GB/T35336-2017
苹果皱果类病毒检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofApplefruitcrinkleviroid
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2018-07-01
- 文件格式PDF
- 文本页数13页
- 文件大小979.21KB
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苹果皱果类病毒检疫鉴定方法
国家标准 GB/T35336一2017 苹果皱果类病毒检疫鉴定方法 DeteetioandidentifrieatonofApple/fruilerinkleyiroid 2017-12-29发布 2018-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35336一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利
本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标准起草单位:北京出人境检验检疫局、检验检疫科学研究院
本标准主要起草人:邓丛良、赵晓丽、吕玉峰,梁新苗、骆卫峰,郑春生、张永江
GB/35336一2017 苹果皱果类病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了苹果皱果类病毒的检疫鉴定方法
本标准适用于可能带有苹果皱果类病毒的植物材料的检测鉴定
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 苹果皱果类病毒基本信息 学名:Applefruicrinkleviroid
缩写:AFCVd
分类地位;马铃纺锤块茎类病毒科(Posiuiroidae)、苹果锈果类病毒属(A办cairoid). 草果皱果类椭毒的其他信息参见附录A 方法原理 类病毒检测主要针对其核酸序列
主要的方法有RT-PCR和核酸分子杂交
仪器设备、主要用具和主要试剂 5.1仪器设备 电子天平(感量0.001g)、普通天平(感量0.1)、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超 低温冰箱(一80C,制冰机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、,PCR仪、微波炉,电泳仪、电 泳槽、凝胶分析成像系统、实时荧光PCR仪、杂交炉、塑料薄膜封口机、紫外交联仪、暗箱、摇床、恒温水 浴锅、组织破碎仪等
5.2主要用具 可调移液器(2.5l、10L、20L,200MlL、1000L、5000L),无RNA酶吸头(10lL,20MlL 200L、1000AL5000L),无RNA酶离心管(1.5mL5mL、10mL),研钵,研棒、磁性分离架、PCR 反应管(200L),实时荧光96孔反应板、杂交瓶、杂交膜、杂交袋、X光片
5.3主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定
RT-PCR检测试 剂见附录B;实时荧光RT-PCR检测试剂见附录C;斑点杂交检测试剂见附录D.
GB/T35336一2017 6 检测与鉴定 6.1普通RT-CR检测方法 普通RT-PCR检测方法见附录B 6.2实时荧光RT-PCR检测方法 实时荧光RT-PCR检测方法见附录C 6.3斑点杂交检测方法 斑点杂交检测方法见附录D. 结果判定 样品经普通RTPCR检测为阳性,且实时荧光RT-PCR检测为阳性或斑点杂交检测为阳性,则判 定为检出苹果皱果类病毒
样品经普通RT-PCR检测为阳性,且序列测定结果与已知的AFCVd序列一致,则判定为检出苹果 皱果类病毒
