番茄环斑病毒检疫鉴定方法纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法

国家标准 GB/T28973一2012 番茄环斑病毒检疫鉴定方法纳米颗粒 增敏胶体金免疫层析法 Deteetioamdidentifieationoftomatorimgspotvirus一Namopartielesenlargedimm colloidalgoldimmunochromatographicassay 2012-12-31发布 2013-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T28973一2012 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位;检验检疫科学研究院、湖南出人境检验检疫局 本标准主要起草人:邹明强、李锦丰、张永江将陈艳、戴华、马吉湘、田世民
GB/T28973一2012 引 言 本文件的发布机构提请注意,申明符合本文件时,可能涉及到6.4.3,B.4与增敏试剂相关的专利 的使用 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场 该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判 该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案 相关信息可以通过以下 联系方式获得 该专利持有人;检验检疫科学研究院 联系人邹明强 地址:北京市朝阳区高碑店北路甲3号检脸检疫科学研究院邮编l1238 请注意除上述专利外,本文件的某些内容能够仍可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这送 些专利的责任
GB/T28973一2012 番茄环斑病毒检疫鉴定方法纳米颗粒 增敏胶体金免疫层析法 范围 本标准规定了用纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法检测番茄环斑病毒的原理,实验步骤及结果判 定等 本标准适用于植物及其产品组织中番茄环斑病毒的快速筛查 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB19489实验室生物安全通用要求 引进植物病原生物安全控制技术要求 GB/T236292009 GB/T23632一2009进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程 番茄环斑病毒基本信息 中文名:番茄环斑病毒 学名;tomatoringspotvirus 缩写;ToRsV 分类地位;豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Neoirus) 番茄环斑病毒的其他信息参见附录A 方法原理 基于胶体金免疫层析双抗体夹心检测法原理,采用氯金酸与还原剂反应生成的纳米金颗粒对常规 胶体金免疫层析试纸条进行处理,提高检测灵敏度,根据试纸条颜色的变化,判定待测样品中是否存在 番茄环斑病毒 仪器设备、用具及试剂材料 5.1仪器设备 天平感量,1/10000g),离心机、组织捣碎机,低温冰箱等 5.2用具 微量移液器(2.5AL10L,20L,100AL,200AL、1000AL),研钵,离心管等
GB/T28973一2012 3 5. 试剂材料 纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法测定番茄环斑病毒试剂材料(见附录B). 实验步骤 生物安全与废弃物处理 实验过程中的生物安全要求应严格按照GB19489的规定进行操作，实验废弃物按照 GB/T23629一2009中5.7进行处理 样品制备 称取1g植物或其产品组织,加人2mL样品提取缓冲液用研钵研磨,然后4C下30o0兵 5000 g 取上请液制备成一个样品 离心10min， 样本存放 制备的样品在2笔8条件下保存应不超过24h,若需长期保存,应置一70C以下,避免反复 冻融 病毒检测 4 6. 检测步骤 取同一批次胶体金免疫层析增敏快速检测试纸条(即开即用),置于平整的台面上,向样品垫中分别 加人被检样品、阳性对照和阴性对照各100Al,每个试验同时做平行 室温放置15min,观察检测线和 质控线条带 6.4.2质量控制 质控线条带出现颜色,阳性对照检测线条带出现颜色,阴性对照检测线条带不出现颜色,检测结果 有效 如果质控线条带不出现颜色,或阳性对照检测线条带不出现颜色,或阴性对照检测线条带出现颜 色,出现任何一种现象以上者,说明检测结果无效,另选一批次试纸条重新按6.4.1操作 6.4.3增敏实验 向检测线没有产生颜色条带的试纸条样品垫上加人100AL的PBST缓冲溶液进行清洗,反复清洗 3次,每次1nmin,然后在硝酸纤维素膜靠近结合垫端加人30L增敏试剂,室温反应5min8min后 观察检测线条带颜色 .4.4结果判定 6. 检测线条带出现颜色,判定为阳性;检测线条带不出现颜色,判定为阴性 注:增敏前条带颜色为红色,增敏后因为氧化还原反应使条带颜色变为黑灰色 结果的确认 可疑阳性样品应采用番茄环斑病毒RT-PCR检测方法进行确认
GB/T28973一2012 样品的保存与复核 种子类样品保存6个月,如果发现带毒样品保存1年 植株中发现病毒的,采集病叶干燥后保存于 -20丫条件 检测原始记录、照片等文档按有关规定做好登记、标记和存档,以便必要时复核 复核程 序按照GB/T23632一2009中第6章进行操作
GB/T28973一2012 附 录A 资料性附录 番茄环斑病毒相关资料 A.1寄主范围 ToRsV的自然寄主有天竺葵属(Pelargoniumspp.,悬钩子属(Rubusspp.,李属(Prumsspp. 和烟草(Nicotianatabacum)等 在人工接种的情况下还可以侵染茄科,黎科、葫芦科,蔷薇科和豆科的 100多种植物 A.2病害症状 ToRSV主要侵染多年生植物,在桃和其他李属植物上表现黄芽花叶症状;桃、樱桃和一些李属植 物上表现茎部蚀损斑和退化症状;李树被ToRsV侵染后产生褐色线条;ToRsV侵染苹果树后嫁接部 位上方膨大,接穗和砧木连接处的树皮异常增厚并呈海绵状,剖开树皮后可发现明显的坏死线,苹果树 也可出现衰退症状;ToRsV在红树莓redraspberry)上表现环斑和衰退症状;葡萄等多种植物被 ToRSV侵染后均可出现衰退症状 A.3分布地区 ToRSV主要分布于美洲,欧洲,大洋洲,亚洲的一些国家;美国加拿大、秘鲁、智利、保加利亚、德 国,意大利法国,前苏联地区,前南斯拉夫,塞浦路斯、澳大利亚和韩国、日本等 A.4传播方式 A.4.1近距离传播 ToRsv在田间主要通过土壤中的剑线虫传插,剑线虫属中可能的传插介体有XipMiema 1aa1er canum,X.californicum,X.incognitum,X.occiium,X rivesi,X thornei,X utahense 机械接种、种 子,花粉也能传播该病毒 A.4.2远距离传播 ToRsV通过带毒种子、苗木、组培苗等繁殖材料的运输发生远距离传播
GB/I28973一2012 B 附 录 规范性附录 纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法测定番茄环斑病毒试剂材料 B.1胶体金免疫层析增敏快速检测试纸条 样品垫为玻璃纤维素片;结合垫是喷好了金标番茄环斑病毒单克隆抗体的玻璃纤维素片,免疫金释 n释放效率大于80%;硝酸纤维素膜的检测线上包被了番茄环斑病毒多克隆抗体;质 放时间小于5min 控线上包被了1mg /nmL的羊抗鼠lgG;吸水垫为吸水纸 其结构见图B.1 样品流动方向 检测线 样晶垫 吸水垫 硝殿纤 维素质 质控线 结合垫 PvC背衬 其中,玻璃纤维素片;吸水速率大于4、/em,吸水量大于50mg/cm; 硝酸纤维素膜(NC膜):毛细流动速率大于25s/cm 吸水纸;吸水速率大于3s/cem,吸水量大于100mg/em" 聚氯乙烯(PVC)板;初粘力大于或等于3号球,持粘力标准条件下大于80h， 图B.1胶体金免疫层析增敏快速检测试纸条 B.2样品提取缓冲液 PBST 1 亚硫酸钠(NasO 1 .3g PVP(Mw2400040000) 20 g 叠氮钠(NaN, 0.2g 4C储存 B.3PBs缓冲液(洗涤缓冲液plH7.4) 氯化钠(NaCD) 8g
GB/T28973一2012 磷酸氢二钠(NagHPO 1.15g 磷酸二氢钾(KHPO 0.2g 0.2g 氯化钾(KCD 0.5mL 吐温-20 蒸僧水定容至1L B.4增敏试剂 将1%的氯金酸和10mmol/L的盐酸胫胺按1;5的体积比混合,混合后5min内使用 B.5阴性对照 取1《的一下保存的键康叶片组织,用研林微氮研磨粉碎,加人又mL样品提取缓冲液.1仑离 心10min(3000g一5000g)，取上清液制备成阴性对照 B.6阳性对照 取1g的一20下保存的灭活的病叶组织,用研钵液氮研磨粉碎,加人2mL样品提取缓冲液 g一5000g)，取上清液制备成阳性对照 4C离心10nmin(30004

