柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法

柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法

国家标准 GB/T28062一2011 柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法 DeteetionofCandidatusLiberibacterasiatiesusingthe real-timefluorescentPCR 2011-12-30发布 2012-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T28062一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位;重庆大学,农业部农业技术推广服务中心、北京出人境检验检 疫局 本标准主要起草人;股幼平、王中康、王玉玺、高文娜、夏玉先、曹月青、彭国雄,李正国
GB/T28062一2011 柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法 范围 本标准规定了柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌(CandidatusLiberibacterasiaticus)实时荧光PCR检测的 样品制备、检测操作方法及结果判定标准 本标准适用于对芸香科和非芸香科植物罹病植株和传播媒介柑桔木虱中黄龙病亚洲韧皮杆菌的检 测和病害鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB5040柑桔苗木产地检疫规程 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 柑桔黄龙病itrusHuanglongbing -种由韧皮杆菌引起的植物检疫性病害 主要侵染柑桔属、金柑属和积属等柑桔类植株重 由带 菌种苗远距离传播,田间主要由柑桔木虱取食传播 典型受害植株叶片斑驳不均匀黄化,枝梢黄化,果 实畸形,种子败育,严重时可引起植株死亡 实时荧光CRreanltimetuorescentCR 实时荧光聚合酶链式反应，一种在体外扩增微量的特殊DNA片段的方法,在扩增过程中由于荧光 物质的释放或荧光物质与扩增产物结合并被实时检测而能够快速,灵敏地检出模板DNA的存在 3.3 扩增引物primer 人工合成的寡核苷酸序列,其序列与待扩增的目标DNA序列中的一段相同,用于引导DNA体外 扩增 3.4 扩增模板templet DNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列 3.5 Ct值eyelethresholdalue 实时荧光PCR反应中每个反应管内荧光信号达到设定值时所经历的循环数 6 ? midDNA 亚洲韧皮杆菌重组质粒DNA recombinantplasm 利用特异性引物扩增柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌基因组模板,获得的亚洲韧皮杆菌特异性DNA扩
GB/28062一2011 增序列,经构建重组质粒、转人大肠杆菌JM109菌株中繁殖培养后,重新提取获得的质粒DNA 用于 作为柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌实时荧光PCR检测的阳性对照 柑桔黄龙病菌基本信息 学名;亚洲韧皮杆菌CandidatusLiberibacterasiaticus 病害名称;柑桔黄龙病,常用英文名:CitrusHuanglongbing 分类地位:a-阮细菌亚纲、根瘤细菌目(Rhizobiales),根瘤细菌科(Rhizobiaceae),韧皮杆菌属 Liberibacter的G细菌 是一种难培养细菌 引起柑桔黄龙病的韧皮杆菌根据其核糖体基因序列的差异可以分为3种,即分布于非洲的柑桔黄 龙病非洲韧皮杆菌CandidausLiberibaeterafricanus，分布于南美洲的柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌Can didatusLiberibacteramericanus和分布于亚洲及北美的柑枯黄龙病亚洲韧皮杆菌CandidatusLiberi bacterasiaticusJagoueixetal 柑桔黄龙病菌其他信息参见附录A 本标准规定了对亚洲韧皮杆菌的检疫鉴定方法 