绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测技术

国家标准 GB/T34736一2017 绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测技术 withdotbottnghyhridization Detectionofjaagsiektesheepretrovirus 2017-11-01发布 2018-05-01实施 中华人民共利国国家质量监督检验检疙总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/34736一2017 前 言 本标准按照GBT1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口 本标准主要起草单位;内蒙古农业大学,内蒙古出人境检验检疫局、北京农业职业 学院 本标准起草人:刘淑英、齐景伟、王海艳、王振玲、马学恩、梁化春,赵泽、孙晓林
GB/T34736一2017 引 言 adenomatosis， s,OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte shreep ret 绵羊肺腺瘤病(ovinepmoary JSRV)引起的一种慢性,进行性、接触传染性的肺脏肿瘤性疾病 主要特征是患羊咳嗽、呼吸 rovirus， 困难,大量浆液性鼻液.消瘦】型肺泡上皮绸胞和无纤毛绸支气管上皮细胞肿瘤性增生口 剖检可见 病羊肺脏发生实变,回缩不良,体积变大,比正常肺脏大23倍 肺表面有坚实的圆形粟粒大小的灰白 色结节即腺瘤灶,小结节发生融合,形成形状不一并且不规则的大结节 气道内充满泡沫状液体,抬起 两条后腿可从鼻孔流出泡沫状液体即具有证病意义的小推车试验" 绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)是引起绵羊肺腺瘤病的病原 在所有已研究过的正常绵羊基因组内都含 有约20拷贝的与JSRV密切相关的内源性逆转录病毒(endor OgenousretroVIrus ,ERVs)序列,因其基因 结构与绵羊肺腺瘤病毒的极为相似,也称为内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV),为了区别称绵羊肺腺瘤 病毒为exsRv习 研究表明enusRV和exIsRV的基因结构在 gag基因、长末端重复序列(LTR) 基因处区别较大,特别是 env基因编码跨膜蛋白区域TM)和长末端重复序列的U3区是2个高可 en 变区 所以在检测病原exJSRV时,在这2个高可变区处设计特异性引物和制备特异性探针来排除 v[时 enJSRV 到目前为止,全世界都没有建立统一特异性诊断该病的方法n 其原因有三个方面一是该病的潜 伏期较长,病程较长,对处于潜伏期或临床症状不明显的病羊很难发现 二是病羊体内检测不到循环抗 体,很难用常规的免疫学方法进行诊断,三是引起该病的病原绵羊肺腺瘤病毒(JsRV)仍未建立体外培 养体系,所以常规的病毒分离鉴定方法也无法利用 目前对该病的诊断还主要依靠临床症状和病理组 织学检查 所以建立特异性诊断该病的技术标准将在国家出人境检验检疫、国内种羊安全评价,羊场检 疫清群等方面具有非常重要的意义 I
GB/34736一2017 绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测技术 范围 本标准规定绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测的试剂、材料和设备、抽样、操作方法、结果判定等 本标准适用于检测临床疑似病羊和进出口种羊肺组织或外周血液样品中绵羊肺腺瘤病毒核酸,也 适用于羊临床样品中绵羊肺腺瘤病病原的快速检测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1.1 斑点杂交dotblottinghybridizationm 利用核酸探针,在杂交膜上与待测样本核酸DNA杂交,核酸探针带有供反应后检测的合适标记 物,并与特异靶分子结合形成杂交体,再用呈色反应显示 斑点杂交是直接将待检羊只的组织或血液样 品DNA变性后，点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上,再与制备的特异性探针进行杂交来检测样品中的前 病毒DNA的分子杂交技术 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件 1stosisVirus AMV:鸟类RNA病毒反转录酶(AvianMyeloblas BCIP;5-澳-4-氯-3-呵嗓-磷酸盐(5-Bromo-4-Chloro-3-lndolyPhosphate cDNA:互补DNA(ComplenmentaryDNA) DNA;脱氧核糖核酸(DeoxyribonueleicAdid dNTPs;4种脱氧核糖核三磷酸混合物(DeoxyribonucleosideTriphosphates) EDTA:乙二胺四乙酸(Ehylene inetetraaceticAcid ediamin Retrovirus enJSRV:内源性绵羊肺腺瘤病毒(EndogenousJaagsiekte shep ERV;内源性逆转录病毒(Endogenou、Retrovirus) JsRV:绵羊肺腺瘤病毒(JaagsiekteSheepRetrovirus) NBT:四陛氮蓝(Nitro-Blue-Tetrazolium OPA绵羊肺腺瘤病(OvinePumonaryAdenomatosis) PCR:聚合酶链式反应(PolymmeraseChainReaction)
