大型？急性毒性实验方法

大型？急性毒性实验方法

国家标准 GB/T16125一2012 代替GB/T16125一1995 大型蚤急性毒性实验方法 NMehodtraetetoteitytestfdaphniamugastreas IsO6341-1996Waterquality一Determinationoftheinhibittion ofthemobilityofDaphniamagnaStraus(Cladocera,Crustacea) Acutetoxietytest,NEQ) 2012-11-20发布 2013-05-01实施 卫生部 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T16125一2012 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准代替GB/T16125一1995《大型水蚤测试标准方法》,与GB/T16125一1995相比主要技术变 化如下 -将原标准名称《大型水蚤测试标准方法》修改为《大型蚤急性毒性实验方法》 将原标准的主题内容与适用范围修改为范围,并删除大型搔生长及繁殖实验方法(慢性效应) 依据GB/T1.1一2009调整了结构,增补了“规范性引用文件”“术语和定义” -本标准4.2增加了标准稀释水的定义和配制方法; 本标准6.1增加了样品采集与保存方法 本标准7.1增加了限度实验的内容和方法; 本标准增加了质量控制和质量保证的内容和方法; “大型涵的培养繁殖方法”和附录“斜生栅藻的培养技术” 将原标准附录A调整为附录A" 本标准使用重新起草参考Iso6341l:1996《水质大型涵(甲壳纲,枝角目)活动抑制的测定》编制， 与ISO6341:1996的一致性程度为非等效 本标准由卫生部提出并归口 本标准起草单位;疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所 本标准主要起草人;刘凡、潘力军、高世荣、王俊起
GB/T16125一2012 大型澄急性毒性实验方法 范围 本标准规定了大型蚤急性毒性实验方法 本标准适用于评价可溶性化学物质的毒性、工业废水及固体废弃物浸出液的综合毒性、废水的处理 效果、地表水,地下水及水中沉积物的毒性 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB12997水质采样方案设计技术规定 GB12998水质采样技术指导 GB12999水质采样样品的保存和管理技术规定 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 半数有效浓度medianefreetieconcentration EC 在24h或48h内50%暴露在实验液中大型蚤活动受抑制包括死亡)的浓度 3.2 immobilization 活动抑制 轻轻摇动实验容器,若15s之内大型蚤不能游动,认为其运动能力受到抑制,即使其触角仍能活 动,也应算做活动受抑制的个体 实验原理 本标准用大型蚤为实验生物,将大型蚤置于一系列浓度的实验溶液中,计数24h和48h大型蚤活 动能力受到抑制包括死亡)的数量,计算24h和48h半数有效浓度(24hEC和48hEC.),判断实验 溶液的毒性程度 实验分为两个阶段;预实验和正式实验 试剂和材料 5.1 -般要求 本标准所用试剂均为符合国家标准的分析纯化学试剂,实验用水要求参照GB/T6682
GB/T16125一2012 实验生物 大型涵(DuphniamagaSstraus)(甲壳纲,枝角亚目)62Dm纯品系生物株为实验蚤种 实验用通 取同龄同母体后代,培养1代3代、出生6h一24h的幼蚤 实验用大型蚤培养繁殖方法参见附录A 5.3标准稀释水 5.3.1配制的标准稀释水pH为7.8士0.2;硬度为250mg/儿士25mg/L(以CaCO计),Ca/Mg比例 接近41;溶解氧浓度在空气饱和值的80%以上;不应含有任何对大型蚤有毒的物质 5.3.2标准稀释水用电导率小于104S/em的纯净水按下述方法配制 氯化钙溶液;将11.76只氯化钙(CaCl2H,O)溶于水中稀释至1L 硫酸镁溶液;将4.93g硫酸镁(MgSO 7H,O)溶于水中稀释至1L 碳酸氢钠溶液:将2.59g碳酸氢钠(NaHCO.)