牛奶和奶粉中氟胺烟酸残留量的测定液相色谱-紫外检测法

牛奶和奶粉中氟胺烟酸残留量的测定液相色谱-紫外检测法

国家标准 GB/T22980一2008 牛奶和奶粉中氟胺烟酸残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 Determinatonfnumixinrestdueinbinemilkandmmillpwder LC-UVmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22980一2008 前 言 本标准的附录A,附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局、辽宁出人境检验检 疫局 本标准主要起草人;宋文斌、李军、李一尘、赵景红、于一茫、李百厕、于杰,李叶,庞国芳
GB/T22980一2008 牛奶和奶粉中氟胺烟酸残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 范围 本标准规定了原料乳和纯奶粉中氟胺烟酸(lunixin)残留量的液相色谱-紫外检测方法 本标准适用于原料乳和纯奶粉中氟胺烟酸残留量的测定 本标准的方法检出限;原料乳为5.0ug/L,纯奶粉为404g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准 然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研 究是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注明日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第1部分;总则与定义(GB/T6379.1 2004,ISo5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,Is05725-2:1994,IDT GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T66822008,IsG3696;1987,MOD) 原理 样品在酸性条件下酶解用乙晴提取后，经正已烧和固相萃取柱净化,通过配置紫外检测器的高效液 相色谱进行分析测定,外标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所有试剂均为分析纯 水为GB/T6682规定的一级水 甲酸 冰乙酸 4.3 -葡萄糖苷酸酶(gelueuronidaee)150U/mL:小葡萄糖苷酸鹳(o000U/E),准确称取 8 0.00og月-葡萄糖背般附用2ml.的确散盐(PIs9)缓冲游液游解用O. m尼龙滤膜过滤 使用 前现配制 4.4葡萄糖 4.5浓盐酸 4.6流动相A:乙酸铵0.05mol/LpH5.0准确称取3.90g乙酸铵,加水溶解并用甲酸调整至 pH5.0,转移至1000ml容量瓶中,使用前过0.45Am滤膜) 4.7流动相B.甲醉,色谱纯 4.8流动相C:乙睛,色谱纯 4.9混合流动相将40mL流动相B,30mL流动相C以及30mL流动相A相混合 4.10磷酸盐(PBS)缓冲溶液;称取0.8g氯化钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,0.115g磷酸氢 二钠和0.02g葡萄糖于250ml烧杯中加约90ml的水溶解,用0.lmol/磷酸调整pH6.0,转移至 100mL容量瓶中并稀释至刻度
GB/T22980一2008 4.1185%磷酸 4.12乙酸钾溶液;0.04mol/儿L 称取1.95g乙酸钾于500mL容量瓶中,加约450mL水溶解并稀释 至刻度 4.13氯化钾 4.14磷酸二氢钾 415磷酸二氢钾缓冲溶液0.25mo/L.pH7.0 称取17.l只腾股二氢娜祥于400ml水中,定容到 00mL,然后用0.25molL磷酸氢二钠调节pH至7.0(约500mL),定容到1L 4.16氯化钠 4.17无水磷酸氢二钠 418确酸氢二钠浴液0.25malL 称取17,.75只磷酸复二纳帝于400ml水中,定容到500mL. 419正己烧.色谱纯 4.20乙酸-正己烧溶液;乙酸十正己烧(I十9y 421标准物质;氟胶烟酸葡甲胶盐,纯度>99% 4.22叙胶姐酸标准储备溶液504g/mL 称取适量的叙胺酸葡甲胺盐(4.21),用甲醉溶解并定容 C一4C下保存 注，称取标准物的重量是按纯度和含盐量修正过的质量 4.23氟胺烟酸标准工作溶液;24g/ml 吸取适量的氟胺烟酸标准储备溶液(4.22),用甲醉配制成 2 4g/mL的标准工作溶液,2C4C下保存 4.24标准基质溶液;根据氟胺烟酸的灵敏度和仪器线性范围用空白样品提取液配制成不同浓度的标 准基质溶液 仪器 51液相色谱仪;配有紫外检测器 5.2电子天平:感量为0.01g和0.0001g 5.3离心机;最大转速为10000r/min. 5.4离心管:50ml聚丙烯离心管 5 ..5 高速涡流混合器 5 6 振荡器 5.7微量移液器10l一100L和1000l一5000L 5.8氮气浓缩仪 酸度计:精度为士0.02 5 g 10样品过滤器;PTFE,0.45" 5 Am 5.1固相摹取柱;BwnmdElurcertifl.3mL.,200mg,或相当者 5. .12真空固相萃取真空装置 13超声波仪 试样的制备与保存 6.1试样的制备 将原料乳和纯奶粉样品分别混合均匀 各自分出0.5kg作为试样,将分出的试样密封,并作上 标记 6 试样保存 将试样置于4C条件下贮存
