牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、孕酮残留量的测定液相色谱-串联质谱法

牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、孕酮残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T20758一2006 牛肝和牛肉中睾酮表睾酮 孕酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Methodforthedeterminationoftestosterone，epi-testosteroneand progesteroneresiduesinbovineliverandmuscletissues LC-MS-MSmethod 2007-03-01实施 2006-12-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20758一2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由秦皇岛出人境检验检疫局提出 本标准由国家质量监督检验检疫总局归口 本标准起草单位:秦皇岛出人境检验检疫局、广东出人境检验检 疫局 本标准主要起草人;庞国芳、林峰、林海丹、张美金、黄华军 本标准系首次发布的国家标准
GB/T20758一2006 牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、孕酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了牛肝和牛肉中睾酮,表睾酮和孕酮残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于牛肝和牛肉中睾酮,表睾酮、孕酮残留量的测定 本标准的方法检出限;肝脏中睾酮,表睾酮,孕酮为0.54g/kg,肌肉中睾酮、表睾酮为0.14g/kg" 孕酮为0.54g/kg 规范性引用文件 下列文件中条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有的 修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是 否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 (GB/T6379.1一2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004.ISO5725-2:1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992,neqIsO3696;l987) 原理 牛肝和牛肉中的睾酮,表睾酮,孕酮药物残留经酶解后用甲醇叔丁基甲酵提取,提取液用C固相 萃取柱净化,肝脏样品需再经硅胶固相萃取柱净化,洗脱液浓缩定容后,供液相色谱-串联质谱测定 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 4.1乙睛;色谱纯 4.2甲醉色谱纯 4.3叔丁基甲酥,色谱纯 4.4正己烧:色谱纯 4.5三氯甲炕 甲酸铵 B-葡糖苷酸酶和硫酸酯酶:H-2型,helixpomatia 磷酸盐缓冲液1.0mol/L 称取13,6g磷酸二氢钾溶于100ml水中,称取8.7g磷酸氢二钾溶 于50ml水中,分别取70mL磷酸二氢钾水溶液和28 8nL磷酸氢二娜水游液,混匀后调节pH值为 5.0，置4C中可保存1周 4.9饱和氧化钠水溶液 水饱和乙酸乙酯 4.11睾啊,表睾酮、孕酮标准物质;纯度>99%;尔代睾阴(d,-睾酮,尔代孕酮(d-孕酮)内标标准物 质纯度>98%
GB/T20758一2006 4.12标准储备溶液:1004g/mL 准确称取适量的睾酮、表睾酮、孕酮标准物质,用甲醇分别配制成 1004g/mL的标准储备溶液，-18C贮存,可使用6个月 4.13标准工作溶液，5"E/ml 分别吸取5ml攀酬、表睾阴、孕醋标准储备济液(4.12)至100mL容 量瓶中,以甲醇稀释并定容,此标准工作溶液的浓度为54g/ml -18C贮存,可使用6个月 4.14混合标准工作溶液504g/L 分别吸取 l.00ml 睾酮,表睾酮、孕酮标准工作液(4.13)至1001 ml 容量瓶中,以甲醇稀释并定容,此混合工作溶液的浓度为50g/L 一18C贮存,可使用3个月 4.15内标储备溶液,1004g/ml 准确称取适量的尔代睾酮(d-睾剩),尔代孕酮(d,-孕酮)标准品,用 甲醇分别配制成100 的内标储备溶液,一18C贮存,可使用6个月 0从g/ml" 4.16内标工作溶液:5g/mL 分别吸取5mL尔代睾酮(d,-酮、尔代孕酮(d-孕酮)内标储备溶液 4.15)至100ml 容量瓶中,以甲醇稀释并定容 一18C贮存,可使用6个月 分别收鼠0.50m尔代皋副(d-皇困,饥代孕屏(d-孕阴)内标 4.17内标混合工作溶液:25g/L 工作溶液(4.16)至100mL容量瓶中,以甲醇稀释并定容 一18C贮存,可使用3个月 4.18基质混合标准工作浴液;根据每种标准的灵敏度和仪器线性范围,吸取一定量的混合标准工作浴 液(d.l)和内标工作游液(.16),用空白样品提取液配成系列浓度的基质混合标准工作游液 当天 配制 g,6mL 使用前依次用6mL甲醇、6mL水活化 C,固相摹取柱,5S00n 4.19 mg 4.20硅胶固相萃取柱;200mg，6mL 使用前用6mL正己婉活化 4.21滤膜:0.2 Am 仪器和设备 5.1液相色谱-串联质谱仪,配有电喷雾离子源 5.2分析天平;感量0.1mg和0.01 g 5.3匀质机 554商迷组织匀浆机. 