GB/T34736一2017 RNA;核糖核酸(RibonucleieAeid RT;反转录(ReverseTranscriptase) SDs:十二烧基磺酸钠(SodiumDodecylSulfonate' ssC;柠檬酸钠盐(SalinesodiumCitratey Tris;三胫甲基氨基甲烧(Tris(hydroxymethy)aminomethane) 材料与试剂 4 除非另有说明,在检测中使用的试剂均为分析纯 提取病毒RNA所用试剂应使用无RNA酶的容 器进行分装 4.1水 GB/T6682,三级水 4.2商品化的DNA提取试剂盒 用于组织和血液样品DNA的提取,4C8保存 4.3商品化的RNA提取试剂盒 用于组织和细胞总RNA的提取,48保存 斑点杂交所需溶液 4.4 4.4.11mol/儿马来酸;配制见A.1 4.4.2洗涤缓冲液(马来酸缓冲液);配制见A.2 4.4.3检测缓冲液:配制见A.3 4.4.41mol/LTris盐酸溶液:配制见A.4 4.4.510%SDS溶液:配制见A.5 4.4.620倍稀释SSC缓冲溶液;配制见A.6 4.4.7封闭溶液;配制见A.7 4.4.8抗体溶液;配制见A.8 4.4.9预杂交溶液;配制见A.9 4.4.10杂交溶液:配制见A.10. 4.4.11NBT/BCIP显色液;配制见A.11 4.4.120.2mol/儿EDTA:配制见A.12 4.5地高辛探针标记和检测试剂盒 用于特异性探针的标记和灵敏度检测,保存于一20C 4.6制备探针所需模板RNA 制备探针所需模板RNA见B.1 4.7制备探针所需特异性引物和探针序列 制备探针所需特异性引物和探针序列参见附录C和附录D.
GB/34736一2017 4.8AIV逆转录酶及5倍逆转录酶反应缓冲液 AMV逆转录酶及5倍逆转录酶反应缓冲液，保存于一20,避免反复冻融 4.9Iaq酶及10倍Taq酶反应缓冲液 Ta9酶及10倍Taq酶反应缓冲液，保存于一20C,避免反复冻融 材料与设备 5.1高压灭菌器 5.2微量加样器;量程分别0.2L2AL、1AL10AL,10L100AL20AL200AL和100L~ 1000AL的移液器,并配备与移液器相匹配的吸头 5.3高速冷冻离心机.可控温至4C,离心速度可达12000r/min以上 5.4恒温水浴锅 5.5硝酸纤维素膜或尼龙膜 5.62C一20C冰箱 5.7PCR扩增仪 5.8核酸电泳仪和水平电泳槽 5.9凝胶成像系统 5.10高温鼓风干臊箱(可调温度至120C). 5.11恒温摇床 6 样品采集 6.1组织样品 用无菌剪刀和慑子剪取肺脏组织,如果肺叶上有明显的灰白色结节的典型病变时,采集病变与正常 交界处的组织 将待检样品装人冻存管,编号,迅速放人液氮罐中备用 6.2血液样品 颈静脉采血,用淋巴细胞分离液收集白细胞 编号,迅速放人液氮罐中备用 6.3样品存放 样本采集后迅速放人液氮罐中,若需长期保存应放在一80C冰箱,应避免反复冻融 操作方法 7.1样品DNA的制备 取约黄豆粒大小的组织样品或血液白细胞分离液(1mL,细胞密度2×10个/ml10×10个/mL). 采用常规DNA提取试剂盒,按说明书的方法进行操作,提取得到的DNA样品用1%琼脂糖凝胶电泳 检测,保证样品DNA的完整和估测DNA浓度达500ng/L.并于4C保存备用 7.2特异性探针的制备与检测 探针标记的具体步骤和灵敏度检测方法的详细说明见附录B
GB/T34736一2017 7.3斑点杂交检测 7.3.1杂交膜的处理 剪取适合大小的尼龙膜(斜剪口,由小到大),放在15mL双蒸水中漂洗10min,让尼龙膜完全减 润,取出后再浸泡在20mL20倍SsC溶液中10min,然后放在3层灭菌滤纸上,于室温干燥3min. 7.3.2变性 将待测DNA10AL(100ng/AL)样品煮沸l4min,快速放人冰水浴中,骤冷10min 7.3.3点样 将7.1中制备的DNA样品取1L点在杂交膜上于120C烘箱中烘30min 7.3.4预杂交 将杂交膜封人杂交袋中 加人预杂交溶液,每组500AL全部加完,使膜漂起即可,除去气泡,置 37C 一42C的恒温摇床上,轻轻振摇1h 7.3.5 杂交 剪开杂交袋一个小角,倾去预杂交液,加人含3"L的en探针或U，探针20pmol/L)的杂交液 500AL,除去气泡,封口 40C过夜,大约12h16h 7.3.6洗膜 将杂交膜放人小烧杯(或抗体孵育盒)中,加20mL洗涤溶液,在摇床中(40C、70r/min)洗膜 2次，每次30min 7.3.7封闭 取出杂交膜,在20ml预热(40C)10min的马来酸冲洗缓冲液的平皿中浸泡3min平衡后,转人 20mL10%封闭溶液中,室温作用60min 7.3.8酶联抗体结合 将杂交膜取出,放人一个新的平皿中,加人20mL含抗地高辛抗体的封闭溶液中,室温作用 30min 7.3.9洗膜 将杂交膜取出,放人含有20mL 马来酸冲洗缓冲液的平m中,在摇床中(40C、70r/min)洗膜 2次，每次15min;将膜取出,放人含有20ml检测缓冲液的平皿中平衡5min 7.3.10显色 将杂交膜放人20ml新制备的显色液中静置避光(铝纸包裹)显色6h12h 用无RNA酶水终 止反应5min 杂交膜自然干燥后观察照相,避光保存