样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性,且序列测定结果与已知的AFCVd序列一致,则判定为检出 苹果皱果类病毒
样品保存与结果记录 8 8.1样品保存 样品经登记人和经手人签字后妥善保存3个月,种子保存在4C冰箱内,生长苗木或插条保存在隔 离温室中培养,叶片,果实等样品在一80C冰箱内保存
对检出苹果皱果类病毒的样品应至少保存 6个月,以备复核,谈判和仲裁
保存期满后,应灭活处理
8.2结果记录 完整的实验记录要包括样品的来源、种类、采集时间、实验检测时间,地点、方法和结果,并有实验人 员的签字;普通RT-PCR检测结果保存电泳照片,实时荧光RT-PCR检测结果保存荧光曲线图及Ct 值,斑点杂交检测保存照片,序列测定结果保存测序报告图
GB/35336一2017 附 录 A 资料性附录 苹果皱果类病毒相关资料 寄主范围 A.1 自然条件下侵染苹果(Maluspumila)和啤酒花(Hwmulaslupulus)
A.2病害症状 苹果受AFCVd侵染后,其典型的症状表现为果实粗糙皱缩、果肉坏死,另外一些品种被感染后,树 皮也会发生异常,如出现瘤疹或枝条末梢枯死等
AFCVd侵染啤酒花会造成藤蔓的矮化,卷叶和皱缩 等症状
A.3分布地区 日本
传播方式 A.4 AFCVd主要通过嫁接,芽接和机械传播
A.5基因组 AFCVd为单链环状的RNA分子,长368个372个核苷酸残基,存在于细胞核内,非对称性滚环 复制
GB/T35336?2017 ? B 淶??) ?RI-PCR? B.1?? B.1.11mol/L(K,IHPO 7.42g ??100mL,0.22Mm??? B1.22.5mol/L(K.HPO. 43.55g ??100mL.,0.224m??? B.1.33mol/L(NaAc)pH5.2 ? 40.83g mal/?H3.??10ml.?? B.1.44mol/L(LiC ? 16.96g ??100ml0.22m???4C B.1.5?? 4molL (GITC ? 5g/1 ?X-100(TritonX-100) 0.1%() ?(NaCI 10mmol/ ??(pH7.0) 25mmol/ ?(PVP) 20g/1 B.1.650TAE? Tris 242g 57.lml ?(EDTA)(0.5mol/L,pHI8,0 100ml ??1I B.1.76xL.oading? 2.5g/1 2.5g/L ?FF ?? 400g/
GB/35336一2017 贮存于4C
B.2引物序列 根据NCB核酸数据库中AFCVd基因组全序列(NC_003777.1)设计引物 正向引物AFCVdF:5'-TGGGCTCCAACTAGTGGTTcC-3" 反向引物AFCVdR:5'-CAccCAAACAAGGGAATCCT-3' 扩增片段大小为369p B.3试验步骤 B.3.1 RNA的提取 B.3.1.1方法一(LiCl法 取1其样品,加液氨研磨成粉末状,将研磨物迅速移人10mL离心管中,并加人2mL.1nmolL磷酸 氢二钾和8AL统基乙醇,混匀,再加人2ml水饱和酚;三氯甲烧(体积比为1;1),涡旋1min,充分混 匀;4C,10000g离心10min
取上层液体,加人同体积的水饱和酚;三氯甲烧(体积比为1:1),充分 混匀;4,l0000g离心10min
取上层液体,加人2.5倍体积的无水乙醇,充分混匀;一20C下放置 2h4h或-80下放置至少301 nmin;4C,l0000g离心10 取沉淀,加1ml无RNA酶的水充 min
分溶解后,再加人1ml2.5mol/L磷酸氢二钾、1mL的乙二醉单甲献(即;2-甲氧基-乙醉),充分混匀; 取上层液体,加人无RNA酶的水至10mL,再加人100AL.20g/L的十六 C,10000g离心10min 烧基三甲基澳化铵(CTAB)溶液,充分混匀,冰浴3h 4h;4C,10000g离心10min
取沉淀,加人 2ml无RNA酶的水充分溶解后,加人5ml.无水乙醇,0.2ml3mol/儿1乙酸钠(pH5.2),充分混匀 -20下放置至少2h;4C,10000g离心10 min
