国家标准 GB/T34748一2017 水产种质资源基因组DNA的微卫星分析 GeetiediversityanalysisonaquatiegermplasmbygenomieDNA micr0Satellite markers 2017-11-01发布 2018-05-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/34748一2017 水产种质资源基因组DNA的微卫星分析范围本标准规定了水产种质资源基因组DNA的微卫星分析的试剂与材料、仪器与设备、分析步骤及数据分析本标准适用于水产种质资源基因组DNA的微卫星分析规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T18654.15养殖鱼类种质检验第15部分:RAPD分析术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3.1 mierosatellite 微卫星真核生物基因组中由两个或多个核苷酸重复排列形成的短串联重复序列 3.2 miersatelliteanalysis 微卫星分析用微卫星标记引物对基因组DNA进行扩增,扩增产物经凝胶电泳检测后,分析电泳图谱并计算其中蕴涵的遗传多态性信息试剂与材料除GB/T18654.15规定的试剂与材料外,以下试剂和材料是本标准所需的除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和双蒸僧水或去离子水或相当纯度的水 4.1去离子超纯水:须高压灭菌 4.2TEMED于4C冰箱中保存 4.3微卫星标记引物:配制方法符合附录A 4.4丙烯酰胺:DNA测序级 4.5甲叉双丙烯酰胺:DNA测序级 4.6尿素 447” 去离子甲酰胶 4.8聚丙烯酰胺凝胶存储液;配制方法符合附录A 4.910%质量体积比)过硫酸铵(APS)溶液配制方法符合附录A 4.10聚丙烯酰胺凝胶固定液;配制方法符合附录A 4.11聚丙烯酰胺凝胶染色液:配制方法符合附录A
GB/T34748一2017 4.12聚丙烯酰胺凝胶显色液;配制方法符合附录A 4.13电泳载样液;配制方法符合附录A 4.14基因组DNA提取试剂盒;从生物试剂供应商处购买 4.151×TrisEDTA(TE);配制方法符合附录A 5 仪器与设备除GB/T18654.15规定的仪器与设备外,以下仪器与设备是本标准所需的 5.1扫描仪或光密度扫描成像仪 5.2垂直电泳槽1套 5.3DNA测序电泳槽1套 5.4高压恒功率电泳仪1套 5.5自动测序仪或遗传分析仪 5.6水平转动脱色摇床 6 抽样试验生物抽样按照GB/T18654.15的规定执行,样本量宜40个以上分析步骤 7.1基因组DNA提取可用基因组DNA提取试剂盒或已被验证可以抽提到高质量基因组DNA的方法或按GB/T18654.15 的规定提取基因组DNA 若用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA按说明书操作 7.2基因组DNA纯度及浓度测定按GB/T18654.15的规定执行 7.3微卫星标记的选择从受检测物种或近缘种中筛选出扩增稳定、重复性好且具有多态性的微卫星标记用于基因组DNA 的微卫星分析微卫星标记应遵循哈代温博格平衡,微卫星标记所含等位基因数宜在4个以上,微卫星标记数量应遵循标记数量增加而有效等位基因、期望杂合度、多态性信息含量等不发生显著变化时最少大标记的数量，一般为25个30 7.4基因组DNA的CR扩增 7.4.1基因组DNA的准备根据7.2基因组DNA纯度和浓度测定结果,取部分DNA用灭菌的超纯水稀释至50ng/"L,于 4C中保存备用,其余放一20C冰箱中保存 7.4.2微卫星标记引物的准备根据7.3的原则选择微卫星标记,将合成的引物配制成1004mol/L的保存液,于一20C冰箱中保存备用使用时取部分保存液,配制成10mol/L.使用液,也可按所需倍数稀释后使用,保存液仍
GB/34748一2017 放回一20C冰箱中保存 7.4.3PCR体系按照(GB/T18654.15的规定执行 7.4.4PCR程序 min后,第二个程序9430s,退火按下列程序进行扩增;第一个程序94笔预变性3min~101 30s(根据不同引物的退火温度设定),72C30s,20个38个循环,第三个程序72C延伸5 min一 10min 可根据具体反应调节PCR程序,使扩增效果达到最优扩增产物直接电泳或于4C暂时保存(一般不超过6h)至电泳如需长时间保存,可在一20C冰箱中保存 7.5CR产物凝胶电泳检测 7.5.1电泳检测方法使用非变性聚丙烯酰胺凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶进行PCR产物凝胶电泳检测,或用自动测序仪或遗传分析仪进行PCR产物检测 7.5.2非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测非变性聚丙烯酷胺凝胶制备 7.5.2.1 