GB/T15670.9-2017
农药登记毒理学试验方法第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验
Toxicologicaltestmethodsforpesticidesregistration—Part9:Skinsensitisationtest
- 中国标准分类号（CCS）B17
- 国际标准分类号（ICS）65.100
- 实施日期2018-02-01
- 文件格式PDF
- 文本页数10页
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农药登记毒理学试验方法第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验
国家标准 GB/T15670.92017 部分代替GB/T156701995 农药登记毒理学试验方法 第9部分:皮肤变态反应致敏)试验 Ioxsieologiealtestmethodsforpestieidesregistration- Part9:Skinsensitisationtest 2017-07-12发布 2018-02-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T15670.9一2017 修改了对阳性和阴性对照组设置的要求(见6.3.3.5,1995年版的7.5.2) -修改了结果评定的内容(见6.3.4,1995年版的7.6); 增加了豚鼠最大值试验和小鼠局部淋巴结分析试验两个试验方法(见6.4、6.5)
本部分由农业部提出
本部分由农业部种植业管理司归口
本部分起草单位:农业部农药检定所
本部分主要起草人:张宏伟,张丽英、曲莞、陶传江
本部分所代替标准的历次版本发布情况为 GB/T156701995
GB;/T15670.9一2017 农药登记毒理学试验方法 第9部分:皮肤变态反应(致敏)试验 范围 GB/T15670的本部分规定了皮肤变态反应(致敏)试验的基本原则、方法和要求
本部分适用于为农药登记而进行的皮肤变态反应致敏)试验
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB14925实验动物环境及设施 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3.1 皮肤变态反应skinsensitization contactdermatitis 过敏性接触性皮炎allergie 皮肤对一种物质产生的免疫源性皮肤反应
人类这种反应可能以瘙痒、红斑、丘疹、水疤、融合水疤 为特征
动物的反应不同,可能只见到皮肤红斑和水肿
3.2 诱导接触induetionesxposure 机体通过接触受试物而诱导出过敏状态的试验性暴露
3.3 诱导阶段induetioperiod 机体通过接触受试物而诱导出过敏状态所需的时间，一般至少1周
3.4 激发接触chalenee eNp0Sure 机体接受诱导暴露后,再次接触受试物的试验性暴露,以确定皮肤是否会出现过敏反应
3.5 刺激指数stimulationindex;SI 试验组淋巴结H甲基脱氧胸腺嗜苷或1碘苷的结合值与对照组(溶剂或赋形剂)淋巴结H甲 基脱氧胸腺喀苷或1碘苷的结合值的比值(率)
试验目的 确定重复接触受试物对哺乳动物是否可引起皮肤变态反应及其程度
GB/T15670.9一2017 5 试验概述 局部封闭涂皮试验(Buehlertest,BT)和豚鼠最大值试验(guineapigmaximisationtest,GPMT)是 实验动物通过多次皮肤涂抹(诱导接触)或皮内注射受试物10d~14d(诱导阶段)后,给予激发剂量的 受试物,观察实验动物,并与对照动物比较对激发接触受试物的皮肤反应强度
小鼠局部淋巴结分析试验(loeallymphnodeassay,LLNA)是通过耳部给予实验动物受试物,引起 淋巴结的淋巴细胞增生,淋巴细胞增生与受试物剂量(过敏程度)成比例
利用放射性标记方法,测定试 验组与对照组淋巴细胞的标记率,并进行对比,获得刺激指数,评价致敏强度 试验方法 6.1实验动物和饲养环境 局部封闭涂皮试验和豚鼠最大值试验宜选用健康、成年雄性或雌性豚鼠,雌性动物应选用未妊娠和 未经产的