取沉淀,加200AL无RNA酶的水反复吹打,待沉 淀充分溶解后,将溶解物移人1.5ml离心管中;加人200"lL4mv nol/1氯化锂,充分混匀,冰浴至少4h C,10000g离心10min
取上层液体于1.5mL离心管中,加人2.5倍体积的无水乙醇,混匀， -20下放置至少2h或-80下放置至少30min;4,12000离心10min
取沉淀,70%乙醉清 洗沉淀;4C,12000g离心2min;取沉淀,待其干燥后,加人50AL60AL无RNA酶的水充分溶解 -20下保存备用
B.3.1.2方法二(CTAB法 取0.1g样品,加液氮研磨成粉末状,将研磨物迅速移人1.5mL离心管中,加人预热的CTAB提取 缓冲液900AL,以及2%的统基乙醇,颠倒混匀,65C孵育10min,加人等体积的三氯甲烧:异戊醇 24:l),混匀,4,l1000g离心10min; ;取上清液，三氯甲烧:异戊醉(24:1)再抽提一次,混匀 min,4C 4C,l1000离心10min;取上清液,加人10mol/L的氧化锂至终浓度3mol/L,冰浴301 12000离心20min;弃上清液,加人65C预热的sSTE缓冲液500L.溶解沉淀,以及等体积的三氯 甲烧;异戊醉,混匀;4C11000g离心10min n,取上清液移人1.5ml离心管,加人700AL预冷的异丙 醇,一20C沉淀30min 4,12000g离心20min;沉淀用70%乙醇洗涤2次,4C,12000g离心 2 min;去除上清液,沉淀自然干燥后,将其溶于30lL50l无RNA酶的水中 B.3.1.3方法三(纳米磁珠法) 取0.1g样品,加液氮研磨成粉末状,待研磨物温度升到室温,加人1ml的研磨缓冲液，继续充分 研磨,将研磨物移人1.5mL的离心管,4C,5000离心5min,留上清液备用
取2mg纳米磁珠于
GB/T35336一2017 1.5ml的离心管中,离心管置于磁性分离架上,吸附纳米磁珠,弃上清液
向含有纳米磁珠的离心管中 加人200AL备用上清液,用枪反复吹打至没有明显结块
再向离心管中加人200"L无水乙醇,颠倒混 匀,室温放置5min 10min,放置期间颠倒混匀几次
室温,5000g,离心l0s,置于磁性分离架上,吸 附纳米磁珠,弃上清液
向离心管中加人150L.70%的乙醇,用枪吹打混匀,将离心管置于磁性分离架 上 .,吸附纳米磁珠,弃上清液,并重复2次5次,至上清液没有明显颜色
室温,5o00g,离心10s,置 于磁性分离架上,吸附纳米磁珠,完全弃除上清液
向离心管中加人约50L无RNA酶的水,用枪反 min5 复吹打重新悬浮纳米磁珠,室温放置2" min
将离心管置于磁性分离架上,吸附纳米磁珠,将含 有RNA的上清液转移至一无RNA酶的离心管中,-80C冰箱保存备用
注:RNA也可使用相应市售RNA提取试剂盒提取
， B.3.2RI-PCR检测 在25L反应体系中加人2.5L10×RT-PCR缓冲液,5lMgCl.(25mmol/L),2.5lLdNTP 混合物各10mmol/L),0.5AlLRNA酶抑制剂(40U/AL),0.5AL
反转录酶(5U/AL),0.5l
Tag DNA聚合酶(5U/L).0.5L引物AFCvdF(20mol/L),0.5L引物AFcVdR(20Mmol/L).1AL RNA,无RNA酶超纯水补至25l
反应条件为:50C30nmin,94C2min;然后94C30s,55C 30s,72C30s,共35个循环;72C5min. 注反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整
也可采用其他商业RT-PCR试 剂盒
B.3.3CR产物的琼脂糖凝胶电泳 灌制2%琼脂糖凝胶板,室温凝胶30min,取5AlL
PCR产物与6×loading缓冲液混匀后点样,用 DNAMarker作分子量标记,在1×TAE中以5V/e的电压电泳30min
