猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法

国家标准 GB/T34757一2017 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法 Pwreineepidemiediarhea一RT-CRfordietectng virusacid 2017-11-01发布 2018-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/34757一2017 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法 范围 本标准规定了猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的仪器、试剂、样品的采集和处理,RT-PCR程 序电泳及结果判定的技术要求 本标准适用于快速检测猪临床样品(猪小肠和新鲜粪便)或细胞培养物中猪流行性腹泻病毒核酸 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注明日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本 文件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件 AMV;鸟类RNA病毒反转录酶(avianmyeloblastosisvirus) p:碱基对(basepairn) DEPC;焦碳酸二乙酯diethylpyrocarbonate) NA,脱氧核糖核酸(deoxyribomucleic.acid dNTPs;4种脱氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxyribonucleosidetriphosphates) PBSs;磷酸盐缓冲液(phosphate-buferedsalinebuffer) RNA;核糖核酸(ribonucleicaced RT-PCR;反转录-聚合酶链式反应(reversetranseriptascpolymerasechainreaction) RRI;RNA酶抑制剂(rnaseribonuedeaseinhibitor) Ta酶;TaqDNA聚合酶(TaeDNApolymerase) 仪器 4.1PCR扩增仪 4.2高速台式冷冻离心机;可控温至4C,离心速度可达12000r/min以上 4.3组织研磨器或者研钵 4.4冰箱2C8C冰箱和一70C以下超低温冰箱 4.5核酸电泳仪和水平电泳槽 4.6微量移液器量程分别0.2L一2L、1L10L、,10AL100nL,20aL200L和100nL~ 10L的移液器,并配备与移液器相匹配的服头 4.7高压灭菌锅 4.8凝胶成像系统(或紫外透射仪).
GB/T34757一2017 5 耗材 5.11.5ml无RNA酶离心管 5.20.2mlPCR管 6 试剂 除非另有说明,在检测中使用的试剂均为分析纯 提取病毒RNA所用试剂应使用无RNA酶的容 器进行分装 6.1水,GB/T6682,三级水 6.2病毒裂解液;商品化RNA提取试剂盒，4C8C保存 6.3氯仿;常温保存 6.4异丙醇;使用前预冷至一20C 6.5无水乙醉;一20C预冷 6.675%乙醉;无水乙醇和双蒸水配制,一20C预冷 6.7AMV逆转录酶及5倍逆转录酶反应缓冲液;-20C保存,避免反复冻融 6.8DEPC水:购买商品化DEPC水 6.9 Tug 酶及10倍Taq酶反应缓冲液:一20C保存,避免反复冻融 6.10RRI;一20C保存,避免反复冻融 6.11dNTp含dATP.lcGP.TpdrP备10mmlL.,一20C保存,耀免反复冻胞 6.12DNA分子量标准;DL2000bpDNAladder 6.13磷酸盐缓冲液(PBS);配制见A.1 6.14电泳缓冲液(TAE);配方及配制方法见A.2 6.15样品处理液:配方及配制见A.3 6. .161%琼脂糖凝胶板;配制见A.4 6.17引物;见附录 B 6.18猪流行性腹泻病毒阳性样品及阴性样品;阳性样品的制备参见C.1,阴性样品的制备参见C.2 阳性样品和阴性样品可由标准编制单位或国家指定实验室提供 样品采集和处理 7.1采样工具 7.1.1手术刀,剪刀、慑子,经160C干热灭菌2h 7.1.2注射器 一次性无菌采样拭子 7.1.3 7.1.4组织研磨器或者研钵,经160C干热灭菌2h 7.2样品采集 宜采集腹泻急性期的小肠(5.0cm一10.0cm)或新鲜粪便(5.0g一10.0g),放到密封袋中 7.3样品运输 将含有样品的密封袋置于带有冰袋的样品运输箱中,送至实验室 样品的运送应在低温保存条件