GB/T22980一2008 分析步骤 7.1提取 7.1.1原料乳样品 称取原料乳试样2.00ml,精确到0.01ml放人50ml聚丙烯离心管中,加人乙酸钾溶液(4.12 5 ml,高速涡旋混合10s 混合后向样品中加人30AlL乙酸(4.2),调节样品pH至4.5,涡旋混合 再 加人70L新配制的葡萄糖苷酸酶溶液(4.3)混合,于振荡器37C条件下低速振荡16h 分别向样 品中加人5mL乙睛,涡旋混合5s,离心10min(5000r/min) 转移上清液至50ml离心管中 在原 液中加人5nmL乙晴和1mL乙酸钾溶液(4.12)涡旋混合5s,离心10tmin(5000r/min),将上清液转移 至50mL离心管中,合并上清液,待净化 7.1.2纯奶粉样品 称取纯奶粉几.25g;精确到0.g;,放人50l聚丙稀离心管中加人175《水超声容解得到复顾 乳 加人乙酸钾溶液(4.12)5ml以下步骤同原料乳样品 7.2净化 在混合的上清液中加人5ml正已烧和50L.浓盐酸,涡旋混合15s,在5000r/min下离心51 min 弃去正己婉层,重复上述步骤一次 55C条件下氮吹使其体积小于5mL 加人磷酸二氢钾缓冲液 .15)7mL,涡旋混合,超声20s,5C条件下以5000r/min离心15min 采用固相萃取柱(5.l1),用 3mL甲醇和3mL水活化柱,将样品过柱,弃去过柱液,然后用3mL水和6mL 甲醉洗柱,弃去过柱液 加大真空度抽滤10nmin 用2mL正己烧淋洗柱子两次并弃去淋洗液 用2mL乙酸-正已烧(4.20)洗 涤柱子两次,用15nmL离心管收集洗涤液 在55C条件下将洗涤液氮吹至干 随后,在每个样品中加 人混合流动相(4.9)1mL..涡旋混合5s,超声5s 样液用0.45Am的滤膜过滤到进样瓶中,待测 7.3测定条件 7.3.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下 色谱柱:InertsilDs-3,5Am,250mm×4.6mm(内径)或相当者 a 流速:0.4mL/min D) 检测波长:285nm:; c d 柱温;35C 进样量;20aL e f 运行时间:30min， 7.3.2液相色谱测定 用氟胺烟酸的标准基质溶液(4.24)分别进样,以峰面积和工作标准溶液浓度绘制标准工作曲线,样 品溶液中氟胺烟酸的响应值应在仪器测定的线性范围内 在上述色谱条件下,氟胺烟酸保留时间为 14min， ,标准物质色谱图参见附录A中的图A.1 氟胺烟酸的添加浓度及其平均回收率的试验数据参 见附录B中的表B.1 平行试验 按照上述步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.5空白试验 除不称取试样外,均按上述步骤进行 结果计算 试样中氟胺烟酸的残留量的测定按式(1)计算
GB/T22980一2008 xI" X=c 式中: 试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(mg/kg); 从标准曲线上得到被测组分溶液的浓度,单位为微克每毫升(4g/mL); -样品溶液定容体积,单位为毫升(mL); -样品溶液所代表试样的质量,单位为克(g) 7m7 计算结果应扣除空白值 精密度 9.1一般规定 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,其重复性和再现性的 值是以95%的可信度来计算 9.2重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,原料乳和纯奶粉中氟胶 烟酸添加浓度范围及重复性方程见表1 表1原料乳和纯奶粉中氟胺烟酸的添加浓度范围 及重复性和再现性方程 单位为微克每千克 样品基质 添加浓度范围 重复性限r" 再现性限R 原料乳 5.0一40.0 lg"=10,16Igm-l1,4 lgR=9.55lgm一10.65 r=0.311 一0.005 -0.006 纯奶粉 gR=0.3601 40.0l00.0 lgr lgm lg川 注，m为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，原料乳和纯奶粉中氟 胺烟酸添加浓度范围及再现性方程见表1
GB/T22980一2008 附 录A 资料性附录 标准物质色谱图 氟胺烟酸标准物质色谱图,见图A.1 mAU 3.5 14.464 2.5- O /in 20 图A.1氟胺烟酸标准物质色谱图
GB/T22980一2008 附 录 B 资料性附录 回 收 率 本方法中氟胺烟酸添加浓度及其平均回收率的试验数据,见表B.1 表B.1氟胺烟酸添加浓度及其平均回收率的试验数据 原料乳 纯奶粉 化合物名称 添加浓度/(g/kg 平均回收率/% 添加浓度/4g/kg 平均回收率/% 5.0 90.99 40,0 91.77 10.0 93.91 60.0 92.62 氟胺烟酸 94.27 80.0 95.77 20.0 40.0 93.18 100.0 97.32