澳化乙锭溶液(0.5g/mL) 染色10min,用凝胶成像仪照相
B.3.4CR产物测序 将电泳后有约为369bp条带的PCR产物进行测序分析
B.4结果判定 阴性对照和空白对照在369bp处未出现扩增条带,待测样品与阳性对照在369bp处出现扩增条 带,测序结果与已知AFCVd序列一致的,判定结果为阳性
阴性对照和空白对照在369bp处未出现扩增条带,阳性对照在369bp处出现扩增条带，且样品无 特异性扩增,判定结果为阴性
GB/35336一2017 录 附 C 规范性附录 实时荧光RI-PCR检测方法 主要试剂 C.1 RNA提取试剂见B.1.1B1.5
C.2引物和探针序列 根据NCB核酸数据库中AFCVd基因组全序列(Nc_003777.1)设计引物和探针 AFCVdFP;5'-GGCGCGGCGAGAAGA-3" AFCVd-RP.5'-AAAAGGAAAAGcCGGAGCTT-3 AFCVdP:5'-FAM-CGCTAGCCGTcCTCCAGTGGAAGA-BHQ1-3' 实验步骤 C.3.1 RNA的提取 见B.3.1
C.3.2实时荧光RT-CR检测 以提取的RNA为模板进行实时荧光RT-PCR反应,即在25AL反应体系中加人12.5AL2×实时 荧光RT-PCRMasterMix(含终浓度4.0mmol/L的Mg+),l.5AL.Mg(Cl(25mmol/L),0.875Al引 物AFCvd-FP(20mol/L),0.875AL引物AFcVdRP(20mol/1),0.625
探针AFCvd-P 20 nol/L),0.254L实时荧光RTMix,lLRNA,无RNA酶超纯水补至25AL MmG 反应条件为:50C30min;95C15min ;然后94C15s,60笔60s,共40个循环
注:反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当训整
也可采用其他商业实时荧光R！ PCR试剂盒
C.4结果判定 实时荧光PCR反应结束后,应设置无效基线范围,基线范围选择在3个15个循环,如果有强阳 性样本,应根据实际情况调整基线范围
值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高 点,且Ct值一40为准
在阳性对照、,阴性对照和空白对照正确的前提下 如果待测样品的Ct值等于40时,则判定结果为阴性; 如果待测样品的Ct值小于或等于35时,则判定结果为阳性 如果待测样品的Ct值小于40而大于35时,应重新进行测试,如果重新测试的C值等于40 时,则判定结果为阴性;如果重新测试的Ct值小于或等于35时,则判定结果为阳性;如果重新 测试的Ct值小于40而大于35,且扩增曲线明显时,则判定结果为阳性
GB/T35336一2017 附 录 D 规范性附录) 斑点杂交检测方法 主要试剂 D.1 D.1.1探针 将纯化的AFCvd的cDNA克隆到载体pGEMT上的启动子(T,/sP)序列的下游.将重组质粒 GEM-AFCcVd转化大肠杆菌(DH5a),挑选出阳性克隆
扩大培养阳性克隆,据取质粒
使用 AFcVd序列下游的具有5'粘性末端的限制性内切酶彻底消化重组质粒,使得质粒线性化
具体反应 体系如下 GEM-AFcvd重组质粒 2g3'g 10×缓冲液 54l 限制性内切酶(5'黏性末端 30U 加水至 50 37C孵育至少2h,然后吸取1nL进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测
若酶切不彻底,则补加20 u 的限制性内切酶继续反应,直至酶切完全;若酶切完全,则往反应产物中加人150AL灭菌水至终体积为 200L,加人200AL酚;三氯甲婉:异戊醇(25;24:1,pH>7.8),涡旋1min,13000g离心10min 取上清液,放人新的离心管(1.5mL)内,往剩余的液体中再加人200AL灭菌水,重复抽提一次
将两次 上清液混合(约400AL),加人2倍体积的无水乙醇和1/10体积的醋酸钠溶液(3mol/L,pH5.2)