GB/34736一2017 结果判定 8.1结果分析条件设定 采用已构建好的绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因的阳性质粒为阳性对照,设无探针杂交序列的内源性绵 羊肺腺瘤病毒囊膜基因质粒为阴性对照 阳性对照出现斑点和阴性对照同时不出现斑点为检测结果判定成立的前提条件,否则结果不成立 8.2阴性 膜上样品的点样处同时不出现斑点视为阴性 8.3阳性 点样膜上两个en探针和U、探针(参见附录C)同时出现清晰的斑点为阳性结果 其中一个探针 点样处出现斑点为疑似病例,需再次判定
GB/T34736一2017 附 录 A 规范性附录) 杂交所需溶液配制 A.11mo/1马来酸 16.08g马来酸溶于800mL无RNA酶水中,定容至1000mL,高压灭菌备用 A.2洗涤缓冲液(马来酸缓冲液》 lmol/L 马来酸50mL,5mol/儿L氯化钠溶液15mL.,添加无RNA酶水至400mL,用氢氧化钠调 pH至7.5,再加1.5mL吐温-20,最后再加无RNA酶水定容到500ml,高压灭菌,室温保存 A.3检测缓冲液 lmol/ITris盐酸(pH9.5)10mlL,5mol/几氯化钠2ml,加80ml无RNA酶水,0.1mol盐酸调 pH至9.5,定容至100ml,高压灭菌 A.41mol/LIris-盐酸溶液 121.l4gTris碱,溶于800ml无RNA酶水中,调pH至9.5,定容至1000ml,高压灭菌,4C 储存 A.510%SDs溶液 10g十二婉基磺酸钠(SDS),溶于80mL的无RNA酶水中,加热约68C溶解,调pH至7.2,定容 至100mL,4C存放,4C储存 A.620倍ssC溶液 87.65g氯化钠,44.1廷柠檬酸钠溶于400mL 的无NA酶水中,调pH至7.0,定容至500mL 4C储存 封闭溶液 马来酸缓冲液将10倍封闭液(试剂盒中提供)稀释成1倍封闭液(现用现配) A.8抗体溶液 使用前将抗地高辛碱性磷酸酶溶液按10000r/min离心3min,从表面吸取一定量并用封闭溶液 1 ;5000稀释
GB/34736一2017 A.9预杂交溶液 25mL 25%去离子甲酰股 20mL 20×SsC液 20mL 10%封闭液 20mL 10%SDs液 10mL 0.5mol/L 磷酸氢二钠(Na,HPO 5mL 0.lmol/IN-乙酰十二烧基肌氨酸钠 试剂盒中提供的地高辛标记的杂交小颗粒(DIGEasyHybGranyles)直接溶解即可使用 A.10杂交溶液 取3L的en探针或U3探针(20pmol/pL)放人CR管中,沸水浴10min,快速放人冰水中骤冷 mL预杂交液中,混合均匀备用 10min,加人1" A.11NBT/BCIP显色液 吸取试剂盒中40L四哗氮蓝/5-漠-4-氯-3-刚噪-磷酸盐(NBT/CIP)混合溶液加到2mL的显色 缓冲液中,此液现用现配 A.12 0.2mol/LEDTA溶液 EDTA1.1690g,溶于20ml无RNA酶水中,用氢氧化钠调pH至8.0,高压灭菌,4C避光保存
GB/T34736一2017 录 附 B 规范性附录) 特异性探针的制备与检测步骤 B.1制备探针所需模板RNA 取约黄豆粒大小的自然感染绵羊肺腺瘤病的肺组织样品,采用市售商品化RNA提取试剂盒,按说 明书的方法进行操作,RNA提取操作应在通风柜或生物安全柜中进行,避免RNA气溶胶的污染,估测 总RNA浓度达500ng/L.,并于4C保存备用 B.2反转录(Rr)反应体系 采用10体系,在PCR管中依次加人模板RNA(500ng/L)1AL,dNTPs(25pmol/L)0.5L 随机引物(50pmol/L)0.5L,5倍反应缓冲液2AL,AMV反转录酶0.5ML,其余用无RNA酶水补至 10 L 反转录条件为:37C15min,85C5、 B.3CR反应体系 反应总体系为50"L,在PCR管中依次加人Ta酶(5U/L)0.5"L,10倍反应缓冲液5AL dNTPs(215mmol/L)4L,反转录的cDNA模板(步骤B.2得到)2L(500ng/L),20pmol/L的上、 下游引物 enw-P1,env-P2;U-P1，U,-P2(引物序列参见附录C)各1L,其余用无RNA酶水补至 50 pHL B.4PCR循环条件 94C预变性2min,94C变性30s ,eU 基因52丫退火30s,U 区52C退火30s，72C延伸 分别进行35个循环,最后于72C延伸10 反应后,PCR产物取5AL,在1%琼脂糖凝胶电 lmin min 泳检测 B.5eDNA探针的制备步骤 B.5.1按程序B.3扩增的绵羊肺腺瘤病毒en基因和U区产物经纯化后,分别取1"g放人1.5mL离 心管中作为模板,并加灭菌双蒸水到16AL B.5.2将1.5m离心管放在沸水浴变性10min,迅速将其转移到冰浴中冷却 B.5.3在变性DNA中加人4AL的地高辛标记混合物,混匀并且瞬时离心 B.5.437笔孵育20h,预计地高辛标记产物量约为1050ng B.5.5加人EDTA2AL(0.2mol/L,pH8.0),且65C水浴10 ,以终止标记反应，一20C保存 min 备用
GB/34736一2017 B.6eDNA探针的检测 B61将地高辛标记产物和对照样晶DNA用稀释液(试剂盒中提供)稻释成10pw/AL.aw/L.l Pg/AL 0.3 3pg/AL,0.lpg/L. B.6.2取不同浓度的地高辛标记产物和对照DNA各lL平行点至尼龙膜上,120C烘焙301 使 min， 核酸与膜结合 B.6.3将膜放人塑料平皿,加20ml 马来酸缓冲液,10C25C下摇床反应2min,用10ml封闭液 孵育30min,再用10ml抗体溶液孵育30 1,再用10ml洗涤缓冲液洗涤2次,每次15min,然后用 m1n 10mL检测缓冲液平衡5min B.6.4将膜转到另一平皿中,加人2ml现配NBT/BCIP显色液于黑暗中显色16h,用50ml灭菌双 蒸水5min终止反应,根据尼龙膜上出现的斑点与对照样品DNA对比,确定探针的灵敏度 B.7探针浓度规定 n探针浓度是0.27眼/L..大于或等于0.27吧/L的探针均可使用 U探针浓度是0.18n吧/l.大 于或等于0.18ng/pL的探针均可使用