小鼠局部淋巴结分析试验宜选用健康8周12周雕性未妊娠和未经产的CBA/Ca或CBA/J小 鼠
体重变异不超过平均体重的土20%
除非有充分证据说明其他的种系或性别在此试验中对结果没 有影响,原则上不采用其他的种系或性别动物
实验动物饲养环境和条件应符合GB14925的有关规定
选用常规饲料,饮水不限制,豚鼠需注意 补充适量Ve. 6.2动物试验前准备 试验前动物在实验动物房环境中至少检疫,适应5d时间
将动物随机分为受试物组和对照组,按 所选用的试验方法,选择适当部位给动物备皮(去毛),避免损伤皮肤
小鼠局部淋巴结分析试验不要采 用耳部标记记号的方式
试验开始和结束时应记录动物体重
无论在诱导阶段或激发阶段均应对动物进行全面观察,包括全身反应和局部反应,并作完整记录
6.3局部封闭涂皮试验(BuehlerTest,BT 6.3.1动物数 试验组至少20只,对照组至少l0只
6.3.2剂量水平 诱导接触受试物浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度,激发接触受试物浓度为不能引起皮 肤刺激反应的最高浓度
试验浓度水平可以通过少量动物(2只一3只)的预试验获得
水游性受试物可用水或用无刺澈性表面话性剂作为溶剂,非水辫性受试物如脂溶性受试物可用食 用油或其他无刺激性、无致敏性的表面活性剂作溶剂,当受试物在诱导接触中用80%乙醇做溶剂时,则 在激发接触中应用丙酮作溶剂
6.3.3试验步骤 6.3.3.1 动物的准备 试验前约24h,将豚鼠背部左侧去毛去毛范围为4cm一6cm
GB;/T15670.9一2017 6.3.3.2诱导接触 将受试物约0.2mL(g)涂在实验动物去毛区皮肤上,以二层纱布和一层玻璃纸覆盖,再以无刺激胶 布封闭固定6h
第7天和第14天以同样方法重复一次
6.3.3.3激发接触 末次诱导后14d.,将约0.2mL(e)的受试物涂于豚鼠背部右侧2cm×2cm去毛区(接触前24h去 毛),然后用二层纱布和一层玻璃纸覆盖,再以无刺激胶布固定6h
6.3.3.4观察评分 激发接触后24h和48h观察右侧皮肤反应,按表1评分
表1变态反应试验(局部封闭涂皮法)皮肤反应评分 皮肤反应 评分 红斑和焦痂形成 无红斑 轻微红斑(勉强可见 明显红斑<散在或小块红斑》 中度至重度红斑 严重红斑(紫红色)至轻微焦痂形成 水肿形成 无水肿 轻微水肿(勉强可见》 中度水肿(皮肤隆起轮咿清楚 重度水肿(皮肤隆起约1mm或超过1mm 最高积分 6.3.3.5试验对照 试验中应设阴性对照组,使用6.3.3.2和6.3.3.3的方法,在诱导接触时仅涂以溶剂作为对照,在激 发接触时涂以受试物
对照组动物应和受试物组动物为同一批
在实验室开展变态反应试验初期,或 使用新的动物种属或品系时,应同时设阳性对照组
6.3.3.6试验方法可靠性的检查 使用已知的能引起轻度/中度致敏的阳性物每隔半年检查一次
局部封闭涂皮试验至少有15%动 物出现皮肤过敏反应
阳性物一般采用2,4-二硝基氯苯、肉桂醛、2-统基苯并嚓陛或对氨基苯甲酸 乙酯
6.3.4结果评价 当受试物组动物出现皮肤反应积分>2时,判为该动物出现皮肤变态反应阳性,按表2判定受 6.3.4.1 试物的致敏强度
GB/T15670.9一2017 表2致敏强度 致敏率% 致敏强度 I一 6 弱 928 轻度 2964 中度 强度 65一80 81一100 极强 注;当致敏率为0时,可判为未见皮肤变态反应 6.3.4.2如激发接触所得结果可疑,应于第一次激发后1周,给予第二次激发,对照组作同步处理或按 6.4的方法进行评价
6.4豚鼠最大值试验(GuineaPigMaximmisationIest.GPMr) 注采用完全福氏佐剂(Fre ieundcompleteadjuvant,FCA)皮内注射方法检测致敏的可能性
6.4.1动物数 试验组至少10只,对照组至少5只
如果试验结果难以确定受试物的致敏性,应增加动物数,试验 组20只,对照组10只
6.4.2剂量水平 诱导接触受试物浓度为能引起皮肤轻度到中度刺激反应的最高浓度,激发接触受试物浓度为不能 引起皮肤刺激反应的最高浓度