将胶模玻璃板清洗干净,自然晾干后根据电泳槽设备说明书安装胶模根据检测PCR产物大小的范围,选择合适的非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度，一般使用6%12%浓度的凝胶量取适量聚丙烯酰胺凝胶存储液,加人TBE缓冲液,用去离子水定容至所需体积,使TBE 缓冲液终浓度为1× 每毫升加人7L10%APs溶液和1LTEMED,搅拌均匀后,迅速灌胶,插人梳子,在滥胶及插人梳子时注意不要产生气泡于室温放置30min一60min,待凝胶完全凝固后进行预电泳 7.5.2.2电泳样品的准备取PCR产物10AL,加人2Al5L电泳载样液,混匀,放于4C备用,其余的CR产物放于一20C 中保存,以备复查 7.5.2.3电泳将凝固好的非变性聚丙烯酰胺凝胶装人垂直电泳槽中,倒人1×TBE电泳缓冲液,清洗加样孔,220 V 恒压4C~10C下预电泳30min 之后关闭电泳仪电源,取1Al8AL电泳样品上样到凝胶的样品孔中,样品孔的两边和凝胶中间各加一个DNAMARKER作为计算分子量的标准样,在1V/cm一8V/cmm恒压4C10C下电泳在电泳载样液中的指示剂到达合适的位置时,关闭电泳仪 7.5.2.4染色聚丙烯酰胺凝胶一般采用银染,在染色的各步骤操作中,凝胶均应置于水平转动摇床上使之缓慢摇动固定:将凝胶从玻璃板的胶模中取出,用蒸憎水冲洗2次3次,放人盛有固定液的盘中浸泡 0min30min
GB/T34748一2017 30 染色;倒掉固定液,用去离子水冲洗凝胶3次,每次5min,倒人染色液,浸泡10min mina 显色:染色结束后,将染色液倒人回收瓶中(可重复使用1次2次) 凝胶用去离子水冲洗3次 min5min 5次,倒人预冷的显色液,浸泡2 当出现明显的条带后倒掉显色液,用去离子水冲洗2次 3次,即可进行成像拍照 7.5.2.5成像利用扫描仪或光密度扫描仪扫描凝胶成像,或用数码相机进行拍照,记录图像和处理信息成像后可将凝胶制成干胶保存,以备建档和复查 7.5.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 7.5.3.1变性聚丙烯酰腔凝胶制备将胶模玻璃板清洗干净,自然晾干后根据电泳槽设备说明书安装胶模根据检测PCR产物大小的范围,选择合适的变性聚丙烯酰胺凝胶浓度，一般使用4%~12%浓度的凝胶量取适量聚丙烯酰胺凝胶存储液,加人TBE缓冲液,和质量体积比为42%的尿素，也可根据需要加人体积比为25%或40%的去离子甲酰胺,用去离子水定容至所需体积,使TBE缓冲液终浓度为每毫升加人7AL10%APS溶液和1ALTEMED,搅拌均匀后,退速灌股,插人梳子,在灌胶及插 1× 人梳子时注意不要产生气泡于室温放置2h以上待凝胶完全凝固后进行预电泳 7.5.3.2电泳样品的准备取PCR产物2Al5L,按PCR产物和去离子甲酰胺载样液比例为1:1l;5的体积比加人适量的去离子甲酰胺电泳载样液,混匀,在95C下变性10min,迅速放人冰水中冷却101 min 后立即加样其余的PCR产物放于一20C中保存,以备复查 7.5.3.3电泳将凝固好的变性聚丙烯酰胺凝胶装人垂直电泳槽中,倒人1×TBE电泳缓冲液,清洗加样孔,30w~ 80w恒功率下预电泳30min,使凝胶温度上升至45C~50 之后关闭电泳仪电源,再次清洗加样孔,取3AL8AL样品上样到凝胶的样品孔中,样品孔的两边和凝胶中间各加一个DNAMARKER作为计算分子量的标准样在30w80w恒功率下电泳,保持凝胶温度在45C50 7.5.3.4染色变性聚丙烯酷胺凝胶采用银染法进行染色,按7.5.2.4的规定执行 7.5.3.5成像按7.5.2.5的规定执行 7.5.4自动测序仪或遗传分析仪基因分型分析利用自动测序仪或遗传分析仪进行PCR产物基因型检测,具体操作按自动测序仪或遗传分析仪操作手册或说明书执行 8 图象处理及数据分析采用图谱分析软件分析电泳图谱,根据分子量标准计算出每条扩增条带的大小,确定每个引物扩增
GB/34748一2017 的等位基因数和样本的基因型,进行遗传参数的计算(符合附录B) 建档对实验设计、方法、步骤、电泳图谱、分析结果等建立详细的档案(参见附录C)
GB/T34748一2017 附录 A 规范性附录基因组NA微卫星分析试验溶液的配制 A.1微卫星标记引物微卫星标记引物合成后,每OD加人适量体积的灭菌1×TE溶解,配制成1004mol/L的母液,放于一20C中保存备用或采用自动测序仪或遗传分析仪进行PCR产物基因型分析,则合成引物时需按照自动测序仪或遗传分析仪的要求在5'末端进行荧光或其他标记物的修饰,若进行荧光修饰,则需避光保存 A.2聚丙烯酰胺凝胶存储液丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺按照一定的交联度配制成质量浓度比为30%或45%或其他浓度的储存液,需用孔径为0.45Am的硝酸纤维素膜过滤或直接购买预先混合好的丙烯酰胺:甲叉双丙烯前胶游液或粉末.