-20C放置至少2h后,13000g,离心15min,弃上清液,加人1mL75%乙醇,振荡将沉淀悬浮起来 3000离心5min,弃上清液,干燥沉淀后,溶于20L灭菌水中
注;也可以使用试剂盒纯化线性化的重组质粒 获得纯化的线性重组质粒后,通过AFCVd序列的上游启动子进行体外转录,合成地高辛标记的 AFCvd负链RNA作为探针
取1g线性化重组质粒作为模板加人到无菌的反应管中,按如下体系: 线性化重组质粒pGEM-AFCVd lg 5×NTP混合液(含地高辛标记的UTP 4L 5×转录缓冲液 4l RNA聚合酶(20U/AL) AL 2 1儿 RNA酶抑制剂 无RNA酶超纯水 至20l. 轻轻涡旋后,瞬时离心,42C温育2h
加人2LDNA酶I(DNaseI,37C温育15min;之后 加人2"lL.0.2mol/1EDTA(pH8.0)终止反应
电泳,估计探针浓度
注:该方法模板要求很高,要高度纯化,线性完全
被标记序列长度不能低于200bp,l000bp是最佳长度
模板也 可以通过PCR加上启动子序列的方法获得 D.1.22xCTAB缓冲液(100mL): 10mL TrisCl(1mol/L NaCl3mol/L 46.6ml 10mL EDTA(0.3mol/L,pH7.0 CTAB固体粉末 2g 无菌水 28.4mL(定容至100mL
GB/35336一2017 8筑基乙醉 5ml(使用前按比例加人) D.1.3水饱和酚;三氯甲婉(1:1) 将水饱和酚和三氯甲炕等体积混合后,放置4C保存备用
D.1.4异丙醉
D.1.570%乙醇: 取70ml无水乙醇,加人无RNase的水至100ml,混匀后置于4C
D.1.620×SsCpH7.0): 氯化钠(NaCI 17.53g 柠檬酸钠 8.82g 用mal/儿盐酸(Hcl)溶液调pH值至7.0,加双蒸水定容至100ml,高压灭菌待用 D.1.710%十二婉基碱酸钠(sDs) 十二婉基磺酸钠 10g 用80ml去离子水溶解,加热到68C并用磁力搅拌器搅拌有助于溶解
如果需要,用1mol/儿盐 酸溶液调pH值至7.2
用去离子水定容至100mL
室温保存
无须蒸汽高压灭菌
D.1.8马来酸缓冲液(pH7.5) 马来酸 1.l6g 氯化钠(NaCI 0.8775g 用80mL去离子水溶解,然后用NaOH颗粒调节pH值至7.5,加去离子水定容至100mL,灭菌 待用
D.1.91%封闭液(现用现配). 封闭剂(一20C保存 1g 用马来酸缓冲液定容至100 ml
注此处要求马来酸pH严格,否则不溶;封闭剂很难溶,要稍加热(50C左右),并用磁力搅拌子搅拌溶化 D.1.10抗体溶液(现用现配). Anti-DG-AP(4C保存) 10ML 用封闭液定容至100ml
D.1.11洗涤缓冲液(现用现配): 马来酸缓冲液 00mL 吐温-20(Tween-20) 0.3ml D.1.12检测缓冲液(pH9.5): Tris碱 .211 g 0.585g 氯化钠(NaCI 加去离子水定容至100mL,灭菌待用
D.1.13化学发光底物(CSPD)稀释液 将CSPD用力摇匀后,每6滴8滴CSPD加人1mL检测缓冲液,混匀
D.1.14通用显影粉
D.1.15酸性定影粉
D.2试验步骤 D.2.1RNA提取 见B.3.l
注将阳性对照,阴性对照样品与待检测的样品一起进行RNA提取
GB/T35336一2017 D.2.2样品处理 取1g~24g(约4L)提取的RNA,将其加人PCR反应管中,65C温育15min,冰浴51 ,瞬 min， 离,即得到变性后的RNA样品
D.2.3点膜 将变性后的RNA样品点于杂交膜上,同时将等量的阳性对照和阴性对照样品的RNA点于相应位 置处,并做好标记 注:任何时候都不能用手直接接触杂交膜,需要戴上一次性的PE手套
D.2.4固定 将点好的膜正面朝上放于紫外交联仪中,能量1200×100/em”放置3min或将点好的膜放人 烘箱中,80C放置1h2h或120C放置30min
