玉米褪绿矮缩病毒检疫鉴定方法

玉米褪绿矮缩病毒检疫鉴定方法

国家标准 GB/T35271一2017 玉米褪绿矮缩病毒检疫鉴定方法 DeteetionandidentfieationofMaicechloroticdwarfviras 2017-12-29发布 2018-07-01实施 中华人民共利国国家质量监督检验检疙总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35271一2017 玉米褪绿矮缩病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了玉米褪绿矮缩病毒的检疫和鉴定方法 本标准适用于进出境粮谷作物上玉米褪绿矮缩病毒的检疫和鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2964！植物病毒检测规范 玉米褪绿矮缩病毒基本信息 学名:Mai这echloroticdwarfzirus 异名.Ohiocornstunt agent 缩写;MCDV 分类地位;伴生豇豆花叶病毒科(Seeoviridae)、水稻矮化病毒属(waikairus). 玉米褪绿矮缩病毒的其他信息参见附录A 方法原理 根据该病毒的生物学,免疫学和分子生物学特性,利用基于抗原抗体反应的双抗体夹心酶联免疫吸 附测定(DASELISA)反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),实时荧光RT-PCR及免疫电镜IEM)进行 检测鉴定 仪器设备和主要试剂 5.1仪器设备 电子天平(感量0.001g)、普通天平(感量0.1)、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超 -80C),旋涡振荡器、高压灭菌锅,pH计,超净工作台.PCR仪,荧光CR仪、微波炉,电泳 低温冰箱( 仪、电泳槽、凝胶分析成像系统、酶联检测仪、透射电子显微镜 5.2用具 可调移液器(2.5"L、10AlL,20AL、100L、l000"L)及吸头,离心管,PCR管和研钵等
GB/T35271一2017 5.3主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定 双抗体夹心酶联 免疫吸附测定试剂见附录B;RT-PCR检测试剂见附录C;免疫电镜检测试剂见SN/T1840. 6 检测与鉴定 6.1取样 对于有症状的样品选取表现症状的样品组织,对于无症状的样品抽样方法按照SN/T2122进行 6.2双抗体夹心酶联免疫吸附测定 把0.5g一1.0只样品充分研磨或在液氮中研磨,按110比例加人样品提取缓冲液,转移到离心管 中,8000r/min离心5min,上清液作为DAS-ELISA的检测提取缓冲液 设置阴性对照,阳性对照和空白对照具体操作过程见附录B 注提取液在3h内使用,否则保存于4C中 6.3RT-PCR检测 分别提取样品总RNA后,进行RT-PCR检测 设置阴性对照(健康植物组织),阳性对照(感染MCDV的植物组织)和空白对照(ddH,(O),具体操 作过程见附录C 6.4实时荧光RT-CR检测 实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同6.3,双蒸水作为空白对照 分别提取样品和对 照的RNA后进行实时荧光PCR检测,具体操作见附录D 6.5免疫电镜检测 按照SN/T1840中规定的方法制备样品和进行电镜观察病毒粒子形态 在免疫电镜下如观察到 大小为28nm30nm的二十面球体,即可判定结果阳性 6.6测序 当PCR产物回收后进行测序 结果判定 当产生以下检测结果时,则判定为检出MCDv,否则判定为未检出McDv 当酶联免疫检测、RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测免疫电镜检测中有两种及两种以上 的检测结果呈阳性时,判定为检出玉米褪绿矮缩病毒 当RT-PCR检测为阳性,且序列测定结果与已知的MCDV序列一致,判定为检出玉米褪绿矮 缩病毒
GB/35271一2017 样品保存 8.1样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后,未检出玉米褪绿矮缩病毒样品,应置于-一80冰箱内妥善保存3个 月 对于检出玉米褪绿矮缩病毒的样品至少保存6个月,或保存至索赔有效期满,以备复核 该类样品 保存期满后应经高压灭菌后方可处理 8.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括;样品的来源、种类,时间,实验的时间.地点,方法和结果等,并要有实验人员 和审核人员签字 酶联免疫方法应有酶联反应的原始数据,RT-PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片 免疫电镜检测应有电镜照片,实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图谱,测序应有核酸序列信息材料