若为粉末,则按浓度比用去离子水直接浒解即可 46%的聚丙婚酷贼凝胶存储液配制为丙缩酷散484,甲又双丙烯酸股16g,加人离子水00nml 后加热至37C溶解,冷却至室温后用去离子水定容至1L,用孔径为0.45m的硝酸纤维素膜过滤,室温存储于棕色瓶中 A.310%质量体积比)过硫酸铵(AS)溶液称取0.1lg过硫酸铵放人1.5mL离心管中,加人1mL去离子超纯水,震动,充分溶解,于4C保存备用，一般现配现用 A.4聚丙烯酷胺凝胶固定液体积比为10%乙醇和0.5%冰醋酸的混合液配制500mL固定液,量取50mL乙醇,2.5mL.冰乙酸,然后用去离子超纯水定容至500ml 也可根据各自实验室的经验配制 A.5聚丙烯酰胺凝胶染色液 0.1%质量体积比)硝酸银:称取0.5g硝酸银,400ml去离子超纯水充分溶解后,定容至500ml,于棕色瓶于常温下密闭放置,可以重复使用2次3次也可根据各自实验室的经验配制 A.6聚丙烯酷胺凝胶显色液配制500ml显色液;称取10gNaOH,0.2gNaHcO.,加人400ml去离子超纯水,充分溶解后加人5mL甲醛溶液,定容至500ml 显色液一般现配现用,配制好后放人-20C冰箱中预冷30n min，若有未使用的显色液,放人4C冰箱中保存,以供下次使用也可根据各自实验室的经验配制
GB/34748?2017 A.7?? ???????????TaqDNA???? ?,???????? ?:0.25%,40%(?),?,,?4C á ???? 98% ??( 49ml(100%??? 10mmmol/I EDTA(pH8.0) 1mlL(0.5mol/LEDTApH8.0) 0.25% 0.125g ? ??? 0.25% 0.125g A.81TrisEDTATE) lmmol/IEDTA,10mmol/1TrisCl?,pH?7.5
GB/T34748一2017 录附 B 规范性附录) 微卫星分析相关遗传参数计算公式微卫星电泳图谱经过软件分析后,得到各等位基因大小,及每个个体扩增的等位基因,以此获得个体的基因型数据采用基因型数据分析软件或手工计算出每个位点各等位基因的基因频率、等位基因数量有效等位基因数量、预测杂合度,期望杂合度、多态性信息含量及位点的哈代温博格平衡检验以下公式假设群体共有N个个体的样品,每个座位检测出了m个等位基因基因频率(P). B.1 P=(2N;十N;/2N B,1 式中: P 第i个等位基因的基因频率; N;含有第i个等位基因的纯合个体数; N,一音有第个等位联因的杂合个体数 -总个体数 B.2观测等位基因数(A.) (B.2 n A 式中 A 观测等位基因数; 检测出的等位基因数 mm 有效等位基因数(A.) B.3 B,3 S" A =1 式中有效等位基因数 A 等位基因数量; mn P -第i个等位基因的频率,按式(B.1)计算观测杂合度(h.): B.4 h =HN/N B.4 式中 h 观测杂合度; HN 某一位点上含有杂合基因型的个体数; N 个体数 B.5期望杂合度(h ): h =1-习P (B.5 式中期望杂合度; n 等位基因数量; mn 第i个等位基因的频率,按式(B.1)计算 P B.6多态性信息含量(PIC). PIC=1一 "-斗二p" (B.6
GB/34748一2017 式中 PIC 多态性信息含量; 等位基因数量; mn P -第i个等位基因的频率,按式(B.1)计算 B.7哈代温博格平衡: (B.7 HwE=习O一E'/E 式中: HIWE -哈代温博格平衡卡方检验值,HWE符合自由度为基因型数量减去等位基因数量的卡方检验; O -基因型在群体中的观测值; E -基因型在群体中的期望值
GB/T34748一2017 录附 C 资料性附录) 水产生物基因组DNA的微卫星分析记录表 C.1分析样品的基本信息见表C.1 表c.1分析样品的基本信息中文名拉丁文学名采样地点采样时间采样基数取样数量取样部位采样人员保存方法注1，采样地点,若为野生种群,填写经纬度范围及地名;若为养殖群体,填写采样的实验站,养殖场名注2:采样基数,若为野生种群,填写样品采集区的范围,如为江河,填写样品采集的长度(km),为湖泊,则填写样品采集区的面积;若为养殖群体,填写样品采集的群体数量大小(尾) C.2样品基因组DNA纯度及含量见表C.2 表c.2基因组DNA纯度及浓度个体项目基因组DNA大小 A260/A280比值基因组DNA浓度注:表中的空栏为检验时增加的个体记录 C.3微卫星引物序列信息见表C.3 10
GB/34748一2017 表c.3微卫星引物及扩增信息上游引下游引扩增片微卫星序列核心序列退火温度 Mg十浓度位点名称物序列物序列段大小登记号注:表中的空栏为检验时增加的位点记录 C,4扩增图谱分析结果0/1矩阵见表C,4 表c.4微卫星分析结果基因型位点名称注1表中列为每个样本的基因型行为位点名称注2:表中的空栏为检验时增加的个体记录(列)和位点信息(行) 注3:基因型以等位基因大小表示,如190/220,表示样本有190bp和220bp两个等位基因 C.5微卫星分析结果见表C.5 表C.5微卫星分析结果等位基因观测等位点有效等观测杂期望杂多态性信哈代温博格平衡概率名称大小范围位基因位基因合度合度息含量平均值注1表中的空栏为检验时微卫星分析记录注2:计算公式符合附录B.