试验浓度水平可以通过少量动物(2只3只)的预试验获得
6.4.3试验步骤 6.4.3.1 诱导接触(第0天 受试物组:将颈背部去毛区(2cm×4em)中线两侧划定三个对称点,每点皮内注射0.lmL下述 溶液 第1点1;1(体积比)FCA/水或生理盐水的混合物; 第2点耐受浓度的受试物; 第3点用1:1(体积比)FCA/水或生理盐水配制的受试物,浓度与第2点相同
对照组:注射部位同受试物组,每点皮内注射0.1m下述溶液: 第1点1:1(体积比)FCA/水或生理盐水的混合物; 第2点未稀释的溶剂 第3点用11(体积比)FCA水或生理盐水配制的浓度为500g/L的溶剂 6.4.3.2诱导接触(第7天 将涂有0.5g(mL)受试物的2cmX4cm滤纸敷贴在上述再次去毛的注射部位,然后用两层纱布 -层玻璃纸覆盖,无刺激胶布封闭固定48h
对无皮肤刺激作用的受试物,可加强致敏,对照组和试验 组动物于第二次诱导接触前24h在注射部位涂抹10%十二炕基硫酸钠(SLS)0.5ml
对照组仅用溶 剂作诱导处理
GB;/T15670.9一2017 6.4.3.3激发接触第21天 将豚鼠躯干部去毛,用涂有0.5g(mL)受试物的2cm×2cm滤纸片敷贴在去毛区,然后再用两层 纱布,一层玻璃纸覆盖,无刺激胶布封闭固定24h
对照组动物作同样处理
如激发接触所得结果不 能确定,可在第一次激发接触1周后进行第二次激发接触
对照组作同步处理
6.4.3.4试验方法可靠性的检查 使用已知的能引起轻度/中度致敏的阳性物每隔半年检查一次
豚鼠最大值试验至少有30%动物 出现皮肤过敏反应
阳性物一般采用2,4二硝基氯苯,肉桂醛、2-筑基苯并嚓陛或对氨基苯甲酸乙酯
6.4.4观察及结果评价 激发接触结束,除去涂有受试物的滤纸后24h、48h和72h,观察皮肤反应,按表3评分
如需要 清除受试残留物可用水或选用不改变皮肤已有反应和不损伤皮肤的溶剂
当受试物组动物皮肤反应积 分1时,应判为变态反应阳性,按表2对受试物进行致敏强度分级
表3变态反应试验(豚鼠最大值法)皮肤反应评分 皮肤反应 评分 未见皮肤反应 散在或小块红斑 中度红斑和融合红斑 重度红斑和水肿 6.5小鼠局部淋巴结分析试验(Ioeallmphnodeassay,.LLNA 注:本方法由于使用放射性同位素,试验应严格按照同位素实验室的有关规定进行
6.5.1动物数 试验组和对照组至少各4只
6.5.2剂量水平 至少设3个试验剂量浓度,1个阴性(溶剂)对照组以及1个阳性对照组
若要收集每个动物的试 验数据,则每组至少需要5只小鼠
剂量可选择100%,50%,25%,10%,5%,2.5%,1%或0.5%等
选 择的最高浓度应不产生急性毒性和局部刺激性
对照组除了不给予受试物外,动物处理方式应与试验 组一致
溶剂的选择应考虑到最高测试浓度和合适的溶解度
建议使用的溶剂有丙酮/橄榄油(4:1,体积 比),二甲基甲酰胺、甲乙酮、丙二醇、二甲基亚碱,也可使用其他合适的溶剂
6.5.3试验步骤 6.5.3.1受试物测试 试验第1天,称量每只动物的体重
在小鼠每只耳朵背部表面给予25AL的受试物,溶剂或阳性对 照物
第2,3天,重复第1天的步骤
第4、5天不进行任何处理
GB/T15670.9一2017 第6天,称量每只动物的体重
通过尾静脉给予试验组、对照组每只小鼠250AL的20Ci(7.4× 10Bq'H-甲基脱氧胸腺密苷的PBS缓冲液,也可给予250L的2ACi(7.4×10'Bq)的11碘苷和 1X10-mol/1氟尿嗜脱氧核苷的PBS缓冲液
5h后,处死动物,以每个试验组为单位,分离每只 动物耳部的一对淋巴结,放人PBS缓冲液中,也可以每只动物为单位,分离一对淋巴结
6.5.3.2耳部淋巴结分离 通常采用腹侧解剖的方法分离淋巴结,将小鼠腹部暴露,用70%乙醇湿润腹部和颈部
在胸部和 前肢之间剪开,再与此相垂直沿中线剪开,直至下颌部
剥离皮肤暴露外侧颈部静脉,避开中线部位的 唾液腺和与之相连的淋巴结
淋巴结位于咀嚼肌远端,颈静脉分枝处
淋巴结为均匀的半透明状的 结节
6.5.3.3细胞悬液的制备 上述分离的淋巴结组织经研磨,过200目(4m)筛在PBS缓冲液中充分洗涤2遍,于5%的三氯乙 酸(TCA)4C放置18h