对来自于非洲的柑桔材料的检疫检验,可参见附 录B检测柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌;对来自美洲的柑桔材料,除利用本标准检测柑桔黄龙病亚洲韧皮 杆菌外,可参见附录C检测柑桔黄龙病美洲韧皮杆黄 方法原理 本标准采用的实时荧光PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法 其原理是,利用 病菌特有DNA序列设计引物,在PCR扩增时加人荧光染料,荧光染料与扩增形成的产物-DNA双链结 合而发出荧光被检测器实时检测(荧光染料法),或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双 标记探针,探针5'端和3'端分别标记荧光素报告基团和淬灭基团,如果反应体系中存在待测目标DNA 模板,引物和探针则与模板上的序列配对而特异性结合,当PCR扩增延伸到探针结合部位时,Taqg DNA聚合酶将探针水解成单核甘酸,使标记在探针上的报告基团游离出来并发出荧光信号被检测器实 时检测(荧光探针法) 由于初始模板量的不同,反应管内的荧光物质达到设定的可检测阂值时所经历 的Ct值不同,因此C值可以用于判定检测样品的初始菌量 实验室设置 参照GB/T19495.2 实验室应至少分为三个相对独立的工作区域:样本制备区、反应试剂配制区 和检测区;每个工作区域应有明确标记,避免不同工作区域内的设备、物品混用 主要仪器设备和试剂 7.1仪器设备 7.1.1实时荧光PCR仪 7.1.2高速台式离心机 7.1.3生物安全柜或超净工作台 7.1.4冰箱冷藏室4C和冷冻室一20C). 7.1.5涡旋混匀仪 7.1.6紫外灭菌灯
GB/T28062一2011 7.1.7微量可调移液器(0.5L10AL、10L100AL、,100L1000AL) 7.1.8带滤芯Tip头 7.1.9PCR反应管(0.2ml 八联管) 7.1.10微滤柱 高压灭菌锅 7.1.11 7.2试剂 7.2.1次氯酸钠NaCIO.. 7.2.2 二烧基硫酸钠(sDS) 十 二 7.2.3蛋白酶K(ProenaseK) 7.2.4三羚甲基级基甲娘(Tis 7.2.5 乙 二胺四乙酸(EDTA 7.2.6盐酸呱(GuanidingeHCI 7.2.7无水乙醇(ethanol) 7.2.8实时荧光PCR混合试剂(RealtimePCRMasterMix) 取样及样品处理 取样用具 88 .1.1样品袋;牛皮纸袋或信封(一次性使用. 8 1.2枝剪 88 1. .3 剪刀,锻子,打孔器 8.1.4研钵 8.1.5塑料离心管(1.5mL) 8.1.2~8.1.5的取(制)样用工具应经121C士2C,l5min高压蒸汽灭菌 田间采样每个样品采 集后或实验室处理每个不同样品后,工具应用70%酒精棉球擦拭2次以上,以避免样品间相互污染 8.2取样方法 8.2.1实地取样 产地检疫田间实地取样参照GB5040. 8.2.2叶片样品 疑似病树按树冠东南西北四方采集,每点取中下部成熟叶片各5片,每棵树共采集叶片20张 种苗抽取显现疑似症状植株或随机抽取植株(无症材料)10株,每株取中下部成熟叶片5片,共 50片 接穗等繁殖材料按规程规定的比例抽取样品 黄龙病病害症状及疑似症状详参见附录D. 8.2.3果实样品 幼果期采样,切取果柄和果蒂,每样品采集4份;商品鲜果每批果实随机抽取10个果实,切取果柄 和果蒂
GB/28062一2011 8.2.4 传病媒介柑桔木虱 在柑桔新梢抽发期,每株树采集1头10头成虫,每园采集50头以上;口岸或调运种苗、接穗等材 料中发现的木虱则直接收集 用75%乙醇浸泡固定30min 放人1.5ml离心管封装 样品采集后立即装人样品袋(木虱用75%乙醇杀死固定后装人微量离心管),并按照要求填写采样 记录,记载样品来源、样品品种、目测症状,采样人,采样地,采样时间等,及时送指定检测实验室 8.3样品贮运与保存 采集的植株样品按上面要求用样品袋分装,乙醇固定的柑桔木虱控干乙醇后用塑料离心管分装,与 采集记录一并寄送指定实验室检测 检测后余下的植物材料可置于4C条件下保存7d,以备复测的需 要 不需保存的样品应立即进行无害化灭菌处理以防止病害扩散 样品DA制备操作(在检测实验室样品制备区进行) 样品DNA制备在检测实验室样品制备区进行 制备好的DNA样本在4C条件下保存应不超过 7d,在一20C冻存不超过30d,避免反复冻融 样品DNA制备的具体操作过程见附录E PCR扩增 PCR扩增反应体系为25L 准备PCR扩增反应管,分别加人反应液23L,最后加人制备的待测 样品DNA2Al 