GB/T34736一2017 附 录 资料性附录) 制备探针所需引物序列 制备探针进行PCR反应所需引物序列见表C.1和表C.2 表c.1制备en探针所需引物序列 引物名称 引物浓度 引物序列 5 上游引物enw-P1 20pmol/AL '-GAGTAGCCAAAGGAGAAC-3” 下游引物envP2 20pmol/Al 5'-ATGCCACGAACAAGG-3” 注扩增片段为enw基因,大小为730bp. 表c.2制备U探针所需引物序列 引物名称 引物浓度 引物序列 上游引物U-P -TTTccTTGccTTGTTcG-3" 20pmol/Al 5'-CATTATTcAcTAcAccCAcc-3’ 下游引物U-P巴2 20pmol/AL 注扩增片段为病毒LTR的U 区,大小为354bp 0
GB/34736?2017 ? D ?? ?? D.1env? gagtagccaaaggagaacaggttataatagtaaaacagcctgcctttgtaatgctgcccgttgaaatagctgaagcctggtatgatgaaactg ctttagaattattacaacgcattaatacggctctcagccgccctaagagaggcctgagcctgattattttgggtatagtatctttaatcaccctcat agctacagctgttacggcttccgtatctttagcacagtctattcaagctgcgcacacggtagactccttatcatataatgttactaaagtgatggg tttcgcatgaaaatccaatgtcatgctaactataaatggatttgtgttacaaaaaagccatacaatacttctgattttccatgggacaaagtgaaga aacat tttacaactgcataatgagattcettgatattgaaaattcgccgaaggctac actaaatatagccgatactgttgataatttcttgcaaaatttattctctaattttcctagtctccattcgctgtggaaaaccctgattggtgtaggaat acttgtgtttattataattgtcgtaatccttatatttccttgccttgTtcgtggcat D.2U,? tctaaagatgagagttgaaatgctgcatatgaaatatagaaatatgttacagcaccaacatc tttccttgccttgttcgtggcatggttcgcgatt ttatggagcttttaaaaaataaagagaggggagatgcgggggacgacccgtgaagggttaagtcctgggagctctttggcagaagccaaag ctaggacaagtacctaagctccctgtcccgccaccctcaagaa .aaaagctcttaaggctcggatgtttgcttttggcactgcttcatagaaa taccaggaaatctgattatataagaatccggtgaItgtgtaagaatccggtgggtgtagtgaataatg
GB/T34736?2017 HofaereA ,Viru4ses2010 [1 biooe FanHJagstdkte sheepretrovirus andoncogenesis. 2(12):2618-2648 [2]MinguijonElGonzolezLDelasHerasM,etal.Pathological andaet etiologicealstudiesi" sheepexhibiting extrathoracicmetastasisofovin adenocarcinoma Jaagsidkte)[].Journmal iepulm monary patholo 2013,148(2-3):139-147 otcomparative logy LiuSLMillerAD.Oncogenictransforma Tsiektesheepretrovirusenvelope nationbythejaags protein[].Oncogene200626(6):789-801 [4]HullSLimJHamilAetalAnalysisofjaagsiekteshe reepretrovirus(JSRV)envelope proteindommainsintransformationJ].Vir 201245(3):508-517 usgenes [51 PalmariniMHallwirthCYorkDetalMoleeularcloningandfunectionalanalysisof ofthehighly three endogenousretrovirusesofsheeprevealadifferentcelltropismfromthat typeD relatedexogenousjaagsiektesheepretrovirus].Journalofviroloy 200074(17):8065-8076 ogy

绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测技术GB/T34736-2017

什么是绵羊肺腺瘤病毒？

绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）是一种引起绵羊肺腺瘤的病毒。它属于反转录病毒科，是一种RNA病毒。绵羊肺腺瘤是JSRV感染绵羊后引起的一种慢性、进展性肿瘤疾病。

绵羊肺腺瘤病毒的危害

绵羊肺腺瘤病毒的感染会导致绵羊患上肺腺瘤，严重影响绵羊的健康和生产能力。此外，JSRV也是一种潜在的人畜共患病毒，对于保障公共卫生安全具有重要意义。

核酸斑点杂交检测技术

核酸斑点杂交检测技术是一种快速、灵敏的病毒检测方法，目前被广泛应用于JSRV的检测中。其原理是利用互补配对的寡核苷酸探针与待检样本中的病毒RNA进行特异性结合，形成杂交物。

该检测技术的优点是具有高度的特异性和灵敏度，能够检测样本中极少量的病毒核酸，同时具有快速、简便等特点。因此，在绵羊肺腺瘤病毒的检测中得到了广泛应用。

GB/T34736-2017标准

GB/T34736-2017是我国制定的关于绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测技术的标准。该标准规定了检测方法、实验室条件、设备和试剂、样品采集和处理等方面的要求。

该标准的制定对于推动绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测技术的标准化、规范化具有重要意义。同时，该标准也为相关企业、机构提供了可参照的依据，提高了检测结果的可比性和可信度。

结论

绵羊肺腺瘤病毒是对绵羊健康和养殖业发展带来不利影响的病原体，其检测技术的研究和应用具有重要意义。核酸斑点杂交检测技术是一种快速、灵敏的检测方法，被广泛应用于JSRV的检测中。GB/T34736-2017标准的制定为该技术的标准化和规范化提供了依据，同时也为相关机构提供了可参照的依据，提高了检测结果的可比性和可信度。

总之，绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测技术是一种重要的检测手段，其在绵羊健康管理和公共卫生安全中具有重要意义。随着科技的不断发展和标准的更新完善，相信该技术在未来的应用中会得到更好的发展。

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GB/T34736-2017

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2022/9/1 2:36:08 现行