玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法

玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法

国家标准 GB/T36840一2018 玉米内州萎焉病菌检疫鉴定方法 Detectionandidentificationof Clavibactermnichiganensissubsp nnebraskensis 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36840一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:北京出人境检验检疫局、检验检疫科学研究院、中华人民共 和国上海出人境检验检疫局 本标准主要起草人;高文娜,郑春生、骆卫峰、赵文军、易建平、张丽杰、边勇
GB/36840一2018 玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了玉米内州萎病菌(C. lazibactermichiganensissubsp nebraskensis)检疫鉴定方法 本标准适用于玉米种子和玉米植株材料中的玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 基本信息 中文名;玉米内州娄鹉稍菌 学名;Claibactermichiganensi、subsp nebraskensi、(Vidaver& Mandel1974)Davisetal.1984 简称:CMN 英文名:Goss'swilt,Goss'swiltofmaize,Goss'sbacterialwiltandleafblight,blightofmaize， leaffrecklesofmaize,wiltofmaize,Nebraskaleaffrecklesandwilt,leaffrecklesandwilt 分类地位;属细菌界Bacteria,放线菌门Aetinobacteria,微球菌目Mierococales,微球菌科Mi- crobacteriaceae,棒形杆菌属Caibacer 玉米内州萎蔫病菌的其他信息参见附录A 原理 玉米内州萎蔫病菌的症状特征、菌落形态特征、生理生化特性、PCR反应和致病性测试结果是检测 鉴定方法的依据 5 主要试剂与设备 5.1主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂 氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠,硫酸镁、,磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、甲醇、乙醇、牛肉浸膏、聚蛋白 陈、酵母提取物、蔗糖、琼脂、葡萄糖 培养基和缓冲液配方见附录B. 5.2仪器设备 显微镜、超净台电子天平、高压灭菌锅,冰箱、移液器、离心机、培养箱、PCR仪、电泳仪、凝胶成像 系统、实时荧光PCR仪、,Biolog鉴定仪等
GB/T36840一2018 6 检测鉴定 6.1现场检疫 按照SN/T2122规定的方法进行现场检疫并抽取样品 6.2实验室检测 6.2.1样品前处理 种子样品 6.2.1.1 取I《种子样品放人三角瓶,加人20ml磷肢缓冲液(Ps缓冲液(opH7.2),4笔浸袍过夜;滤 纸过滤后取浸泡液,10000r/min离心10min,1nmL.PBS悬浮沉淀,12000r/min离心5nmin,弃上清 液.沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA 样品如有种衣剂处理,先用自来水浸泡并洗去种衣剂 可用 纱布包裹搓洗数次 6.2.1.2植物材料 有症叶片取病健交界处2mm×2mm组织,置于载玻片上,加一滴无菌水,加盖玻片,置于显微镜 下观察喷菌现象 如观察到喷菌现象,剪取5块10块症状组织,每块10mm×10mm, 1,剪碎后加人 lml生理盐水,室温浸泡1h,取浸泡液12000r/min离心5min,lmL灭菌水悬浮沉淀;沉淀悬浮液离 心后沉淀提取DNA 6.2.2PCR初检 样品DNA分别取1L用于常规PCR或实时荧光PCR检测(见附录C和附录D),重复3次 6.2.3病原菌分离 6.2.3.1种子样品 若PCR检测为阳性,另取种子样品100g,0.5%次氯酸钠表面消毒10min,灭菌水洗三次,加人 30 200mLPBS缓冲液(pH7.4),4C浸泡过夜;120r/min振荡15min min,灭菌滤纸或纱布(4层 8层)过滤,滤液室温静置15min,取上清液,10000r/min离心15 min,1nml 灭菌水悬浮沉淀 取 00AL悬浮液系列稀释10倍、.100倍和1000倍,悬浮液及稀释液分别取100AL涂布sCNs平板,每个 处理涂布5个10个平板,28C培养5d~7d后检查菌落生长情况 如发现疑似菌落,纯化3次后用 于后续试验 6.2.3.2植物材料 若CR检测为阳性,从症状组织的四个方向切取4个小块组织,每块均从病健交界处取了mm 5mm,70%乙醇表面消毒15s,无菌水洗三次后用无菌剪刀剪碎,置于无菌培养m中,加200AL.生理盐 水,室温浸泡1h,取浸泡液在NA培养基平板上划线分离,划线5个10个平板,27C培养3d一5d 6.2.4鉴定试验 6.2.4.1菌落形态特征 NA和sCNS平板上25C培养6d后,典型菌落淡黄色或杏橙色,圆形,扁平,或稍凸起,边缘光滑 有光泽 挑取可疑菌落在NA培养基平板上纯化三次后进行鉴定
GB/36840一2018 6.2.4.2CR检测 分离物菌落纯化后,菌体提取DNA后进行PCR检测或实时荧光PCR检测,检测程序见附录C和 附录D PCR检测阳性的分离物进行后续测试 6.2.4.3Biolog测试 分离物在NA上培养后转移至BUG培养基(见附录B)上,33培养24h,按照Biolog使用说明， 调整分离物菌悬液浊度加人Biolog(GN微孔板或G川微孔板中,每孔100Ml 微孔板33C培养18h 后用Biolog仪读数,获得测试结果 6.2.4.4烟草过敏性反应 分离物在NA上28C培养48h72h后用无菌水配成108CFU/ml的菌悬液,采用组织渗透法 接种普通姻叶背面,以无菌水作为对照,28C光照培养24h一48h后观察是否产生过敏性反应 6.2.4.5致病性测试 分离物108CFU/mL菌悬液针刺接种玉米幼叶,进行致病性测试 选取健康甜玉来种子种植,在 生出2片幼叶后,针刺小孔,接种菌悬浮液,保湿1d,室温下生长 接种7d~l0d后观察接种点附近出 现症状 根据柯赫氏法则,对发病子叶再分离病原菌,分离的病菌用PCR进行检测,完成了整个测试 程序 结果判定 分离物的菌落形态特征与CMN相符,IBiolog测试为CMN,PCR检测结果为阳性,烟草过敏性反应 为阳性,致病性测试出现典型症状,判定为cMN 样品保存 阳性种子样品至少保存6个月,至少1000粒,以备复核,谈判和仲裁;阳性的植物材料及时销毁处 理;分离菌株应妥善保存,将菌株转接到NA试管斜面上,28C培养48h 然后置于4C冰箱中保存 c 定期(30d)转接;或在菌悬液中加人15%一30%甘油于一80C下保存;必要时可将菌株冻干,-8o 下长期保存