每个样品设置3次重复 每次PCR检测应设立相应的阳性对照,阴性对照和空白 对照 扩增过程中,设置在每次循环的延伸阶段采集荧光 荧光染料法检测须在扩增结束后立即进行熔解曲线分析,以验证扩增的特异性 熔解曲线的反应 程序为;95C,lmin;55C,1nmin;然后从55C开始每升高0.5C保持10s,连续升高80次(到95" " 为止 检测结束后,根据采集的荧光曲线和Ct值判定结果 PCR扩增的准备及扩增具体操作过程见附录F(使用不同PCR仪具体扩增程序参数可能稍有 调整) 推荐使用柑桔黄龙病菌亚酬种实时荧光R检测试剂盒 试剂盒组成,功能及使用注意事项参见 附录G 1 结果判定与表述 10.1结果分析条件设定 直接读取检测结果 检测阂值设定应根据仪器噪声情况进行调整,以阂值线刚好超过正常阴性样 品扩增曲线的最高点为准 10.2质控标准 10.2.1阴性对照及空白对照应无Ct值并且无扩增曲线 否则,此次检测视为无效 10.2.2阳性对照的Ct值应<28.0,并出现典型的扩增曲线 否则,此次检测视为无效
GB/T28062一2011 10.3结果判定 10.3.1阴性反应 测试样品检测Ct值>40或者无Ct值并且无扩增曲线，且阴性对照、阳性对照,空白对照结果正 常,判定该样品为阴性,表示该样品中不带可检出的柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌 10.3.2阳性反应 荧光探针法检测时,样品Ct值<35,出现典型的扩增曲线,且阴性对照、阳性对照、空白对照结果正 常,判定该样品为阳性,表示该样品中存在柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌 荧光染料法检测时,Ct值<35,出现典型的扩增曲线,且阴性对照,阳性对照、空白对照结果正常 熔解曲线为单峰,并且熔解曲线与预期目标扩增产物熔解曲线一致,或熔解曲线出现双峰,其中一个峰 为引物二聚体,另一个峰的熔解曲线与预期目标产物熔解曲线一致,则判定该样品为阳性,表示该样品 中存在柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌 10.3.3特殊情况 实时荧光PCR检测样品C值大于35的样品但小于40,建议用同一样品模板量加倍(相应减少加 人灭菌超纯水量)进行实时荧光PCR复测 复测的结果按上述判定标准判定是否带柑桔黄龙病菌;如 果Ct值仍大于35,判定为阴性
GB/28062一2011 附 录A 资料性附录 柑桔黄龙病菌其他信息 A.1寄主及分布 主要分布在亚洲地区的印度、日本、菲律宾等东南亚国家以及的部分地区 寄主为柑桔类植 物,柑桔属、金柑属和积属植物受害严重 也可低度浸染芸香科的九里香,黄皮,特殊情况下也可侵染长 春花等非芸香科植物 A.2传播方式 带菌种苗、接穗及其上附着的传播媒介昆虫柑桔木虱(Diaphorina.citriKuwayamd)是远距离传播 的主要途径,田间则主要由柑桔木虱取食传播以及嫁接传播
GB/T28062一2011 附 录 B 资料性附录 柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌常规CR检测(Hoequellet,1999 B.1采样及样品制备 同柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌PCR检测 B.2CR扩增 B.2.1引物名称及序列 LafA2:5’-TATAAAGGTTGACCTTTcCGAGTTT-3” LafJ5:5'-ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA-3” B.2.2PCR反应体系 PCR反应体积为每管25AlL 25AlL的反应体系中含有终浓度为1×PCR缓冲液、l4mol/儿引物对 LafA2/LafJ5(序列见B.2.1)以及适量模板进行PCR扩增 预期扩增片段大小为669bp B.2.3CR反应程序 预变性94/5min;然后92C变性20s,62C退火20s,72笔延伸45s共35个循环;72C延伸 7min， ,4C保温 PCR扩增结束后,以2%的琼脂糖凝胶电泳,然后通过紫外成像系统成像 保存成像 图片作为结果判定依据 B.3结果判定与描述 B.3.1质控标准 扩增结果经电泳在明性对照和空白对照汰道无扩增条带,用性对照沫道有669p大小的预期片 段,结果视为有效 否则检测无效,应重新进行检测 B.3.2阴性反应 在电泳图片中样品泳道不出现669bp大小的预期扩增片段,阴性对照、阳性对照和空白对照正常 判定为阴性,表示样品中无可检出的柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌 B.3.3阳性反应 在电泳图片中样品泳道有669bp大小的预期扩增片段,阴性对照、阳性对照和空白对照正常,判定 为阳性,表示样品中存在柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌
GB/28062一2011 附 录 c 资料性附录 柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌实时荧光CR检测 c.1采样及样品制备 同柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌实时荧光PCR检测 C.2PCR扩增 C.2.1引物和探针依据美洲韧皮杆菌16SrRNA基因特异序列设计的引物对及探针 c.2.1.1引物名称及序列 HLBL.amF;5'-GAGCGAGTACGCAAGTACTAG3' HLBL.amR:5'-GCGTTATcCCGTAGAAAAAGGTAG-3’ C.2.1.2探针名称及序列 HLBLamP:5'FAM/AGACGGGTGAGTAACGCG/BHQ-3’ c.2.2PCR反应体系 PCR反应体积为每管25L 25L的反应体系中含有终浓度为1×PCRMasterMix0.6Amol/L 引物对HLBLamF/HLBLamR,探针HLBLamP0.3Amol/L以及适量模板 C.2.3PCR反应程序 预变性95C/20s;然后95C变性1s,58C退火40s,共40个循环,仪器设置在每个循环的退火延 伸阶段自动采集荧光 验证检测结束后,根据采集的荧光曲线和Ct值判定结果 C.3结果判定 C.3.1结果分析条件设定 直接读取检测结果 阂值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以闽值线刚好超过正常阴性样品 扩增曲线的最高点为准 C.3.2质控标准 C.3.2.1阴性对照和空白对照无C值并且无扩增曲线 检测结果有效,否则此次实验视为无效 C.3.2.2阳性对照的Ct值<28,并出现典型的扩增曲线 否则,此次实验视为无效 c.3.3结果判定及描述 c.3.3.1阴性反应 样品无Ct值并且无扩增曲线,且阳性对照,阴性对照和空白对照结果正常,判定为阴性,表示样品 中无可检出的柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌(CandidalusLiberibacteramericeanus,Lam)
GB/T28062一2011 C.3.3.2阳性反应 Ct值<35,并出现典型的扩增曲线,且阳性对照、阴性对照和空白对照结果正常,判定为阳性,表示 样品中存在柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌(CandidatusLiberibacteramerieanus,L.am). C.3.3.3其他情况 若实时荧光PCR检测的Ct值大于35,建议同一样品加大样品量(加倍)重新进行荧光PCR 复测 的结果按上述标雅判定若ct值仍大于35,判定为阴性
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GB/T28062一2011 附 录 E 规范性附录 样品处理试剂配制及样品NA提取 E.1样品处理试剂配制 除非特殊说明,本标准所有样品制备试剂均用无菌容器分装,常温保存备用 E.1.1TES缓冲液(pH8.0):10mmol/LTris-CI,1mmol/L EDTA,1%SDs,121C高压灭菌 20min. E.1.2TE缓冲液(pH8.0):l0mmol/LTris.CIl,lmmol/LEDTA,121C高压灭菌20min E.1.3蛋白质变性剂:7mol/LGuanidingeHCl(盐酸肛) E.1.410mg/ml蛋白酶K,-20C冰箱保存 E.2样品NA提取 E.2.1工作台及操作者消毒灭菌;样品处理在超净工作台或生物安全柜中进行;工作台和操作者双手 应消毒灭菌 E.2.2待测柑桔组织样品或柑桔木虱DNA制备 E.2.2.1将柑桔叶片或果实用清水洗净,吸水纸擦干,撕取叶片中脉或果柄,果蒂,放于研钵中,加人 液氮研成粉末,或直接用剪刀剪碎(每一样品处理换干净研钵,剪刀用后以医用酒精擦拭并用火焰灼烧 防止交叉污染),取约200mg碎屑装人1.5ml离心管中;或取柑桔木虱5头,装人1.5ml离心管中, 用Tip头尖捣碎 E.2.2.2离心管中加人800LTES缓冲液65C水浴中预热10min和10AL的蛋白酶K液(104g/l). 