GB/34757一2017 下进行,样品被运到实验室时,所附带的冰袋应没有完全融化 7.4样品保存 7.4.1采样点保存 样品不能被及时送到实验室时,应置于一20C冰箱中保存,保存期应不超过1个月;如需长期保存 样品,应置于一70C冰箱 7.4.2实验室保存 7.2中采集的样品可立即用于检测 不能立即检测的样品,在2C8C下保存应不超过24h -20C士5下应不超过1个月，一70C以下可长期保存 7.5样品处理 7.5.1小肠样品的处理 取5.0cm一10.0cm小肠组织,用剪刀剪醉,加人5.0mL一10.0mL的PEBs.,用组织研磨器或研钵 研磨后转移到小玻璃瓶中,一20C反复冻融3次后摇匀,取1.0ml.小肠组织液到1.5mL离心管中,经 12000r/nmin离心5min,取500L上清备用 7.5.2粪便样品的处理 取05[一1.0区新鲜粪便,加人到含5.0ml~I00mL样品处理液(配方见A.3)的玻璃瓶中 -20C反复冻融3次后摇匀,取1.0mL处理过的粪便样品到1.5mL离心管中,经12000r/min离心 nmin,取500L上清备用 5 RT-PCR操作程序 8.1RNA的提取 选择市售商品化RNA提取试剂盒,按照试剂盒操作说明书提取样品中的RNA 在提取RNA时 应设立阳性和阴性对照样品,按同样的方法提取RNA RNA提取操作应在通风柜或生物安全柜中进 行,避免RNA气溶胶的污染 8.2反转录(RT) 8.2.1反转录引物序列下游引物P2,见附录B 8.2.2RT反应体系反转录的反应体系参见附录D. 8.2.3RT反应程序42C水浴1h,70C灭活15nmin,结束反应 可以直接进行PCR,或者放于 -20C保存备用 试验中设阳性和阴性对照 8.3聚合酶链式反应(CR 8.3.1PCR引物序列见附录B 8.3.2PCR反应体系参见附录D 8.3.3PCR反应程序95C预变性5min后进人PCR循环,94C变性30s,52.5C退火30s,72C延 伸30s,30个循环,最后72C终延伸10min,结束反应 同时设空白对照 1%琼脂糖电泳分析结果
GB/T34757一2017 9 电泳 9.1制备1.0%琼脂糖凝胶板,见附录A 9.2取10.0L.PCR产物与2.0L市售的DNA上样缓冲液(6×)混合,加人到琼脂糖凝胶板的加样 孔中,同时加人DNA分子量标准作对照 g.3盖好电泳仪,插好电极,电压为5V/cm~10V/cm,时间为30 min 9.4用紫外凝胶成像系统对图片拍照、存档 9.5用分子量标准比较判断PCR片段大小 10结果判定 0.1试验成立的条件 阳性对照有315p的扩增条带,阴性对照没有相应条带,否则试验不成立 10.2样品检测结果 在阳性对照、阴性对照都成立的前提下,若检测样品有315p的条带,则判定该样品猪流行性腹泻 病毒核酸阳性,否则为阴性(参见图E.1) 如需要,可对扩增的条带进行回收,克隆到T载体,进行测 序,所得序列与附录E中的猪流行性腹泻病毒M基因的序列进行同源性比较,以进一步确定样品检测 结果
GB/34757一2017 附 录 A 规范性附录 溶液的配制 A.1磷酸盐缓冲液(PBs)0.01mo/L,pH7.4)的配制 准确称量下面各试剂,加人到800mL燕水中溶解,用盐酸调节溶液的pH至7.4,加水至1L 分装后在121C灭菌20min,或过滤除菌,保存于室温 磷酸二氢钾(KH.PO. 0.20g 磷酸氢二钠(Na,HPO12H.O) 2.90g 氯化钠(NaCI 8.00g 氯化钾(KCI 0.20g 蒸水 加至1000.00ml A.21×电泳缓冲液(TAE)的配制 先配制TAE(50×)贮液,使用时再用燕水稀释成1×电泳缓冲液 1LTAE的配制50×);准 确称量242gTris碱,57.1mL的冰乙酸、100mlL.0.5mol/LEDTA(pH8.0),加人蒸僧水至1L,室温 放置备用 样品处理液的配制 准确称量下面各试剂,加去离子水定容至200mL,121C灭菌20min后室温放置备用 1.60 氧化钠 g 0,04 氯化钾 g 0.29 磷酸氢二钠 g 0,05 磷酸二氢钾 g 3.72 乙二胺四乙酸二钠 g A.41%琼脂糖凝胶板的制备 准确称取1g琼脂糖,加人100ml.1×TAE,在微波炉中加热,使琼脂糖充分溶解,取出,加人适量 的染料,混匀,倒人制胶板中