沉淀重悬于1mL的5%三氧乙酸(TcA)中,转移至含有1.0mLH闪烁液 的闪烁管内或直接转移至含15I的y计数管内
6.5.3.4细胞增生的检测放射活性的结合测定 通过B闪烁计数,以每分钟的衰变计算'H甲基脱氧胸腺嗜苷的结合率
通过'I的7计数管 以每分钟的衰变计算'下碘苷的结合率
6.5.4实验动物的观察 每天应观察一次实验动物的一般表现、局部的刺激性或系统毒性,认真记录
试验前和处死动物前 记录体重
6.5.5结果评价 结果以刺激指数(stimulationindex,S)表示
试验以组为单位 试验组动物放射性结合率 sI= 溶剂组放射性结合率 试验以每只动物为单位: 试验组每只动物的DPM均值 SI 溶液组每只动物的DPM均值 其中DPM(disintegrationsperminm nute)为每分钟的衰变率 利用每只动物进行分析,计算S值的方法,可以评价处理组和溶剂组的每个数据并进行统计学 分析
阳性结果的判断,SI值多3,具有剂量-反应关系和统计学意义
为了阐明某些研究结果,要考虑不同受试物的特性,包括是否与已知的致敏物结构相似,是否可引 起过度皮肤刺激,所见的剂量-反应特点
试验报告 试验报告至少应包括以下内容 试验名称,试验单位名称和联系方式,报告编号; a
GB;/T15670.9一2017 试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况 b 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期; c 试验摘要; d) 受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号(CAs号)(如已知)、代码(如有,纯度(或含量 e 剂型、生产日期(批号),理化性质、配制所用溶剂和方法 fD 实验动物的种属品系、级别、数量、体重、性别、来源(供应商名称、实验动物质量合格证号、实 验动物生产许可证号),检疫,适应情况,实验动物饲养环境,包括温度、相对湿度、饲料、单笼何 养或群饲、实验动物设施使用许可证号; 剂量和组别,包括选择剂量的原则和依据、动物分组方式和每组每种性别动物数; g h)试验条件和方法,包括主要仪器和设备,染毒途径、染毒方案,试验周期、观察指标等; i 试验结果;以文字描述和表格逐项进行汇总,报告各组动物皮肤反应情况和致敏率等;小鼠局 部淋巴结分析试验报告每个剂量组平均或单个的DPM值和刺激指数 可信度的检查,包括最近的可信度试验结果,实验室目前或历史上阳性物和阴性物控制数据; j k 试验结论:给出受试物在试验条件下是否引起变态反应的结论,必要时对有关问题进行讨论 原始记录保存情况的说明
农药登记毒理学试验方法第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验GB/T15670.9-2017
农药是保障现代农业生产不可或缺的化学品。为确保农药的安全使用，相关部门要求对农药进行注册审查。其中，毒理学试验是农药注册审查的重要环节之一。 GB/T15670.9-2017是国家标准《农药登记毒理学试验方法 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验》的简称，该标准规定了用于评估农药接触皮肤后引起的变态反应（致敏）的试验方法。 根据该标准，在试验前应制定好实验方案，并进行必要的实验室检测。试验对象通常采用小鼠、豚鼠或兔子等动物。试验期间要密切观察动物的皮肤变化，如出现红斑、水泡、结痂等症状，应及时记录并加以分析。试验结束后，对试验结果进行综合评价，包括对皮肤变化程度、局部和全身反应、死亡率等指标的评估。 GB/T15670.9-2017的推出，为农药注册审查提供了科学规范的依据，也为农民的安全使用提供了有效保障。同时，该标准的实施也促进了农药行业的健康发展，增强了市场竞争力。 总之，GB/T15670.9-2017对于农药的安全性评估具有重要意义，相关企业和单位应严格遵循该标准的规定进行毒理学试验，确保农药的安全使用和消费者的利益。
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