水产种质资源基因组DNA的微卫星分析GB/T34748-2017

水产种质资源是指各种生活在水中的动植物种群，包括淡水、海洋、内陆河流等各种水域生态系统所包含的各种生物。随着水产养殖业的迅速发展，水产种质资源也逐渐受到了越来越多的关注。而水产种质资源的基因组DNA的微卫星分析技术能够为水产资源的筛选、鉴定、保护提供强有力的支持。

水产种质资源的基因组DNA的微卫星分析技术原理

基因组DNA的微卫星是一种具有高度可变性的分子标记，在水产资源的鉴定和遗传多样性研究中广泛应用。微卫星分析技术通过PCR扩增微卫星位点，然后使用凝胶电泳等方法检测微卫星多态性，从而对水产种质资源进行分类、鉴定和遗传多样性分析等。

GB/T34748-2017水产种质资源基因组DNA的微卫星分析标准

GB/T34748-2017是我国水产行业制定的水产种质资源基因组DNA的微卫星分析标准，该标准规范了微卫星分析技术的实验操作流程、数据处理和分析方法等。采用该标准进行微卫星分析可以保证结果的准确性和可靠性。

微卫星分析技术在水产种质资源保护中的应用

水产种质资源保护是水产业可持续发展的重要组成部分。微卫星分析技术可以帮助识别和区分不同的水产种质资源，评估它们的遗传多样性和亲缘关系。同时，微卫星分析还可以用于筛选和鉴定具有良好遗传背景的优良品系，为水产养殖业提供高效的种质改良手段。

结论

水产种质资源基因组DNA的微卫星分析技术是一种重要的分子生物学工具，对于水产种质资源的保护、利用和管理具有重要意义。GB/T34748-2017作为行业标准，规范了微卫星分析技术的实验操作流程和数据处理方法，使得该技术具有更高的可靠性和准确性。