GB/T34757一2017 附录 B 规范性附录) 检测猪流行性腹泻病毒RI-PCR方法的引物序列 检测猪流行性腹泻病毒RT-PCR方法的引物序列见表B.1 表B.1检测猪流行性腹泻病毒RI-CR方法的引物序列 引物名称 引物浓度 引物序列 上游引物P1 20pmol/Al 5'-TATGGCTTGCATCACTCTTA-3’ 下游引物P2 20pmol/Al. 5'-TTGACTGAACGACCAACACG3” 注扩增片段为M基因保守区,大小为315bp
GB/34757一2017 附录 C 资料性附录 猪流行性腹泻病毒阳性样品和阴性样品 阳性样品制备 C.1 取猪流行性腹泻病毒(PEDV),用100ml的PBS稀释至1个病毒半数组织细胞感染量(TcCIDm)， 向其中加人不含PEDV的猪粪便10g,摇匀,分装,0.5mL/管,备用 阴性样品制备 用PBS按10:1的比例稀释不含PEDV的猪粪便，摇匀,分装,0.5mL/管,备用
GB/T34757一2017 附 录 D 资料性附录) 检测方法的RT和CR反应体系 RT反应体系 D.1 RNA 20l dNTPs(10mtmol/I 4.0[ RNA酶抑制剂(RRD 1.0l 5×反应缓冲液 8.0L AMV反转录酵 2.0L 下游引物P2(见附录B 2.0L DEPC水 3.0l 总体积 40.0L D.2CR反应体系 反转录产物 3.0AL TaqDNA聚合酶反应缓冲液(10×) 2.5l dNTPs10mmol/L 2.0L 上游引物P1(见附录B) l.0Al 下游引物P2(见附录B) 1.0L TuDNA聚合朋 0.5l 灭菌去离子水 15.0"l 25.04L 总体积
GB/34757一2017 录 附 E 资料性附录 检测样品电泳例图及核苷酸序列 E.1检测样品中猪流行性腹泻病毒电泳例图 检测样品中猪流行性腹泻病毒电泳例图见图E.1 M 200o 00 70 500 250 100 说明 M -DNA分子量标准DL2000; 小肠组织样品 粪便样品 阳性样品对照 阴性对照 图E.1检测样品中猪流行性腹泻病毒电泳图 E.2猪流行性腹泻病毒M基因第249563位核苷酸序列(参考CV777株》 TATGGCCTGCATCACTCTTATGCTGCGGATAATGTATTTTGTCAATAGCATTCGGTTGTGG CGCAGGACACATTCTTGGTGGTCTTTCAACCCTGAAACTGACGCGCTTCTCACTACTTCTG TGATGGGCCGACAGGT'T'TGCAT'TCCAGTGCTTGGAGCACCAACTGGTGTAACGCTAACACT CCTTAGTGGTACGTTGCTTGTAGAGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGTACAGGTAAGTCA ATTACCTAAT'TTCGTCACAGTCGCCAAGGCCACTACAACAATTGTCTACGGACGTGTTGGT CGTTCAGTCAA(315bp

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法GB/T34757-2017

猪流行性腹泻病毒是一种通过粪口途径传播的病毒，可引起猪只的腹泻、呕吐等症状。为了及早发现和控制此类疾病，需要使用合适的检测方法。

目前，国家标准GB/T34757-2017规定了猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法。该标准明确了实验室设备、试剂盒、反应体系和操作步骤等方面的要求。

具体而言，该标准要求PCR检测应选用特异性强、灵敏度高的试剂盒，包括病毒RNA提取试剂盒、RT试剂盒和PCR试剂盒。同时，还需要设置正负对照和内部对照，以确保检测结果的准确性。

在PCR扩增反应方面，该标准规定了特定的温度和时间要求，并要求必须使用实时荧光定量PCR进行分析。此外，还需要对扩增产物进行鉴定，保证所得结果的可靠性。

最终的结果解释方面，该标准也做出了明确的规定，包括阳性、阴性和可疑结果的判断标准。对于可疑结果，需要进行复检或其他检测方法的验证。

总之，猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法符合GB/T34757-2017标准，具有高灵敏度和特异性，是目前诊断猪流行性腹泻病毒的主要手段之一。

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