GB/T35271?2017 ? A ??) ?? A.1? MCDV?,? A.2Χ A.2.1? Χ,?[Zeamays(L]?é(Sorghumhalepense) A.2.2? (Digitariasanguinalis),?(Panicwm miliaceum),[Penniselumglaucum(L.)], Setariafaberi)βSorghumbicolor)?Sorghumvulgarevarsudanense)С (Triticuaestivum Au L.)[CyodondactylonL.]?éDactylis Uenasatia leun gomeradaL.)(EIytrigiarpens)ü(EraEroticilanensis)(Hord ,(L.olin iumperenne),?(OryasatiaL.??(Paspalumdilatatum) uulgare PhleumpratenseL.)(Saccharumoficinarum)(Se ,??(S/ ecaleceeale te7o tabhrn1Sec1dlatn1 A.3?? MCDV?,????????????????( ?A.1);??é?
GB/T35271?2017 usszob b MCDV??? MCV?? a ?1a)htp://www.agweb.com/ ?2:bhttp://www.forestryimages.,org/ ?A.1NCDv??? A.4? MCDV???28nm?30nm??,??(?A.2) 00nm ?;ReportonPlantDseaseDepartmentofCropSeiencesUnmiversityoflinoisatUbana" -Champaign ?A.2MCV?
GB/T35271一2017 A.5传播方式 MCDV非种传,由叶蝉[GraminellanigrifronsForbes)]等昆虫介体以半持久方式进行传播 介 体从感病植株获得病毒后,可在几小时之内将病毒传播到健康植株,但如介体获得病毒2d~3d后或 叶蝉处于换毛期时,介体将失去传毒能力 叶蝉无法单独传播病毒粒体,需要借助病毒侵染时植物体产 HC) 生辅助病毒编码的助蛋白helpercomponent A.6抗原特性 MCDV具有较强免疫原性,与其他玉米病毒无血清学关系 基因组 A.7 病毒基因组是一段正义单链RNA基因组,长度为.8b 梢毒外壳蛋白由三种多胀组成,分子 质量分别约为34ku,25ku和24ku.
GB/35271?2017 ? B 淶?? ??? B.1 ?? B.1.1 ??塣 B.1.2?? ???塣 B.1.3 (pNPP). B.1.4??? 1PBST .0L (NasO 1.3g PVP(MW24000MW40000 20.0 g 0.2 (NaN g 20.0ml -20 pH?7.4,4??档 B.1.5? 1.59 ?(NagCO g 2.93 ?(NaHCO g 0.2 (NaN, 8 ??,pH?9.6,??1L,4C?档 B.1.6PBS?(??? ?(NaCI 8.0 g 0.2 (KH,PO g 1.15 (NaHPO g 0.2 ?(KCI 8 0.5mL -20
GB/T35271一2017 溶于燕水,调pH值至7.4,蒸僧水定容至1L,4C冰箱保存 B1.7酶标抗体稀释缓冲液 1×PBST 1.0L PVP(MW24000MW40000 20.0 g 2.0 BSA(牛血清白蛋白 g 0.2 叠氮化钠(NaN) 2g 调pH值至7.4,4C冰箱保存 B.1.8底物(pNPp)缓冲液 二乙醇胺 97.0ml 氯化镁(MgCl,) 0,ls 叠氮化纳(NaN, 0.2g 溶于蒸水,调pH值至9.8,蒸憎水定容至1L,4C冰箱保存 B.1.9反应终止液 氢氧化钠(NaOHH 12.0g 蒸水定容到100mL B.2试验步骤 B.2.1包被抗体 用包被缓冲液将包被抗体按说明稀释,加人酶联板孔中,100AL/孔,加盖,37C孵育2h,清空孔中 溶液,PBST洗涤4次,每次3min B.2.2样品制备 待测样品幼嫩叶片按1:10加人抽提缓冲液,用研钵研磨成浆,2000从离心10min,上清液即为 制备好的检测样品 对阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行 B.2.3加样 加人制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照,100L/孔,加盖,37C孵育2h或4C冰箱孵育过 夜,PBST洗涤4次,每次3min. B.2.4加酶标抗体 根据说明书用酶标抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度,加人到酶联板中,100L/孔,加 盖,37C孵育2h,PBsT洗涤4次,每次3min. B.2.5加底物 将底物pNPP加人到底物缓冲液中,终浓度为1mg/ml(现配现用),按每孔加人100AL,室温避光
GB/35271一2017 孵育30min 必要时每孔加人50L3mol/L氢氧化钠溶液终止反应 B.2.6读数 30min 后用酶标仪在405nm处读OD值 B.3结果判断 B.3.1对照孔的OD值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔),应该在质量控制范围内,即 缓冲液孔和阴性对照孔的OD值均<0.15,当阴性对照孔的OD值<0.05时,按0.05计算;阳性 对照OD值/阴性对照OD值>5~10;同一样品的重复性基本一致 B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果可判断如下 样品OD值/阴性对照OD值明显>2,判为阳性;样品OD值/阴性对照OD值在闵值附近 判为可疑样品,需重新进行试验,或用其他方法加以验证;样品OD值/阴性对照OD值明显<2,判 为阴性 B.3.3若满足不了B.3.1质量要求,则不能进行结果判断
