国家标准 GB/T27621一2011 马鼻肺炎病毒PCR检测方法 ProtoeolofPCRforequinerhinopneumonitisvirus 2011-12-30发布 2012-04-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27621一2011 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由农业部提出本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口本标准起草单位;新疆农业大学本标雅主要起草人;再多良,单文鲁、马伟、王传锋,张伟
GB/T27621一2011 马鼻肺炎病毒PCR检测方法范围本标准规定了马鼻肺炎病毒的CR检测方法本标准适用于马匹的流通和进出境检疫实施马鼻肺炎的现场检疫和后续监管工作一步法PCR 检测技术适用于实验室细胞毒样品检测;巢式PCR检测技术适用于临床疑似样品及细胞毒样品检测规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法缩略语下列缩略语适用于本文件 EHIV:eguinerhinopneumonitis,马传染性鼻肺炎 RNA:ribonucleicacid,核糖核酸 CPE:cytopathiceffect,细胞病变 EB:ethidiumbromide,澳化乙锭 A:ethylenediaminetetraaceticaceid,乙二胺四乙酸 SDSsodiumdodeeylsulfate,十二炕基碱酸钠 BHIK-21;babyhamsterkidneycell,仓鼠幼肾细胞 PBS:phosphatebufersodium,磷酸盐缓冲液试剂和材料(试剂不经注明,均为分析纯 41水.符合GB/T6882中一级水的规格 4.2RNA酶A 43 酚-三氧甲烧 4.42%琼脂糖凝胶:见A.1 4.5澳化乙锭(I04g/AL)见A.2. 4.6DNA聚合酶(5U/L) 50×TAE电泳缓冲液(pH8.5):见A.3 4.810×PCRBuffer(plusMg+. 4.92.5mmol/mLdNTP 4.10蛋白酶K(20mg/mL. 4.11BHK-21细胞 4.12含2%犊牛血清的MEM维持液
GB/T27621一2011 4.130.3mol/L乙酸钠 4.140.01mol/L.PBS缓冲液(pH7.2);见A.4 4.15SDs 4.1610×TE缓冲液(pH8.0);见A.5 4.17无水乙醉 4.1870%乙醉 4.19Tris饱和盼(pH8.0). 4.20分子质量标准DL.2000. 器材和设备 5.1低温冷冻高速离心机 5.2倒置显微镜 5.3cO，恒温培养箱 5.4普通冰箱和超低温冰箱 5.5 组织研磨器 5.61.5ml离心管 5.7PCR扩增仪 5.8水平电泳槽 5.9微量移液器及吸头 5.10紫外照射仪或凝胶成像仪 EHV的分离 6.1采样取马流产胎儿病料的肺、脾或淋巴组织,疑似病驹呼吸系统的鼻咽拭子3根 6.2样品处理组织样品2g与2mL0.01mol/LPBS缓冲液置于组织研磨器中研磨匀浆,反复冻融3次;鼻咽拭子3根在2mL0.01mol/L PBS缓冲液中洗脱,反复冻融3次,离心取上清 6.3病毒增殖将毒种接种到单层的BHHIK21细胞上,37C吸附1h,加适量含2%的犊牛血清的MEM维持液 CO 恒温培养箱37C静置培养,利用倒置显微镜逐日观察CPE,48h后当CPE达85%以上时收毒,冻存于一70C冰箱备用 EH的CR检测样品处理组织样品2g与2mL.0.01mol/LPs缓冲液研磨匀浆,反复冻融3次;鼻咽拭子3根在2mL 0.01mol/LPBS缓冲液中洗脱,反复冻融3次,离心取上清
GB/T27621一2011 7.2核酸抽提取适当病料或细胞毒0.5ml,加人RNA酶A至终浓度为1004(/'ml.37C作用30min;加人 20mg/ml蛋白酶K至终浓度为100g/ml,SDS终浓度为0.5% 在56C水浴内反应60min至反应 n,12000 物清亮,期间不断轻摇溶液加等体积TE饱和酚,轻摇20 r/min离心7nmin;取水相加等 min，体积酚-三氯甲烧(1;1),轻摇20 min,12000r/min离心7min;取水相加等体积三氯甲婉,轻摇 15min,12000r/min离心7min;收集水相在上述水相中加人2.5倍体积预冷的无水乙醇和终浓度为0.3mol/L.乙酸钠，-20C放置20min 12000r/min 离心10min,使核酸沉淀,弃去上清液立刻加人70%乙醇,将沉淀漂洗2次,以去除残留的盐类倾去乙脖,倒置在滤纸上干燥,然后加0.5 tml TE(pH8.0),于4C冰箱内过夜溶解DNA 37C干燥20min或抽真空干燥;最后加10AL水溶解后,作为PCR模板 7.3以引物F、引物F1e和引物F4e(参见B.1)为条件的体系含1.5mmolL.MAacL的10xPcRBhufer5lL.2.了mmalL的d小NTP4L.;引物下.