溶于水中稀释至1L; 氨化钾溶液;将0.25区氧化伊(KC)溶于水中稀释至1 L; 各取以上四种溶液25mL混合,稀释至1L 调节pH,使其稳定在7.8士0.2 标准稀释水应容许 大型蚤在其中生存至少48h 5.4稀释水 可采用未被有毒物质污染的天然水(地面水或地下水)及自来水(自然曝气的),其pH为7.08.5,溶 解氧4mg/1以上,水的硬度为250mg/L士22mg/L(以CaCO表示) 仪器和设备 可采用小烧杯等玻璃制品,或者依据化合物的性质选择合适的实验容器,实验容器上加盖表面皿 为防止玻璃容器对实验物质的吸附,实验前可用低浓度实验溶液浸泡容器(空白对照组除外)1d 2 6 量筒、容量瓶、移液管,滴管,玻璃缸、尼龙筛网 溶解氧测定仪、水质硬度计、pH计、温度计,电导仪、体视显微镜 样品 7.1样品的采集与保存 7.1.1按照GB12997,GB12998,GB12999的规定 采集废水样品时,应将采样瓶充满水样,不留空 气 采集水质不稳定的工业废水,应在24h之内,每隔6h采样一次,分别测定每个样品,求得其最大 毒性 7.1.2样品采集后应立即进行实验 如果样品采集后6h之内不能进行实验,宜将水样冷藏保存 (0C4C);超过6h,宜将水样冷冻保存(一18C),保存时间不超过2个月 7.2样品的制备 7.2.1受试物可以是可溶于水的固体、液体或气体,但要求组分一定,具有代表性、重复性 7.2.2易溶于水的实验物质可直接加到稀释水中,也可以溶解在蒸僧水中配成贮备液加人到稀释水中 配成实验液 贮备液应低温保存 难溶于水的物质,可使用超声波装置及其他低毒助溶剂增溶的方法， 将其祥解和分散 如果使用助祥剂,.助溶剂在实验液中的浓度不应超过0.5mE g/L 7.2.3工业废水原水样为实验原液,作为100%,用稀释水按百分数(百分率)配制成各实验浓度 7.2.4固体废弃物或水中沉积物 首先磨碎,按固液1:10比例加人燕僧水,摇匀后浸泡24h,滤纸过 滤,滤过液为被测工业固体废物或水中沉积物的浸出原液(100%),再用稀释水按百分数配制成各浓度
GB/T16125一2012 实验程序 限度实验 以受试物在实验液中的最大溶解度作为限度实验浓度(若该物质的最大溶解度大于100mg/L,则 以100mg/L作为实验浓度),实验结束时,如果大型蚤的活动抑制率低于10%,则不需进行下一步实 验,否则应按照实验程序进行完整实验 预实验 正式实验之前,为确定实验浓度范围,应进行预实验,除非有可参考的毒性数据 先将大型搔暴 8.2.1 露于范围较广的浓度系列如0.lmg/I、lmg/L、10mg/1或1mg/L,0.1mg/L,0.01mg/L)中24h 每个浓度至少放5个幼蚤,通过预实验找出被测物使大型蚤全部存活(或无活动抑制)的浓度以及全部 死亡或不动)的浓度,然后在此范围内设计出正式实验中各组的浓度 8.2.2应了解毒物的稳定性在稀释水中是否会出现沉淀,pH等理化性质的改变,以便确定正式实验 是否需要采取流水或更换实验液及改变稀释水pH等措施 8.3正式实验 8.3.1实验浓度设计 根据预实验的结果确定正式实验的浓度范围,按几何级数的浓度系列等比级 数间距)设计5个7个浓度 实验浓度要设计合理(等比级系数不超过2.2,如1,2、4,8,16等比级系 数为2),最高浓度处理组大型蚤全部死亡(或不动),最低浓度处理组大型蚤全部存活(或无活动抑制. 系列浓度中以能出现一个大型溢活动抑制率在40%一60%的浓度最为理想 8.3.2每个实验浓度置大型潘5个,平均每个大型蚤的实验液不少于2mL 每个实验浓度设3个平 行 以不添加受试样品的实验组为空白对照组,内装与处理组相等体积的稀释水 如使用助溶剂,则应 设置溶剂空白对照组 实验前要用化学方法测定实验液的初始浓度 实验开始及结束时测定实验液的 pH,水温和溶解氧(DO) 对不稳定性实验液采用定时更换的措施,实验期间大型蚤不喂食 8.3.3实验开始后应于24h及48h定时进行观察,记录每个容器中仍能活动的大型蚤数,测定0%~ 100%大型蚤活动抑制或死亡的浓度范围,并记录它们任何不正常的行为 质量控制和质量保证 9.1检查大型蚤的敏感性及实验操作步骤的一致性,定期测定重铬酸钾的24hECa,20C时重铬酸 钾的24hEC应在0.5mg/L2.0mg/L之间 9.2对照组(包括空白对照组和溶剂对照组)大型蚤的受抑制率不能超过10% 9.3应经检测证明受试物浓度保持于实验全过程(至少应为计划配制浓度的80%) 如果浓度偏差 >20%,应以测试浓度结果为准 9.4实验开始和结束时,对照和处理组的实验用液pH变化范围不超过1.5;实验前的培养温度应与 实验温度一致,实验可在18C一22C下进行,但同次实验温度的变化不超过士1C 实验应在没有对 大型蚤有害的气体、粉尘的大气条件下进行 实验结束时,所有对照组和实验组溶解氧浓度应大于或等 于2mg/L 实验在自然光照(避免阳光直射)或光照周期(光暗比)为16:8,光照强度<1000lx 9. 5 实验期间,应保持实验室条件正常,若出现停电、停水等情况而影响实验的,应及时停止实验,待实 验室条件恢复正常后重新进行实验