GB/T35271一2017 C 附 录 规范性附录 RT-PCR检测方法 主要试剂 C.1 C.1.1Trizol反应液、三氯甲烧、异丙醇、70%乙醇 C.1.250×TAE缓冲液 Tris碱 242g 冰乙酸 57.1ml 乙二胺四乙酸(EDTA)(0.,5nmol/LpH8.0) 00mL 双蒸水定容到1L c.1.36×l.oading缓冲液 澳酚蓝 0.25% 二甲苯青FF 0.25% 蔗糖水溶液 40% 贮存于4C c.2引物序列 正向引物cDv-TPF;5'cTTccTAGcccAAGcAcAcA3',反向引物McDv-NTPR;5” AATGCAACcTcTcTTcGCCA-3' 参考序列登录号.NCBAY829112.1,U67839.1 C.3 试验步骤 C.3.1植物总RNA的提取 c.3.1.1取0.1g样品,加液氮研磨成粉末状,将研磨物迅速移人1.5mL离心管中,加人1mLTizol 反应液,颠倒混匀,2C8C,12000迟,离心10min. C3.1.2取上清液,15C一30C,放置5min;加人0.2ml三氯甲烧,用手剧烈震荡(勿涡旋振荡),约 15s 5 C30C,放置2min~3min;2C8C,12000g,离心15min C.3.1.3小心吸取约为600L的上层水相,勿扰动中间相和下层相 加500L异丙醇混合上清液 1530C,放置10 min 2C8C,l2000g,离心10min. C.3.1.4去除上清液,沉淀中加人1mL75%乙醇,洗涤;2C8C,7500g,离心5min C.3.1.5去除上清液,沉淀自然干燥后,将其溶于30MlL 50L无RNase的水中 注，RNA的提取也可使用相应市售RNA提取试剂盒提取 C.3.2RT-PCR c.3.2.1反转录(RT) 反转录反应体系见表C.1 10
GB/35271一2017 表c.1反转录反应体系 名称 加样量/ ol/1L 随机引物(10mol RNA 5×RT缓冲液 NTP(10tmmol/L) 0.5 RNA酶抑制剂 0,2 逆转录酶 0.5 DEPC-H. 0.8 反应条件为37C60 nmin,立即置于冰上 C.3.2.2PCR PCR反应体系见表C.2. 表C.2PCR反应体系 名称 储存液浓度 加样量/A 10×PCR缓冲液 10× 2.5 正向引物 10Mmol/L 0.5 反向引物 10Mmol/1 0,5 ;UL Taq酶 0,5 dNTP 0.6 10mmol/I cDNA 水(无DNase 18. 总体积 25 反应条件为:942min;然后94C30s,58C30s,72C40s,共35个循环;72C5min 注反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整 也可采用其他商业RTRCR试剂盒 C.3.3PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 灌制1.5%琼脂糖凝股板,室温凝胶30min,取5.CR产物与6×I.oading缓冲液混匀后点样 用DNAMarker作分子量标记,在1×TAE中以5V/cm的电压电泳30min 潦化乙锭溶液 o0.54g/mL.)染色10min,用凝胶成像仪照相 C.4结果判断 阴性对照和空白对照在604bp处未出现扩增条带,待测样品与阳性对照在604bp处出现扩增条 带,判定结果为阳性 阴性对照和空白对照在604bp处未出现扩增条带,阳性对照在604bp处出现扩增条带,且样品无 特异性扩增,判定结果为阴性 1
GB/T35271一2017 录 附 D 规范性附录 实时荧光RT-CR检测方法 D.1 试剂 核酸提取试剂同C.1.1 RT-PCR试剂可选用Tiangen或其他生物公司生产的一步法RT-PCR试剂盒" D.2引物探针 引物序列:MCDV-F:5'-CTGCTCCATAGGCGATGGTT-3 MCDV-R:5'-ACATACTcGCCCCAAAGGTG-3 探针序列:MCDV-P:5'-FAM-TGCTCATGCATTTTCGAGGTGGA-TAMRA-3' 引物探针参考序列NCB登录号:AY829112.1、U67839.1 D.3核酸提取 方法同c.3.1 D4实时荧光RT-PCR反应 实时荧光PCR反应体系见表D.1,每个样品及对照设2个平行处理 检测时以含MCDV的材料 作为阳性对照;以健康植物材料或玉米上的其他病毒材料作为阴性对照;以水代替RNA模板作为空白 对照 表D.1实时荧光RT-PCR反应体系 贮备液浓度 加样量/L 名称 终浓度 PCR缓冲液 10X 2.0 25mmol/L 2.5mmol/儿 2.0 MgCl dNTP 10mmol/L 0.25mnmol/I 0.5 MCDV-F 10mol/1 0.5mol/L MCDV-R 04mol/1 0.54mol/L RT-PCR酶混合液 25× .0 1) Tiangen公司生产的RT-PCR试剂是适合的市售产品的实例 给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并 不表示对这一产品的认可 12