混合均匀后置于65C水浴1h,其间振荡2次 E.2.2.3吸取上清液转人1.5ml离心管,按照1:2的比例加人蛋白质变性剂,混合均匀后,在室温 下放置10min E.2.2.410000！离心10min后,吸取上清液加人微滤柱中,l0000g离心lmin,弃滤过液 E.2.2.5向微滤柱中加人75%乙醉750AL,l0000尽离心洗涤1min,弃滤过液 如微滤柱滤膜上有 黄褐色沉淀,应再加75%乙醇重复洗涤直到洗去黄褐色沉淀 E.2.2.610000片离心Imin以除去残余乙醇 E.2.2.7向柱中加人50LTE缓冲液,10000g离心1min,收集洗脱液约40AL即为后续PCR步骤 中的待测样品模板 E.2.3阳性对照;按照上述方法提取确诊的柑枯黄龙病典型斑驳叶片中脉DNA或以浓度为 0.44g/AL的病前特异DNA序列无害化重组质粒DNA作为阳性对照(推荐》 E.2.4阴性对照:按照上述方法提取健康的柑桔成熟叶片中脉DNA作为阴性对照 13
GB/28062一2011 附 录 规范性附录 检测试剂配制及实时荧光CR检测 扩增试剂配制在反应试剂配制区进行 F.1 F.1.1用无菌超纯水配制25Amol/1亚洲韧皮杆菌特异性引物对cQUI.asF03/CQUL.asR03母液 用于荧光染料法,引物序列为5'-CAAGGAAAGAGCGTAGAA-3’/5'-CcTCAAGATcGGGTA AAG-3',扩增柑桔黄龙病菌亚洲种rJ/rplL特异基因序列片段为382bp). F.1.2以无菌超纯水配制25Amol Dl/L亚洲韧皮杆菌特异性引物对cQULasF04/CQULasFO4母液 用于荧光探针法,序列为5'-TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA-3’/5’-CCAAcGAAAAGATCA 3',扩增柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌rpJ/rpL特异基因靶序列片段为87bp). GATATTCCTCTA- F.1.3以无菌超纯水配制25umol/儿荧光标记探针cQUL.asP1母液(序列为5’-ATcGTcTcG;TcA AGATTGcTATccGTGATAcTAG3'). 在反应试剂配制区进行 F.2加样 r.2.1方法1试剂盒方法(推荐方法 从固相化试剂盒中取出0.2mLPCR固相化试剂检测管,管中分别加人23ML样品恢复液,再在不 同管中分别加人2Al待测样品DNA液、阳性对照、阴性对照,空白对照(灭菌超纯水),盖紧管盖,转移 至PCR反应区 F.2.2方法2自配试剂方法 荧光染料法(反应体系为25L F.2.2.1 F.2.2.1.1加人引物对cQUIasF03/cQULasR03母液到实时荧光PCRMasterMix中,加人适量 灭菌超纯水,使反应液中引物终浓度为各0.3umol/L,1×PCRMasterMix,振荡混匀 F.2.2.1.2取0.2mLPCR反应管,编号后每管中加人23l上步所配反应液 F.2.2.1.3反应管中分别加人待测样品DNA液2L/每管;以新鲜制备的阴性对照、阳性对照和空白 对照2Al/每管代替待测样品设置对照,盖紧试管盖,3000瞬时离心,以混匀并去除气泡 F.2.2.1.4转移至PCR检测区 F.2.2.2荧光探针法(反应体系为25AlL) F.2.2.2.1在避光条件下加人引物母液cQUL.asF04/cQUL.asR04和荧光标记探针cQULasPl母 液到实时荧光P(CRMasterMix中,加人适量灭菌超纯水,使反应液中引物对终浓度为各0.3 3pmol/几 探针浓度为0.34mol/I,1×PCRMaste r\Mix.振荡棍匀 取0.2ml.PCR反应管,编号后每管中加人23L上步所配反应液 r.2.2.2.3分别加人待测样品DNA液2L/每管;以新鲜制备的阴性对照、阳性对照和空白对照(灭 菌超纯水)2L/每管代替待测模板设置对照,盖紧试管盖,3000g瞬时离心,以混匀并去除气泡 F.2.2.2.4转移至PCR检测区 F.3实时荧光CR检测(在检测区进行 设置好各反应管在实时荧光PCR仪上的孔位并做好标记记录,按照预设孔位将各检测样品及对照 14