引物Fl 刑引物Ft(参见B.1)各1AL;模板DNAlL;DNA聚合酶0.5L;加双燕水至50L.,然后将上述成分混合均匀在PCR扩增仪上进行扩增,PCR反应条件为94丫预变性4min,30次如下循环;94 1min,56C1min,721min,最后72延伸7min 取10AL.CR扩增产物,加2L6×加样缓冲液,在含有澳化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳 30min,在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置,以DNA2000Marker作分子质量标准比 p的DNVA片段,EV-4会出现468bp的DNA片段空白对照在311bp和较:;EHV-1会出现311 468bp没有核酸带(参见附录C) 7.4巢式PCR扩增方法以引物Fz和引物Fc[参见B.2a)]为条件的体系如下含1.5mmol/LMgC!,的10×PCRBufer5AL;2.5mmol/L的dNTP4Al;引物Fz和引物 F[参见B.2a)]各1nl;模板DNA！L;2.5UDNA聚合酶0.5l;加双燕水至50l,混合均勺,瞬时离心后,放人PCR仪中 PCR反应程序为94C预变性4min,25次循环(94"C变性1nmin,51C退火1min.72C延伸1min,最后72C延伸7min),取出PCR反应产物; 取10nlPCR扩增产物,加2AL6×加样缓冲液,在含有潦化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳 30min.在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置以DNA2000Marker作分子质量标准比较(标准EHHV-1和EHV-4会出现747bp的DNA片段,空白对照在747bp没有 DNA片段,参见图D.1) 7.4.2巢式PCR第二次反应;待扩增病毒DNA为100倍稀释的一次扩增PCR产物作为二次扩增模板以引物F1和引物Flc[参见B.2b]为条件的体系如下含1.5mmol/1MgClL的10×PCRBufer5L;2.5mmol/1的dNTP4L;引物F1和引物 F1c[参见B.2b]各1L;模板DNA1AL;2.5UDNA聚合酶0.5L;加双蒸水至50L，然后,将以上各成分混合均匀放人PCR仪中 PCR反应条件为94C预变性4min,25次循环 94C变性1min,45C退火1min,72C延伸1min,最后72C延伸7min); -取10AlL PCR扩增产物,加2AlL.6×加样缓冲液,在含有嗅化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳 30 min,在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置,以DNA2000Marker作分子质量标准比较(标准EHV-1出现404bp的DNA片段,空白对照在404p没有DNA片段,参见图D.2)
GB/T27621一2011 7.4.3以引物F4和引物F4c[参见B.2c)]为条件的体系如下: 含1.5mmol/LMgCl的10×PCRBuffer5AL;2.5mmol/L的dNTP4AL;引物F4和引物 F4c[参见B.2c)]各1AL;模板DNA1AL;2.5UDNA聚合酶0.5AL;加双蒸水至50Al,然后将以上各成分混合均匀放人PCR仪中 PCR反应程序为94预变性4 ,25次循环 min， 1,56C退火1 94C变性1min min， n,72C延伸1min,最后72C延伸7min); 取10ALPCR扩增产物,加2AL.6×加样缓冲液,在含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳 30min， 1,在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置,以DNA2000Marker作分子质量标准比较(标准EHIV-1出现334bp的DNA片段,空白对照在334bp没有DNA片段,参见图D.3). 7.4.4以引物F和引物Flc、F4c[参见B.2d]为条件的体系如下含1.5mmol/LMg(Cl的10XPCRBuffer5AL;2.5mmol/L的dNTP4Al;引物F,引物Fle 和引物FIc[参见B.2d]各1AL;模板DNA1L;2.5UDNVA聚合酶0.5L;加双蒸水至反应程序为94C预变性4min,25次循 50L,然后将以上各成分混合均匀放人PCR仪中环(94变性1min,50退火1min,72C延伸1min,最后72延伸7min); -取10ALPcR扩增产物,加2L6X加样缓冲液,在舍有澳化乙绽的2%琼脂糖凝胶上电冰 30min,在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置,以DNA2000Marker作分子质量标准比较(在311bp位置上有核酸带,判定为EHv-1型阳性样品;在468bp位置上有核酸带,判定为EHIV-4型阳性样品;在311bp和468bp位置上都有核酸带,可判为EHv-1和 EHV-！