GB/35271一2017 表D.1续 名称 财备液浓度 终浓度 加样量/Al 0.3 MCDV-P 104mol/1 0.154mol/I RNA模板 2.0 25.0 补水至 反应条件;48C30min,95C10min,(95C15s,60C30s)×40个循环 点击运行,进行PCR反应,保存文件,打开分析软件,仪器自动分析试验结果，给出ARn(荧光信号 增加值)与循环数之间关系的图像 D.5结果判定 在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值30并出现典型扩增曲线的条 件下: 待测样品的c值>40时,判定MCDV阴性; 待测样品的Ct值<35时,判定McDV阳性; 待测样品的3540时,判定MCDv 阴性;如果重新测试的c值<40,则判定McDv阳性 13
GB/T35271一2017 参 考文献 RE.Animmunofluorescencetestformaizechloroticdwarfvirus Phytopat [1Gingery 1tholo- 1978，68:1526-1529. gy al.Accumulationofaize RE， ChaouehHamadR，RedinbaughMG.Gingesy vector.Virole 2004，325:379-388 andleafhoper chloroticdwarfvirusproteinsinitsplanthost logy, R R Gin E，Anderson Redinba EffectofEnvironmentalconditionsand ingery )augh ceafhoppergenderonaiechloroticdwarfuir4stransmissionbygraminellanigrifrons， EcoEn tomol，2004，97(3):768-773. toticsofmaizedwarmosaicandmaizechlorotic louieR，KnokeJK，GordonDT.Epiphyt dlwarfuirusdiseasesinOMioPhytopatholo 1978，64:l1455-l459. ogy Involvementofmai这echloroticdwarfirusandOthera ordonDT，NaulLR.Eiologey gentsinstuntingdiseasesofZeamaysintheUnitedStates.Etiology,1976，67:27-36. [6 HuntR NaultR，GingeryRE Evidenceforinfectivityofnai这echloroticduarfui ru、andfor 1988，784: helpercomponentinitsleafhoppertransmission Phytopahology 499-504. [7]ScottGE，RosenkranzE.Typeofgeneactionintheresistancetomaixechoroticdwar "ir4sincornPhytobathology，1987，77(9):1293-1296. ChaouchR，RedinbaughMG，MarrakchiM,etal.GenomicsoftheSeverelsolateofmaize [8 chorotiedwwrfirws.PlanProteeSei,2004,40(4);l13-119. [91 JonesMW Redinbaugh AndersonRJ，etal.ldentificationofquantitativetraitloci ontrollingresistancetoMaizeChlorotiDwarfVirus.Theor Genel，2004，110:48-57. 10 ReddickBB，Habera LawMD.Nucleotidesequenceandtaxonomyofmnaizechlorot- icdwarfiruswithinthefamilySeqiriridae.JournalofGeneralVirology，1997，78:l165-1174 http://www.agweb.com/1l-crop-diseases-that-occur-in-hot-dry-weather [12] CropSeencesUniversityofIllinois PlantDhieaseDepartmemt of aat Reporton Urbana-Champaign [13]http;//www.forestryimmages.org/browse/detail.efm?immgnum=1524081 14

玉米褪绿矮缩病毒检疫鉴定方法GB/T35271-2017

玉米褪绿矮缩病毒是由玉米褪绿病毒、玉米花叶病毒和粗斑叶病毒复合感染引起的一种病毒性病害。该病害可导致玉米茎干变矮、叶片变窄、色素减退、穗粒减少，进而影响玉米的产量和品质。为了有效预防和控制该病害的传播，国家制定了玉米褪绿矮缩病毒检疫鉴定方法GB/T35271-2017。

该标准主要包括以下内容：

• 病毒分离、纯化和增殖方法；
• 血清学鉴定方法；
• 核酸鉴定方法；
• 生物学检测方法；
• 病毒检测方法的验证和评估。

其中，病毒分离、纯化和增殖方法采用组织接种法或者原植物接种法。在血清学鉴定方法中，采用ELISA、免疫印迹等技术进行检测；在核酸鉴定方法中，采用PCR、RT-PCR等技术进行检测。在生物学检测方法中，采用宿主植物、宿主茎液和宿主汁液等进行检测。

该标准的实施可为玉米褪绿矮缩病毒的检测、防控和治理提供科学依据，保障农业生产和出口贸易安全。

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2022/8/23 16:49:24 现行