牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱-串联质谱法

牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T22992一2008 牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、 己烯雌酚、己炕雌酚、双烯雌酚 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determinationofzearalanol,zearalanone,diethyIstilbestrol,hexestroland ienoestrolmwlti-residwesinmilkandmilkpowder LC-MS-MSmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22992一2008 前 言 本标准的附录A,附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局、天津出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:许泓、吴延晖何佳、张骏、张曼、林安清、庞国芳
GB/T22992一2008 牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、 己烯雌酚、己完雌酚、双烯雌酚 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了牛奶和奶粉中玉米赤霉醇(zearalanol)、玉米赤霉酮(zearalanone)、己烯雌酚(dieth ylstilbestol),己烧雕酌(hexestrol)双烯雌盼dienocestrol)残留量液相色谱-串联质谱测定方法 本标准用于牛奶和奶粉中玉米赤霉醉、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己婉雌盼、双烯雌酚残留量的测定 本标准方法检出限:牛奶中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮,己婉雌阶,己烯雌酚和双烯雌酚为1.04g/L 奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己婉雌酚、己烯雌酚和双烯雌酚为8.04g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分总则与定义 (GB/T6379.12004,ISO5725-l:l994,IDT GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.22004,IsO5725-21994,IDT) 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T66822008,Iso3696;1987,MoD) GB/T6682 原理 用乙晴作为蛋白沉淀剂和提取剂进行提取,阴离子固相萃取柱进行净化,用液相色谱-串联质谱仪 测定,内标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯 水GB/T6682,一级 4.2甲醇;色谱纯 4.3乙睛;色谱纯 4.4氨水 4.5甲股 4 氢氧化的 4 5 mol/儿氢氧化钠溶液;称取200只氢氧化钠,用蒸僧水定容到1L 4.8淋洗液;氨水-水(1十19) 4.9洗脱液:甲酸-甲醇(1+19) 4.10激素及代谢物标准物质:玉米赤霉醇(包括a-玉米赤霉醇和仔-玉米赤霉醇,各50%)纯度大于等 于97%;玉米赤霉酮,纯度大于等于97%;己烯雌酚,纯度大于等于99%;己烧雌酚,纯度大于等于
GB/T22992一2008 98%;双烯雌酚,纯度大于等于98% 4.11标准溶液;分别准确称取适量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮,己烯雌酚、双烯雌酚和已婉雌盼标准物 质,用甲醇(4.2)配制成1mg/ml标准贮备溶液 再根据需要以甲醇配制成不同浓度的混合标准溶液 作为标准工作溶液,保存于4C冰箱中 4.12内标标准物质:a-玉米赤霉烯醇-4爪代,纯度大于等于99%;己烯雌雕酚-8爪代,纯度大于等 于98% 4.13内标标准溶液;准确称取适量玉米赤霉烯醇-4尔代和己烯雌酚-8爪代标准物质,用甲醉(4.2)分 别配制成1mg/ml标准贮备溶液 再以甲醇稀释成适用浓度的混合内标工作溶液,保存于4C冰 箱中 4.14基质提取液;空白样品,除不加人标准工作溶液(4.11)和内标工作溶液(4.13)外,其他操作同 7. 1.1及7.1.2处理后得到的溶液 4.15基质标准工作溶液;将标准工作溶液(4.11)及内标工作溶液(4.13)混合后在氮吹仪中吹干,以基 质提取液(4.14)溶解,涡旋30s后即为基质标准工作溶液 4. 16OasisMAx阴离子固相萃取柱'或相当者;60mg,3mL 4.17滤膜:0.2m. 