GB/T36840一2018 附 录 A 资料性附录) 玉米内州萎藉病菌相关资料 形态特征 A.1 玉米内州萎病菌属革兰氏染色阳性,大小约为(0.6m一0.7m)×(0.7m1.2m),大部分为 楔形细胞,也存在球状细胞,直或弯的杆状细胞 好氧,不抗酸,不产芽抱,无鞭毛,最适生长温度为 26 C27C,最高生长温度37C38C A.2地理分布 美国(科罗拉多州伊利诺斯州、印第安纳州爱荷华州,堪萨斯州、路易斯安那州、密歇根州、明尼苏 达州密苏里州,内布拉斯加州,北达科他州、南达科他州、得克萨斯州威斯康星州和怀俄明州),加拿大 阿尔伯塔、马尼托巴和安大略. A.3寄主植物 主要寄主是玉米Zea 甘蔗Saccharunmn mays 接种能侵染假蜀黍Eh laencme.ricana， ofiriarwm,高粱srghumbiolor,苏丹草s.sudanene,鸭茅状摩擦禾Ti/uwmdacywoides A.4传播途径 病菌可以侵染玉米植株的任何部位,在玉米叶、茎杆、穗轴和穗等病残体上越冬,存活期长达10个 月 种子的自然侵染率可达20.8% 病菌侵染主要经由伤口侵人 近距离传播主要依靠雨水或灌溉 水,远距离传播主要靠种子,种子内外均可带菌,种子中病菌至少存活1年,该病害是典型的种传植物细 菌病害 A.5为害症状 症状表现为叶片萎蔫和系统枯萎两种类型 该病在叶片上最初为不连续的水溃状斑点,初为暗绿 色至黑色,后变褐色,与叶脉平行(参见图A.1),表面常有细菌溢脓 系统侵染时,维管束变色,根和近 地面的茎秆干腐或水演状褐腐 玉米幼苗和成株均可发病 细菌通过伤口侵染,也可直接通过叶片侵 染或者细嫩植株的根和茎秆系统侵染引起发病 苗期侵染引起萎藉、死亡,后期侵染造成植株矮化,叶 片上出现灰白色或黄绿色条纹,条纹边缘波浪形或不规则形,有时有黑色斑点,最后干枯
GB/36840?2018 ?A.1?????????
GB/T36840?2018 ? B 淶??) ? B.1?A:0.1mol/L??.pH7.4 2.62gNaH.PO..H.O;14.42NaHPO.2H.O;?,1000mL B.2PBs?(??),p7.4 0.01mol/?A(pH7.4)80mlм0.88gNaC,0.01mol/?A 100mL B.3NA ?3g,??5g,??10g,10g,?18g,??1000mLpH 7.07.2,?20min B.4sCNS ?8g,??2g,K.HPO2.0g,KH.PO0.5g,15g,MgSO7H.O0.25g ?15g,?(Bravo720)0.2mL??1:50?,?(Mertect340F)50AL,? 0.02g,??1000ml,??40mg(0.1mol/NaOH),? 100mg(1nmL??) B.5BUG 57gBUG?,??1000mL,?20min
GB/36840一2018 录 附 C 规范性附录 常规PCR方法 常规CR之一 C.1 引物为PSA-75'-CCCTTTccGTcCGTcCTTTcG-3')/PSA-R(5'-TACTG.AGATGTTTCACT TcccC-3'),预期扩增产物分别为393bp c.2常规CR之二 引物为l184-F5'-ATGCAATCACCTGACGATGTcGTG-3')/1184-R5'-TCAGCGACCCA CATTCAGGTT-3'),预期扩增产物分别为390bp C.3PCR反应体系 PCR反应体系25ML,包括2.5L10×PCR缓冲液(Mg+),2.5ALdNTP(各2504mol/L),1L 上下游引物(引物浓度各为10nmol/L),1L模板DNA,1.5UTaq聚合酶(5U/L),加水至25AL 以灭菌去离子水作空白对照,以CMN的DNA作为阳性对照,重复3次 C.4反应程序 PCR反应程序:94C3min;9430s,60C30s,72C30s,循环30次40次;最后72C 10min 扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液电泳,EB染色后用凝胶成像系统分析
GB/T36840一2018 附 录 D 规范性附录) 实时荧光CR方法 D.1引物及探针之一 引物FP(5'-TGTcG.AGGGCATGTTGCACG-3'/RP(5'-GGAGACAGAATTGACCAATGAT- 3'),探针Cmn(FAM-5'-TTCCGTCGTcCCTTTcGTGGATG-3'-TAMRA) D.2引物及探针之二 引物cemn3F(5'-AGTTACTGGTGAATGTG.AGCAcG-3')/emnl1oR5'-GTGATGGcCTGGGC CGCC-3'),探针emn38pb(Cy5-5'-AGcCTGAGTTCCCGCG.ACGTT-3'-BHQ2) D.3扩增条件 反应总体积为20L,包括:实时荧光反应混合液(TaqManMasterMix)10L,10mol/L的上下游引 物各1L,10mol/L的探针1L,DNA1L 以灭菌去离子水作空白对照,以CMN的DNA作为阳性对 照,重复3次 D4结果判定 阳性对照和空白对照均正常扩增,样品扩增曲线呈典型的S形,则 -检测Ct值小于或等于36,判定CMN检测结果呈阳性 -检测Ct值等于40,判定CMN检测结果呈阴性 检测Ct值在3640之间,再次检测;检测结果如果C值小于或等于36则判定CMN检测结 果呈阳性;如果c!值等于40则判定cMN检测结果呈阴性;如果c'值仍在36一40之间,可 将产物进行测序分析
GB/36840?2018 ο 1]BachHJ,Jessenl.SehloterM,MunehJc,2003.ATaqMan-PCRprotocolforquantifiee- ionandfferentiation JournalofMicro nofthephytopathogenieCharihbactermidhiganensissobepecties." biologiealMethods52;85-91. MeNallyRR,IshimaruCA,MaliekDK.,2016.PCR-MediatedDetectionandQuantifica tionoftheGoss'swiltPathogenClavibacter nebraskensisViaaNovelGene midhiganensis subspn6 Tar 106(12):1465-1472. Phytopathology. arget Pastrik H. Rainey 1999.ldentificationanddifferentiationofClavibacter michiganensissubsp.michignensisbypolymerasechainreaction-basedtechniques.JournalofPhytopa 147687-693. thology TambongJTXuRDaayfFBriereSBilodeauGJTropianoRHartkeAReidLM CottMCoteTAgarkovaI.2016.GenomeAnalysisandDevelopmentofaMultiplexTaqManReal TimePCRforSpecificldentificationandDetectionofClavibacter nmichigan subsp nebraskensis nenSs Phytopathoo6y.106(12)l473-1485.

玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法GB/T36840-2018

玉米是世界上最重要的粮食作物之一，在中国也是主要农作物之一。然而，玉米内州萎蔫病菌是一种常见的病原体，会导致玉米减产、死亡等问题。因此，开发一种可靠的检疫鉴定方法非常必要。

在GB/T36840-2018中，提出了一种基于PCR技术的玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法。该方法主要包括样品采集、DNA提取、PCR扩增、电泳分析等步骤。

首先，采集可能存在玉米内州萎蔫病菌的植物样品，并将其保存在适当的条件下。然后，通过DNA提取试剂盒等工具，从样品中提取出目标DNA。接下来，使用特异性引物和PCR试剂盒进行PCR扩增反应，得到PCR产物。最后，将PCR产物进行电泳分析，根据PCR产物的大小判断是否存在玉米内州萎蔫病菌。

GB/T36840-2018提出的玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法具有以下优点：

• 该方法可以快速、准确地判断样品是否存在玉米内州萎蔫病菌，避免了传统的形态学鉴定方法需要长时间培养的缺点。
• 使用PCR技术可以放大目标DNA片段，使得检测灵敏度更高，检测结果更可靠。
• 该方法操作简便，适用于大规模的样品检测。

总之，GB/T36840-2018提出的玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法是一种非常有效的检测方法。使用这种方法可以快速准确地检测出是否存在玉米内州萎蔫病菌，为保障玉米作物健康提供了重要保障。

玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法的相关资料

和玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法类似的标准

GB/T36840-2018

玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法

2022/8/12 3:50:41 现行