300,l.100L. 组织匀浆器 混匀器 5.2.7可移动紫外灯 样品的采集与前处理 采样过程中样本不得交叉污染,采样及样品前处理过程中须戴一次性手套 取样工具 下列取样工具必须经121C士2C,l5min高压灭菌或经160C士2C干烤2h. 拭子; 剪、慑; -研钵; Eppendorl管(1.5ml). 6.2采样方法 6.2.1活禽样品 取咽喉拭子和泄殖腔拭子,具体采集方法如下 咽喉拭子,采取时要将拭子深人喉头及上腰裂来回刮3次~5次,取咽喉分泌液 -取泄殖腔拭子时,将拭子深人泄殖腔转一圈沾取粪便; -将咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放人盛有1.0mlPBS的Eppendorf管中,编号备用 6.2.2内脏或肌肉样品 用无菌锻剪夹取待检样品2.0g于研钵中充分研磨,再加10mlPBS混匀,或置于组织匀浆器中， 加人10mLPBS匀浆,然后将组织悬液转人无菌Eppendor管中3000r/min离心10min,取上清液转 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可 如果其他等效产品具 1 有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T19438.2一2004 人Eppendorf管中,编号备用 6.2.3血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendor管中,编号备用 6.3存放与运送 采集或处理的样本在2C8C条件下保存应不超过24h;若需长期保存,须放置一70C冰箱,但应 避免反复冻融(最多冻融三次) 采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,尽快运送到实 验室 操作方法 7.1实验室的设置与管理 实验室的设置与管理见GB/T19438.1一2004中附录C 7.2样本的处理 在样本处理区进行 7.2.1取n个1.5ml灭菌Eppendor管,其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和. 对每个管进行编号 每管加人600儿裂解液,然后分别加人待测样本、阴性对照、阳性对照各200L,吸头反复吸 7.2.2 打混匀(一份样本换用一个吸头);再加人200L三氯甲烧,混匀器上震荡混匀5s(不宜过于强烈,以免 产生乳化层,也可用手颠倒混匀) 于4C条件下,12000r/min离心15min 7.2.3取与7.2.1中相同数量的1.5ml灭菌Ependof管,加人400L异丙脖(一20C预冷),对每 个管进行编号 吸取7.2.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中,上清液至少吸取500l注意 不要吸出中间层,烦倒混匀 轻轻倒去上清液 12000r/min离心15min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置). 倒置于吸水纸上,沾干液体,不同样品应在吸水纸不同地方沾干 加人600AL75%乙醇,颠倒洗涨 于4C条件下,12000r/min离心10min(Eppendor管开口保持朝离心机转轴方向放置) 轻 轻倒去上清液,倒置于吸水纸上,沾干液体,不同样品应在吸水纸不同地方沾干 7.2.64000r/min离心l0s(Eppendorl管开口保持朝离心机转轴方向放置),将管壁上的残余液体甩 到管底部,用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面,室温干燥 3 ,不宜过于干燥,以免RNA不溶 min 7.2.7加人llAlLDEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000r/min离心5s,冰上保存备用 提 取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增或放置于一70C冰箱 扩增试剂准备与配置 在反应混合物配制区进行 从试剂盒中取出AIVH5亚型RT-PCR反应液、Taq酶,在室温下融化后,2000r/min离心5s 设所需PCR数为n,其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和,每个样本测试反应体系 配制见表1 表1测试反应体系配制表 试 剂 RT-PCR反应液/L Taq酶/AL 15 用 量 0.25 计算好各试剂的使用量,加人一适当体积试管中,向其中加人0.25×"颗RT-PCR酶颗粒,充分混 合均匀,向每个PCR管中各分装15L,转移至样本处理区 加样 在样本处理区进行 在各设定的PCR管中分别加人7.2.7中制备的RNA溶液各10AL,盖紧管
GB/T19438.2一2004 盖后,500r/'min离心30s 7.5荧光Rr-CR反应 在检测区进行 将7.4中加样后的PCR管放人荧光PCR检测仪内,记录样本摆放顺序 循环条件设置 荧光RT-PCR检测H5亚型禽流感病毒的反应参数为 第一阶段,反转录42C/30min; -第二阶段,预变性92C/3min; 第三阶段,92C/10s,45C/30s,72C/1min,5个循环 第四阶段,92C/10s,60C/30s,40个循环,荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火延伸时 进行 结果判定 8.1结果分析条件设定 读取检测结果 阀值设定原则以阀值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,结果显示阴 性为准 或可根据仪器噪音情况进行调整 8.2质控标准 8.2.1阴性对照无C值并且无扩增曲线 8.2.2阳性对照的C值应小于28.0,并出现典型的扩增曲线 否则,此次实验视为无效 8.3结果描述及判定 8.3.1阴性 无C'值并且无扩增曲线,表示样品中无H5亚型禽流感病毒 8.3.2阳性 C!值小于等于30.0,且出现典型的扩增曲线.表示样本中存在H5亚型禽流感病毒 8.3.3有效原则 Ct值大于30.0的样本须重做 重做结果无c值者为阴性,否则为阳性
GB/T19438.2一2004 附 录 A 资料性附录 H5亚型禽流感病毒荧光R-PCR试剂盒组成,说明及使用时的注意事项 试剂盒的组成 组成成分(48反应/盒) 积 体 样本处理试剂 裂解液 30ml×1盒 核酸扩增试剂 H5亚型禽流感病毒RT-PCR反应液 750LX1管 RT-PCR 1颗/管×12管 Taq酶(5U/l 12Al×1管 DEPc 1mlX1管 水 对照品 阴性对照 1mL×1管 阳性对照(非感染体外转录RNA) lmlX1管 A.2说明 A.2.1裂解液的主要成分为异硫氢酸呱和酚,为RNA提取试剂,外观为红色液体,于4C保存 A.2.2DEPC水,是用1%DEPC处理后的去离子水,用于溶解RNA A.2.3RT-PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子 A.3使用时的注意事项 A.3.1 由于阳性样品中模板浓度相对较高,检测过程中不得交叉污染 A.3.2反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄露污 染仪器 A.3.3RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活,RT-PCR酶在室温条件下必须置于干燥器内保存,使用时取出 所需数量,剩余部分立即放回干燥器中 A.3.4除裂解液外,其他试剂-20C保存 有效期为6个月