型混合感染,参见图D.4 7.5设立对照 7.5.1在7.1中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、阴性样品对照,空白对照 7.5.2取含有已知EHV的病毒标准株的组织悬液作为阳性对照 7.5.3采用未接种病毒的正常BHK-21细胞抽提核酸作为阴性对照 7.5.4取等体积的水代替模板作为空白对照 7.6琼脂糖电泳用TAE电泳缓冲液配制2%的琼脂糖(含14g/mL EB)平板将平板放人水平电泳槽,使电泳缓冲液刚好淹没胶面将6MlLPCR扩增产物和2AL澳酚蓝指示剂溶液混匀后加人孔内在电泳时使用核酸分子质量标准参照物作对照 5V/en电泳约0.5h,当澳酚兰到达琼脂糖凝胶的底部时停止 7.7结果判定 7.7.1一步法PCR扩增结果判定如下(以DNA2000Marker作分子质量标准比较): EHV-1会出现311bp的DNA片段,EHV-4会出现468bp的DNA片段空白对照在 a 311bp和468bp没有核酸带对照成立才能进行判定 b 在311bp位置上有核酸带,判定为EHV-1型阳性样品;若在311bp位置上无核酸带,判定为 EHV-1型阴性样品在468bp位置上有核酸带,判定为EHV-4型阳性样品;若在468bp位置上无核酸带,判定为EHV-4型阴性样品 7.7.2巢式PCR结果判定如下(以DNA2000Marker作分子质量标准比较) a 一次PCR扩增结果;标准EHV-1/4会出现747bp的DNA片段空白对照在747bp没有 DNNA片段二次PCR扩增结果;标准EHV-1出现311bp或404bp的DNA片段空白对照在311bp或404bp没有DNA片段标准EHV-4出现334bp或468bp的DNA片段空白对照在334bp或468bp没有DNA片段两次结果对照成立才能进行判定
GB/T27621一2011 b 若一次扩增后在747bp位置上有核酸带,判定为阳性样品;无核酸带或条带的大小不在 747p位置上,判为阴性样品若二次扩增后在311bp或404p位置上有核酸带,判为 EHV-1型阳性样品;无核酸带或条带的大小不在311bp或404bp位置上,判定为非EHV-1 型阳性样品若二次扩增后在334bp或468bp位置上有核酸带,判为EHV-4型阳性样品无核酸带或条带大小不在334bp或468bp位置上,判为非EHV-4型阳性样品若二次扩增后在311bp和468bp位置上有两条核酸带,可判为EHV-1/4型混合感染
GB/T27621?2011 ?A 淶?? ? A.12%? ? 2g 1TAE?? 100ml ????,50C?,???(EB)?5AL,?,??,?? ,á A.2??EB)?(10mg/mL ?? 1g 100mL ?? A.350TAE??(pH8.5 242g ?(Tris) 37.2g EDTA2HO 57.1 ml ??1000ml,????? A.40.01mol/LPBs?(pH7.2 NaHPO .42g 0.27 KHPO g NaCIl 8g KCIl 0.2g ??1000mL,? A.510TE? mol/Ltris-HClBuffer 100ml 20mL 0.5mol/LEDTA(pH8.0) ??1000ml,?
GB/T27621一2011 附录 B 资料性附录引物序列及其特性 B.1一步法PCR引物引物合成参照GeneBank中的EHV-1和EHV-4的部分gB基因序列,用Primerprenmier5.0软件设计特异性引物,其浓度为10pmol/mL,序列如下 F: 5'GATGCCATGGAGGCACTACAC3’ EHV-1和EHV-4共有 Fle:5'cCTcG.ACTTTcTTcTCTcGGTCC3” EHV-1特有 F4c:5'TTGACACACAGTCGGTGAGT3'’ EHV-4特有 B.2巢氏PCR引物引物合成参照GeneBank中的EHV-1和EHV-4的部分gB基因序列,用Primerpremier5.0软件设计特异性引物,其浓度为10pmol/mL序列如下巢式PCR第一次反应的引物 Fz5'GGAAAGGATACAGCCATACGTC3 EHV-1和EHV-4共有 Fce:5'GTATATcGAGTCTATGG;CTTC3 EHV-1和EHV-4共有巢式PCR第二次反应扩增EHV-1的引物 b) Fl:5'GAGGTGGAGCTTGATTTGTG3 EHIV-1特有 Flc EHV-1特有巢式PCR第二次反应扩增EHV-4的引物 F4:5'TCGGTCAGCTGCTCAGTTAG3” EHV-4特有 F4c: 5'TTGACACACAGTCGGTGAGT3” EHIV-4特有巢式PCR第二次反应同时扩增EHV-1和EHIV-4的引物 d EHV-1和EHV-4共有 F 5'GATGCCATGGAGGCACTACAC3’ Fle:5'CTCGACT'T'TCTTCTCTCGGTCC3’ EHIV-1特有 EHV-4特有 F4c;5'T'TGACACACAGTCGGTGAGT3”
GB/T27621一2011 附录 c 资料性附录一步法PCR反应结果 468bn 311bp M -DNAMarker(DL2000); -标准EHIV-1和标准EHV-4混合DNA 阴性对照标准EHV-4DNA; 标准EHV-1DNA 图C1 以F/F1c-F4c为引物的一步法PCR反应结果
GB/T27621一2011 附录D 资料性附录巢式法CR反应结果 747bp M -DNAMarker(DL.2o) 标准EHIV-1DNA:; 标准EHV-4DNA; 阴性对照 1 图D. 以Fz/Fe为引物的第一次PCR反应结果 404bp M -DNAMarker(DL2000) 标准EHIV-1DNA:; 标准EHV-4DNA; 阴性对照图D.2以F1/F1e为引物的套式CR反应结果
GB/T27621一2011 334bp M -DNAMarker(DL2000); 标准EHIV-4DNA:; 2 标准EHV-1DNA:; 阴性对照图D.3以F4/F4e为引物的套式CR反应结果 468bp 311bp M -DNAMarker(DL2000) -阴性对照 -标准EHV-1和标准EHV-4混合DNA 标准EHv-4DNA; 标准EHV-1DNA 图D.4以F/F1c-F4e为引物的套式PCR反应结果 10o