GB/T16125一2012 10 数据与报告 10.1数据 10.1.1结果的计算 计算24h和48h对照组和各处理组实验蚤活动受抑制数及百分率 以24h和48h抑制百分率 与受试物浓度做剂量-效应曲线,选择合适的统计方法(如概率单位法或寇氏修正法)计算24hBCc和 48hEc及其5%的置信区间 10.1.2 结果的表示 以24hBc,或48hc;表爪受试物质在相应时间内对大辈搔运动能力抑制的帮度 当浓度间果 过近仍不能获得足够数据时,可采用使100%大型涵活动受抑制包括死亡)的最低浓度和大型蚤活动 不受抑制包括死亡)的最高浓度来表示毒性影响的结果 检测化学物质样品时.以mg/几表示,计算结果保留3位有效数字 检测废水样品,固体废弃物或水中沉积物浸出液时,以百分数或mL/儿表示,计算结果保留3位有 效数字 10.2 实验报告 实验报告要求包括以下几个方面 实验用蚤的种名、来源、数目、蚤龄、饵料、重铬酸钾的24hEC; 对照组是否发生死亡; 实验条件下大型涵的任何不正常行为、中毒症状; 受试物的名称、化学性质,来源、样品的保存方法,保存时间及前处理方法 实验环境条件,实验用稀释水的性质,如水温、pH、溶解氧、电导率等情况; 实验结果、数据处理、结论; 方法依据及参考文献
GB/T16125一2012 附 录A 资料性附录 大型蚤的培养繁殖方法 A.1实验蚤的选育 实验用大型涵(DahniamagnaStraus)可以从其他实验室已有的纯培养系中挑取引种,也可以从 野外采集 野外采集的蚤要经分离、纯化,在显微镜下鉴定确认为大型蚤后,选择体大,健康的母体数 个,用50mL.小烧杯单个培养 选择繁殖量最大的一代为母蚤,单克隆化,使之成为纯品系 A.2饵料 雌性的大型蚤可以在20C生存4个月之久 本方法推荐用实验室培养的斜生栅藻(Scenedesmus bhigwa)为大型蚤的饵料 斜生栅藻的培养方法见附录B A.3容器 单个培养母蚤可用50mL小烧杯,繁殖培养用2000mL大烧杯,储备培养用30cm×30cm圆玻 璃缸,或类似大小的水族箱 A.4培养方法 在1L~2L的圆玻璃缸或烧杯中,加人500ml1000ml培育水,加人10个~20个大型蚤,，投 喂新鲜栅藻藻液,使藻浓度为6X10'个/mL一8X10个/mL最佳,在室内自然光照条件下进行培养,避 免阳光直射,培养温度15C一25C,pH值为7.5士0.5.溶解氧2mg/L以上,每周全换培养液1次一 2次 A.5实验蚤的分离 选择怀卵量高的母涵10个20个,投喂充足的饵料,在实验前24h用孔径为1mm的筛子将幼蚤 滤去,在实验前6h12h进行第二次过筛,得到出生6h一24h的幼蚤
GB/T16125一2012 B 附 录 资料性附录 斜生栅藻的培养技术 B.1培养基 斜生栅藻的培养可以采用各种适用的培养基,本标准推荐用水生4号培养基 培养基成分(配1000mL)如下 硫酸铵(NH).sO0.200g 过磷酸钙[Ca(H,PO)H,O]饱和液1.000mL 硫酸镇(MgsoHo)0.080， 碳酸氢钠(NaHcO0.100g 氯化钾(KCIl0.025g B.2斜生栅藻的培养 用1000ml锥形瓶,装300ml400ml培养基,或者用3000mL锥形瓶装1000mlL培养液,接 种藻种使成淡绿色 瓶口加盖松软棉团或透气的瓶塞以防污染 在温度15C25,光照强度 3000lx4000lx,光照时间6h10h的条件下连续静止培养,避免阳光直射 可采用40w日光灯 进行人工光照,灯源离培养容器的距离约0.5m 培养好的深绿色的藻液可作为藻种进行扩大培养,也 可经离心浓缩,或自然沉淀浓缩制成浓缩液,低温保藏备用 要经常对藻液进行镜检,检查是否受到其 他杂藻类、纤毛虫和轮虫等动物的污染 藻液要经常转接,以防止老化 转接的时间视藻液生长的情况 而定，一般每周1次一2次,藻液变深绿色即要转接 老化的藻液在显微镜下可明显见到聚集成团的藻 群,色素变黄,摇动振荡后,仍出现大量沉淀 B.3斜生栅藻的扩大培养 为获得培养大型涵的足够饵料,可在实验室内进行斜生栅藻的扩大培养 扩大培养采用30.cm× cm的圆玻璃缸,或类似大小的水族箱 在玻璃缸中加人培养好的斜生栅藻液(B.2),用经自然曝气 30 的自来水稀释成淡绿色 扩大培养中不加任何营养盐 扩大培养的栅藻液可直接喂大型蚤