D.2.5预杂交 将固定好的膜放人杂交瓶中,并加人杂交液(12ml/100cm15mL/100cm膜),至少要保证杂 交液完全覆盖杂交膜,68C预杂交1h3h
注加人杂交液后,要将杂交膜和杂交瓶壁之间的气泡赶出
此外,加人杂交液后在之后的任何操作过程中都要 避免杂交膜的干燥
D.2.6杂交 预杂交结束后,取标记的RNA探针(20ng/mL100ng/mL杂交液)加人到杂交液中,68C杂交 6h以上(一般过夜)
注:加人探针时,切记将探针直接加到杂交膜上,应该将杂交瓶稍微倾斜,将探针加到杂交液里
D.2.7洗膜 杂交结束后,弃杂交液,加人足量的2×SsC(一般不少于30ml),室温洗膜2次,每次5min(在洗 涤的过程中配制0.1×SsC和0.1%SDs的混合液,并且将其预热到68C);加人足量的68C预热的 0.1×SsC和0.1%SDS混合液(一般不少于30mL),68C洗膜2次,每次15min
在洗涤的过程中,配 制1%的封闭液
注配制0.1lxssC和0.1%sDS的混合液时,建议先加人灭菌水,再加人所需的ssC和sDs溶液
不要将ssC和 sDs浴液直接混合,避免出现不易溶解的沉淀
D.2.8封闭 洗膜后,弃掉瓶内的溶液,加人配制好的1%的封闭液(12ml/100em'15ml/100cm”膜),室温 30min n(可延长至3h)
D.2.9结合抗体 弃封闭液,加人抗体溶液(12mL/100cnm'15mL/100cm膜),37C孵育30min
D.2.10洗涤 弃抗体溶液,加人足量的洗涤缓冲液(一般大于30ml)室温洗膜2次,每次15min,弃洗涤液
10
GB/35336一2017 D.2.11平衡 加人检测缓冲液(12mL/100em*15mL/100cm膜)室温平衡10nmin.
注:D.2.5~D.2.11步骤中用到的各种液体可根据试验具体情况进行调整,但要确保杂交膜没浸没于液体中且不漂浮
D.2.12感光处理 将杂交膜放人一边封好的杂交袋中(杂交膜点样面朝上),在点样面上加人适量的化学发光底物 CSPD)稀释液(1mL/100cm膜),然后将杂交袋封闭,用手反复轻推数次使CSPD稀释液在膜上扩散 均匀
之后,将杂交全部袋的一个角剪开,将多余的CSPD稀释液全部挤出后,封闭杂交袋
D.2.13压片 在暗室中,膜正面向上放于暗盒,将比膜稍大的X光片平整地压于膜上,封好暗盒,必要时可用胶 带固定杂交袋
暗盒内曝光约1.5h
D.2.14显影和定影 曝光后,在暗室内取出感光后的胶片放于显影液内显影4min5min,打开红光灯一尺距离观察 显影效果,当可以清楚地看到阳性对照或检测到的阳性显影清楚后,将胶片放人清水中冲洗30s,放人 定影液中定影10min,再用流水冲洗30s,拿出暗室
注:曝光和显影时间可根据试验具体情况进行调整,以达到最佳效果
D.3结果判定 阴性对照和空白对照未出现杂交斑,待测样品与阳性对照出现杂交斑,判定结果为阳性
阴性对照和空白对照未出现杂交斑,阳性对照出现杂交斑,且样品无杂交斑,判定结果为阴性
苹果皱果类病毒检疫鉴定方法GB/T35336-2017
苹果是我国重要的水果之一，但是近年来，由于外来病毒、虫害等问题，苹果生产受到了很大的影响。其中，皱果类病毒是苹果上常见的一种病毒，严重影响了苹果的质量和产量。
为了保障苹果的质量和安全，我国制定了苹果皱果类病毒检疫鉴定方法GB/T35336-2017。该标准详细规定了苹果皱果类病毒的鉴定方法，包括样品的采集、处理、提取核酸、PCR扩增、电泳分析等。通过这些步骤，可以快速、准确地检测出苹果上是否存在皱果类病毒。
使用苹果皱果类病毒检疫鉴定方法GB/T35336-2017，可以有效地防止苹果上的皱果类病毒传播。一旦发现苹果上存在这种病毒，就可以采取相应的措施，防止病毒进一步扩散。
总的来说，苹果皱果类病毒检疫鉴定方法GB/T35336-2017是我国对于苹果产业保障的重要一步。只有通过严格的检测和防范，才能保证苹果的质量和安全，为消费者提供优质的水果产品。