番茄环斑病毒检疫鉴定方法纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法GB/T28973-2012

什么是番茄环斑病毒？

番茄环斑病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）是一种具有多宿主特性的RNA病毒，可以感染包括番茄、辣椒、玉米和花卉在内的多种植物。该病毒的传播途径包括虫媒传播和种子传播，严重影响了农作物的产量和品质。

传统的番茄环斑病毒检测方法存在的问题

目前常用的番茄环斑病毒检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链反应（PCR）等。然而这些方法都存在着一些问题。例如，ELISA法需要制备大量的抗体，成本较高；PCR法需要特异性引物，对于变异的病毒株无法进行准确检测。

纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法介绍

为了解决传统的番茄环斑病毒检测方法存在的问题，科学家们提出了一种新的方法：纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法。该方法利用纳米颗粒的高表面积、高灵敏度和胶体金颗粒的良好生物相容性、可视化等优势，实现对番茄环斑病毒的快速、灵敏、特异性检测。

纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法的优势

与传统方法相比，纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法具有以下优势：

• 快速：整个检测过程只需要30分钟左右。
• 灵敏：可以检测到极低浓度的番茄环斑病毒，检测限为0.01 ng/mL。
• 特异性高：对于不同病毒株有很高的特异性。
• 操作简单：无需复杂的实验条件和仪器，适合在野外进行快速检测。

如何进行纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法的检测？

纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法的检测步骤如下：

1. 制备纳米颗粒-抗原复合物。
2. 在测试纸条上涂覆胶体金标记的抗体。
3. 将制备好的纳米颗粒-抗原复合物加入样品中，与待测样品中的番茄环斑病毒结合。
4. 将处理后的样品添加到测试纸条中，等待几分钟进行反应。
5. 观察测试纸条上是否出现红色线条，如果出现，则说明该样品中存在番茄环斑病毒。

总之，纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法是一种快速、灵敏、特异性高、操作简单的番茄环斑病毒检测方法。在番茄等作物的生产和检疫中具有重要的应用前景。

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2022/10/24 0:39:11 现行