大型急性毒性实验方法GB/T16125-2012

大型急性毒性实验是一种广泛应用于毒理学研究领域的试验方法，旨在评估化学物质对生物系统的急性毒性。这种类型的实验通常使用小鼠、大鼠、兔子等哺乳动物作为实验对象。

根据GB/T16125-2012标准，大型急性毒性实验通常包括以下几个步骤：

1. 实验前准备

在进行大型急性毒性实验之前，需要进行以下实验前准备工作：

• 获取实验用动物，并进行适当的预处理和饲养，以确保它们处于健康状态；
• 准备实验用化学物质，并确定所需的剂量；
• 根据实验要求准备相应的实验设备和试剂。

2. 实验操作

大型急性毒性实验的具体操作流程如下：

1. 将实验动物随机分为不同的实验组，每组动物数量应该足够多，以保证实验结果的可靠性；
2. 将不同剂量的待测化学物质溶解在适当的载体中，并将其注射或灌胃给动物；
3. 观察并记录实验动物在接受化学物质后的行为、体征等变化情况；
4. 定期监测实验动物的生命体征并记录，如呼吸、心跳等；
5. 在实验结束时，采集实验动物的血液、组织等样本进行检测和分析。

3. 实验结果分析

在完成实验操作后，需要对实验结果进行统计和分析。通常使用LD50值（半数致死剂量）来评估化学物质对生物系统的急性毒性。LD50值是指在一定时间内，使实验动物死亡的化学物质剂量与体重之比。

4. 实验安全注意事项

大型急性毒性实验涉及到对实验动物和实验人员的安全问题，因此需要遵循以下安全注意事项：

• 实验人员必须具备相关的专业知识和技能，严格按照操作规程进行实验；
• 使用化学物质时应采取相应的防护措施，如佩戴口罩、手套等；
• 实验设备应经过消毒和清洁，以保证实验结果的准确性；
• 实验动物应得到适当的保护和关爱，不得残害或滥用；
• 实验结束后，必须将所有的化学物质、废弃物和实验设备进行妥善处理。

总之，大型急性毒性实验是一种非常重要的毒理学试验方法，在化学物质安全评估和毒理学研究中具有广泛的应用前景。通过严格按照GB/T16125-2012标准进行操作，可以获得准确可靠的实验数据，为化学物质的安全使用提供科学依据。

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