仪器 51液相色谐-串联质谱联用仪;配有电喷雾电离源 5.2自动固相萃取仪或固相萃取装置 5.3氮气吹干仪 55 .4 涡旋振荡器 5.5离心机:转速大于3500r/min 5.6高速离心机;转速大于9000r/min,温度可控制在4C 试样的制备 6.1牛奶 取50mL新鲜或解冻的牛奶混合均匀,3500r/min离心5min,取下层 奶粉 取12.5g奶粉于烧杯中,加适量35C一50C水将其慢慢溶解,转移至100mL容量瓶中,待冷却 至室温,用水定容混匀 取50mL,以3500r/min离心5min,取下层 测定步骤 7.1混合基质标准校准溶液的制备 7.1.1样品量取 于50mL离心管中,分别加人不同量混合标准工作溶液(4.11),使各被测组分玉米赤霉醇、玉米赤 霉酬,己皖雌盼、已烯雕酚和双烯雌雕盼的浓度为2.5ng/ml5.0ng/mL、10ng/mL,25ng/mL、 50 ng/mL 再分别加人适量内标标准工作溶液(4.13),使其浓度均为l0ng/ml,在氮吹仪上于40C水 浴中吹干 取5个阴性样品,每个样品为5mL,置于上述离心管中涡旋混合后,加10ml乙腊,涡旋混 min,3500r/min 合31 离心10mit n,取上清液于离心管中,再向样品中加人5ml乙睛,同前操作,合并 提取液,50c下氮吹至体积小于0.1ml 加水10 ,用5mol/儿LNaOH调节pH至11.0,4C ml OasisMAx阴离子固相萃取柱是waters公司产品的商品名称,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并 不是表示对该产品的认可 如果其他产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T22992一2008 9000r/min离心5min,备用 7.1.2提取净化 固相萃取净化条件;先用2mL甲醇、2mL水将柱子活化,流速均为4mL/min 将7.1.1样品上 清液上柱,流速为1mL/min,依次用1mL淋洗液(4.8),0.5mL甲醇以3mL/min的速度淋洗,通人 20mL空气以4mL/min的速度吹过OasisMAX柱 用4mL洗脱液(4.9)洗脱,流速为1ml/min, 加人30mL空气以6mL/nmin的速度吹过OasisMAX柱,收集洗脱液 将洗脱液在氮吹仪上于40C 水浴中吹干,加人1mL流动相,涡旋30s溶解 溶液过0.2xm滤膜后,供液相色谱-串联质谱测定 实测样品溶液的制备 取待测样品5nml于50ml离心管中,加人适量内标标准工作溶液(4.13),使其最终定容浓度均为 0ng/mL 按7.1.1及7.1.2操作 空白基质溶液的制备 取阴性样品5ml于50ml离心管中,按7.1.1及7.1.2操作 测定条件 7 .4.1液相色谱条件 液相色谱条件如下: 色谱柱;.zZ0RBAxEdlpeesBC.3.》pm.l50mmxA.厅mm(内径)或相当者 a b) 柱温:25C; c)流动相:乙猜-水(73); d 流速:0.5ml/min; e)进样量50Al 7.4.2质谱条件 质谱条件如下: a)离子化方式电喷雾电离; b) 扫描方式;负离子扫描; c 检测方式;多反应监测(MRM); 离子源温度:350C; dD 雾化气压力;0.083MPa; 气帘气压力:0.1240MPa 辅助气1压力:0.2756MPa; g 辅助气2压力;0.2412MPa; m 喷雾器电流一》AA i i 电喷雾电压;一4500V; 定性离子对.定量离子对.碰撞能量和去簇电压见表1. k 表15种激素及代谢物的定性离子对定量离子对,碰撞能量和去簇电压 化合物名称 定性离子对(m/e) 定量离子对(m/ 碰撞能量/N 去簇电压/V 2 -42 一ll0 320.6/277.2 玉米赤霉醉 321.1/277.2 321.1/161.0 100 -40 -40 -11o 318.7/160.8 玉米赤霉阴 318.7/160.8 318.7/107.0 -45 1l0 -90 -50 玉米赤霉始 322.9/159,9 322.9/159.9 醇-4代 322.9/130.1 -90 -43
GB/T22992一2008 表1(续 化合物名称 定性离子对(m/: 定量离子对(m/: 碰撞能量/V 去簇电压/八V -35 -90 266.9/251.0 己熔雌盼 266.7/251.0 266.9/237.1 -40 -90 -36 -8o 264.7/249.1 双烯雕盼 264.7/249.1 264.7/235,0 -36 -80 -23 -70 269.0/118.9 269.0/134.0 己烧雕前 269.0/134.0 -52 -70 -37 -90 275,0/258,9 己烯雌酚-8代 275,0/258,9 275.0/245.0 42 -90 7.4.3液相色谱-串联质谱测定 7.4.3.1定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同实验条件下,样品中待测物质和内标物的 保留时间之比,也就是相对保留时间,与混合基质标准校准溶液中对应的相对保留时间偏差在士2.5% 之内;且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定 