GB/T28062一2011 放人荧光PCR仪内进行PCR扩增 F.3.1荧光染料法PCR扩增 F.3.1.1扩增程序 在iCyclerT(Bio-Rad,USA)实时荧光PCR仪上进行的扩增程序为(其他型号PCR仪扩增程序参 数可能稍有变化): 94笔预变性5min; -95C变性5s,然后59C退火15s,72C延伸45s,共40个循环;设置在每个循环的延伸阶段 自动采集荧光; 末次延伸72C,7min F.3.1.2熔解曲线分析 PCR扩增结束后立即进行熔解曲线分析,以验证扩增的特异性 熔解曲线的反应程序为;95 ;然后从55C开始每升高0.5笔保持10s,连续升高80次(到95C为止》. 1min;55C,1min D 验证检刹结束后,设备自动记录并生成报告 根据采集的炎光曲线租c值判定结果 F.3.2荧光探针法扩增程序 在cydler"(Bio.R.d.,UsA)实时炎光CR仪上进行的扩增程序为(其他型号PCR仪扩增醒序参 数可能稍有变化): -预扩增95,lmin 95,15s.59c.15s.72C,45s,40个循环;在每个循环延伸阶段(72C)同步采集荧光 末次延伸72,7nmin 检测结束后,根据采集的荻光曲线和Ct值判定结果 15
GB/28062一2011 附录G 资料性附录 柑桔黄龙病菌亚洲种实时荧光PCR检测试剂盒组成及使用说明 G.1试剂盒组成 每个试剂盒可做48个检测,包括以下成分 样品制备液I 50mL×1瓶 样品制备液 10mLx5管 样品制备液I 20mL×1瓶 阴性对照健康柑桔叶片DNA 100ng/管×2管 00g/'管X×2管 阳性对照柑桔黄龙病菌亚洲种重组质粒DNA 固相化试剂检测管 八联管×6条 恢复液 10mL×5管 G.2试剂盒说明 样品制备液1主要成分为三羚甲基氨基甲熔(Tis),乙二胶四乙酸(EDTA)和十二烧基颧酸销 G.2.1 (sDs),外观为无色液体,常温保存时可能有絮状沉淀,使用前应在65C下水浴加热溶解沉淀 使用前 按说明书要求加人蛋白酶K水溶液 G.2.2制备液皿第一次使用时应按包装上注明的剂量加人无水乙醇,然后常温密闭保存备用,可保存 2个月 G.2.3恢复液用于溶解荧光PCR固相化混合试剂 G.2.4用于荧光染料法检测的固相试剂检测管中包含除待测样品DNA外的所有PCR扩增反应试剂 及荧光染料,用于荧光探针检测的固相化试剂检测管中包含除待测模板DNA外的所有PCR反应试剂 及荧光探针 G.3功能 所列试剂盒可用于柑桔黄龙病叶片和果实等组织样品中柑桔黄龙病菌亚洲种的实时荧光PCR检 测和病害鉴定 若需检测样品带菌量,则样品和阳性对照都需要定量 具体操作按使用说明进行 16
GB/T28062一2011 G.4试剂盒使用注意事项 G.4.1发生褐变的柑桔组织材料不可用作PCR检测的样品 G.4.2在检测过程中,应严防不同样品间的交叉污染,所有用具应彻底清洗并消毒 移液器头尖应 次性使用,并且转移每个样品时都应更换 G.4.3全部检测过程可在室温(23C)下进行 试剂盒可以在室温条件下置于干燥器内密封保存,使 用时取出所需数量,剩余部分立即放回干燥器中 17

柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法GB/T28062-2011

柑桔黄龙病是由黄龙病菌引起的一种重要的柑桔类植物病害，其症状表现为叶片黄化、萎蔫、枯死等。黄龙病菌主要通过媒介昆虫传播，给柑桔生产造成了严重影响。

传统的检测方法包括组织切片、培养分离等，但这些方法效率低、耗时长，因此需要一种快速、准确的检测方法。实时荧光PCR技术是近年来发展起来的一种高效、敏感、特异性强的分子生物学检测技术，已经广泛应用于农业领域。

GB/T28062-2011标准规定了柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法。该方法利用引物和探针对黄龙病菌靶基因片段进行扩增和检测，通过荧光信号实现对病原体的定量检测。该方法具有高灵敏度、高特异性、高重复性等优点，能够在较短时间内完成对样本的检测。

使用该方法需要先提取待检样品中的DNA，并进行模板扩增反应。然后将PCR产物进行荧光定量检测，计算出待检样品中的黄龙病菌数量。

总之，柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法是一种快速、高效、准确的检测方法，可以帮助农民及时发现和防控柑桔黄龙病菌，促进柑桔产业健康发展。

柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法的相关资料

和柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法类似的标准

GB/T13607-1992

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