5.5低温高速离心机,转速大于4000r/min. 高速离心机转速大于12000r/min 超声波 55.8旋涡振荡器 5.9 振荡水浴 S .10氮气浓缩仪 5. .11固相萃取装置 5. .12旋转蒸发器 5.13KD浓缩瓶 试样制备与保存 6.1试样的制备 取样品约500g用组织捣碎机捣碎,装人洁净容器作为试样,密封,并标明标记 试样的保存 6. 2 将试样于一18C保存 测定步骤 7.1酶解 准确称取5g试样,准确至0.01g,置于50m离心管中,依次加人200内标混合工作溶液
GB/T20758一2006 4.17)、10mL磷酸盐缓冲液(4.8),以14000r/min均质30s,加人60L葡萄糖苷酸酶和硫酸酯酶 4.7),混匀30s,置于37C恒温振荡水浴中酶解16h 7.2提取 酶解后的样品溶液(7.1)加10ml 甲醇,混匀2min,置冰浴中放置5min,在5C以4000 r/min 离心10min,上清液转移至50ml离心管中,下层沉淀再用5ml甲醉重复上述操作一次,合并上清液 至上述50mL离心管中,向离心管中加人15mL 叔丁基甲酥,振摇5min,以4000r/min离心5min 上层溶液转移至125mL分液漏斗中,下层溶液依次再用15mL.10mL 叔丁基甲酷提取两次,合并上 层溶液至上述分液漏斗中,加人10mL饱和氯化钠水溶液(4.9),振摇30s,静置分层,上层溶液转移 至梨形瓶中,在40C旋转蒸发至干,残渣中加人1.5mL 甲醇,涡旋1 min,超声5min,再加人20mL 水,混匀,待净化 7.3净化 将样品提取液(7.2)转移至已活化的C固相萃取柱(4.19)上,用5mL水洗涤梨形瓶,洗涤液合并 至C固相萃取柱中,以<2mL/min流速使样液通过固相萃取柱,待样液过柱后,用5m水淋洗C 固相萃取柱,弃去淋洗液,用10m甲醇将待测组分从C固相萃取柱上洗脱,洗脱液转移至梨形瓶中， 在40C旋转蒸发至干 肌肉样品用0.5m甲醇溶解残渣,涡旋1min,加人0.5mL 水混匀,过 0.2m滤膜,供液相色谱谐-串联质谱测定 肝脏样品的洗脱液蒸干后,向梨形瓶中加人0.5ml三氯甲烧,涡旋1min,加人5ml正己炕,超 声1 nmin,然后转移至已活化的硅胶固相萃取柱(4.20)中,以1mL/min流速使样液通过固相萃取柱， 待样液过柱后,用5ml正己烧淋洗硅胶固相萃取柱,弃去淋洗液,用6ml水饱和乙酸乙醋(4.10)洗 min,加人 脱待测组分,洗脱液转移至KD接收瓶中,在40C旋转蒸发至干,加0.5mlL 甲醇,涡旋1 0.5ml水混匀,过0.2m滤膜,供液相色谱-串联质谱测定 称取田性样品,按717.？和Z.3步骤制备空白样品提取液,用于配制系列基质说合标准工作 溶液 7.4测定 7.4.1液相色谱条件 色谱柱.ca色谱柱.5m.,l50mmX2.1mm(内轻). a b)柱温:40C 进样量.,20l e 流动相,流速及梯度洗脱条件见表1 d 表1流动相、流速及梯度洗脱条件 时间/min 流速/mL/min) 乙晴/% 3mmol/L甲酸铵/% 30 70 0,00 0.200 85 15 0.00 0.200 85 15 15.00 0.200 15.01 30 7o 0.200 30 23.01 0.200 70 7.4.2质谱条件 离子源电喷雾离子源， a bb 扫描方式;正离子扫描; 检测方式;多反应监测; c d 雾化气、气帘气,辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体,使用前应调节各气体流 量以使质谱灵敏度达到检测要求;
GB/T20758一2006 喷雾电压、去簇电压、碰撞能等电压值应优化至最佳灵敏度 e 定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量见表2 表2睾酮、表睾酮和孕酮及内标物的质谱参数 定性离子对 定量离子对 被测物名称 定量用内标物采集时间/ms去簇电压/八y 碰撞能量/ /火 / 289/97 35 睾削 289/97 爪代睾削 100 65 289/109 39 289/97 35 55 表睾酮 289/97 尔代睾酮 100 289/109 39 315/109 38 尔代孕酬 孕削 315/109 100 54 315/97 37 爪代睾酮 57 294/100 294/100 100 35 d-睾酮 爪代孕 50 34 324/100 324/100 100 d-孕酮 7.4.3液相色谱-串联质谱测定 7.4.3.1定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同试验条件下,样品中待测物质的保留时间 