马鼻肺炎病毒PCR检测方法GB/T27621-2011

PCR（聚合酶链反应）技术是一种高灵敏度、高特异性的核酸检测技术，已被广泛用于各种疾病的诊断和研究中。其中，在马匹呼吸道疾病防控领域，PCR技术也有着重要的应用。

马鼻肺炎病毒（Equine influenza virus，EIV）是一种由A型流感病毒引起的急性呼吸道传染病，主要影响马匹的健康。为了及早发现、控制和治疗该病，GB/T27621-2011标准规定了马鼻肺炎病毒PCR检测方法。

1. 样品处理

样品来源包括马鼻腔或咽喉拭子、唾液、痰液、气管分泌物等，采样时需注意避免污染。处理方法包括提取RNA或DNA，并通过比色法或荧光检测确定其浓度和纯度。

2. PCR反应

PCR反应体系包括模板DNA/RNA、引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs等，其中引物的选择对于PCR反应的特异性和灵敏度至关重要。在GB/T27621-2011标准中，建议使用HA基因的引物进行PCR反应。

3. PCR产物检测

PCR产物可以通过琼脂糖凝胶电泳、比色法、荧光检测等方法进行检测。在GB/T27621-2011标准中，建议使用荧光定量PCR技术进行检测，该技术可以实现快速、准确地检测马鼻肺炎病毒。

总之，马鼻肺炎病毒PCR检测方法GB/T27621-2011是一种可靠、有效的病毒检测方法，对于马匹呼吸道疾病的防控具有重要意义。