性离子的相对丰度进行比较,偏差不超过表2规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 K>50 相对离子丰度K 20GB/T22992一2008 -基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积 As 试样溶液中内标物的色谱峰面积 A -样液最终定容体积,单位为毫升(ml) -试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g) n 计算结果应扣除空白值 玉米赤霉醇和己烯雌酚将2种异构体面积或峰高值相加后以总量计算 精密度 -般规定 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 9.2重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,玉米赤霉醉、玉米赤霉 酮、己烯雌酚、己烧雌酚、双烯雌酚在牛奶中的添加浓度范围及重复性方程见表3,在奶粉中的添加浓度 范围及重复性方程见表4 表3牛奶中的添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每升 化合物名称 添加浓度范围 重复性限， 再现性限R 玉米赤霉醇 1.0~1o g"一0.9636gm-1.0897gR=0.9825g从-0.712s 玉米赤霉酮 1.0~10 gr=0.9660lgm-1.1445lgR=0.9152lgm一0.6513 己烯雕酚 1.010 lgr=0,9844lgm-1.0935lgR=0,2058lgm0,011 双烯雕酚 1.010 lgr=0.0735lgm+0.0016lgR=1.0813lgm-0.7982 己烧雕酚 1.010 lgr"=0.9760lgm一l.0445lgR=0,9252lgm一0.661 注;"为两次测定结果的算术平均值 表4奶粉中的添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克 化合物名称 添加浓度范围 重复性限" 再现性限R 玉米赤霉醇 10~100 lg川一1.0897lgR=0,9625lgm一0.7128 g"=0.9656I 玉米赤霉酮 10100 lgr=0.9660lgm-1.1445lgR=0.9152lgm-0.651 己烯雌酚 10~100 lgr=0.9844lgm一l.0935lgR=0.2058lg十0.01l 双烯雌酚 10~100 lgr=0.0735lgm十0.0016lgR=1.0813lgm-0.7982 10100 己烧雌酚 lgr=0,9760lgm一1.0445lgR=0,9252lgm一0,6613 注;"为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,玉米赤霉醉,玉米赤霉 酮、己烯雌酚、己婉雌酚、双烯雌酚在牛奶中的添加浓度范围及再现性方程见表3,在奶粉中的添加浓度 范围及再现性方程见表4
GB/T22992?2008 ?A ?? ???-? ?ù?ù????欴?????????-?, ?A.1 MN.p. 3.4e4 d 0.0 25 3o 1.0 1.5 2.0 3.5 4.0 7.0 7.5 8.08.5 A9 Max.1.1e4Cs. 5.18 00e4 a.00 a5 .0 I5 2.0 2.5 3.0354.0 5.O 6O 65 7.0 7.5 B.0 4.5 5.5 85 9.0 '/m MMas.2.e4cps 5.24 2.0e4 5 54.o 5 O 1.0 1.5 2.0 25 3.0 6.0 7.0 7.5 4.5 5.05.5 85 nR" /m Max.2936,5cps. 5,11 2937 2000 Xo?57.075 a51.01.52.25 30354.04.50 8085 a0 /m Max.4589.5cps 424,55 589 0.50 L.181.1?.74 5.72 647 7.8&298 05 .o 202.5 ao 34.O45 5056.0657.07.5 ao 1.5 8.5 9.0 /mmim Max.4508.6eps 528 4509 3.63 a L.0 1.2025 a0a54D45o B5i.067.07.5 R0 8.5 /m0 ?A.1?ù?ù??????????????-?
GB/T22992一2008 附 录 B 资料性附录 回 收 率 本方法检测牛奶中的激素及代谢物添加浓度及其平均回收率的试验数据,见表B.1 表B.1添加浓度及其平均回收率的试验数据 化合物名称 添加浓度/4g/L 平均回收率/% 1.0 84.93 2.0 88.58 玉米赤霉醉 91，35 5.0 10.0 97.80 1.0 76,10 2.0 79.18 玉米赤霉削 5.0 101.0 10.0 l02.4 1.0 80.12 78. 67 2.0 己烯雌盼 5.0 l02.7 10.0 96.35 1.0 74.83 2.0 93.00 双烯雕盼 5,0 99.53 10.0 95.32 l.0 91.33 2.0 72.67 己烧雌酚 5.0 92.47 10.0 100.6