与标准溶液中对应的保留时间偏差在士2.5%之内;且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的 标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较,若偏差不超过表3规定的范围,则可判定为样品中存 在对应的待测物 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 50 二l0 >20一50 >1020 士25 允许的最大偏差 士20 士30 士50 7.4.3.2定量测定 在仪器最佳工作条件下,对基质混合标准工作溶液(4.18)进样,以标准溶液中被测组分峰面积和内 标物峰面积的比值为纵坐标,标准溶液中被测组分浓度与内标物浓度的比值为横坐标绘制标准工作曲 线,用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内 内标 法定量 睾酮、表睾酮和孕酮标准物质的多反应监测MRM)色谱图参见图A.1和图A.2 睾酮,表睾 酮和孕铜的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见表B.1 7.5平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.6回收率试验 阴性样品中添加标准溶液,按7.17.3操作,测定后计算样品添加的回收率 结果计算和表述 结果按式(1)计算: 1000 x x是x是×会x 1000 式中 x -试样中被测物残留量,单位为微克每千克(4g/kg);
GB/T20758一2006 -基质标准工作溶液中被测物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL) -试样溶液中被测物的色谱峰面积; -基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积 -试样溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL).; -基质标准工作溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(n现/ml -基质标准工作溶液中内标物的色谐峰面积; 试样溶液中内标物的色谱峰面积; 样液最终定容体积,单位为毫升(mL); -试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g) m 精密度 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,被测物的含量范围及重 复性方程见表4和表5 表4含量范围及重复性和再现性方程(基质为肌肉 含量范围/ 再现性限R 化合物名称 重复性限" /4g/kg 睾削 0.05~0.5 r=0.0732m十0.0229 R=0.0720川十0.0268 0.05~0.5 尸=0.143m十0.0287 R=0.0149m十0.0168 表睾酮 孕酮 0.25~2.5 =0.0739m+0.0716 R=0.218m十0.0178 注:m为两次测定结果的算术平均值 表5含量范围及重复性和再现性方程(基质为肝脏 化合物名称 含量范围/(ug/ke) 重复性限， 再现性限R 睾削 0.252.5 =0.102十0.0216 R=0.1531十0.0008 表皋酮 0.25~2.5 =0.207m R=0.183m+0.032 孕酮 0,25~2.5 "=0.0805m十0.081 R=0,0926m十0.0677 注:m为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9.2再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,被测物的含量范围及再 现性方程见表4和表5
GB/T20758一2006 附 录 A 资料性附录 睾酮,表睾酮和孕酮的多反应监测(MRM)色谱图 A.1孕酮标准物质的多反应监测(MRM)色谱图,见图A.1 10.7孕削 3000 2000 1000 10 15 201/min 图A.1孕酮标准物质的多反应监测(MR)色谱图 A.2睾削,表睾酮标准物质的多反应监测MRM)色谱图,见图A.2 8.1睾削 7395 6000 B.9表皋削 4000 2000 10 15 201/min 图A.2睾酮、表睾酮标准物质的多反应监测(MRM)色谱图
GB/T20758一2006 附录 B 资料性附录 收率 睾酮、表睾酮和孕酮的添加浓度及其平均回收率的试验数据,见表B.1 表B.1睾酮,表睾酮和孕酮的添加浓度及其平均回收率的试验数据(n=10 样品基质 化合物名称 添加水平/ug/kg 平均回收率/(% 0.1 101.0 睾 0.2 97.3 0.5 106.0 0.l 95,9 肌肉 表睾削 86 0.5 105,0 0.5 86.8 孕酮 1.0 86.l 2.5 99,4 0.5 106.0 睾阴 103.0 2.5 102.0 0.5 114.0 102.0 牛肝 表睾酮 1.0 2.5 118.0 0.5 93.4 孕阴 1.0 86.5 2.5 91.8