GB/T33807-2017
玉米中转基因成分的测定基因芯片法
Detectionofgeneticallymodifiedcomponentsinmaize—Genechipmethod
- 中国标准分类号（CCS）B04
- 国际标准分类号（ICS）67.050
- 实施日期2017-12-01
- 文件格式PDF
- 文本页数14页
- 文件大小928.06KB
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玉米中转基因成分的测定基因芯片法
国家标准 GB/T33807一2017 玉米中转基因成分的测定 基因芯片法 Deteetionfgenetiealymditfielcompoments inmaize Genechipmethod 2017-05-31发布 2017-12-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/33807一2017 玉米中转基因成分的测定 基因芯片法 范围 本标准规定了玉米及玉米加工产品中转基因成分的检测方法
本标准适用于转EPSPS基因、PAT基因、BAR基因耐除草剂玉米和转B基因(Cry1A105、 Cry1Ab)抗虫玉米中转基因成分的定性检测,也适用于玉米加工产品中转基因成分的定性检测,本标准 规定的转基因成分最低检测限量是0.1%
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.6转基因产品检测基因芯片检测方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 术语定义和缩略语 3.1术语和定义 GB/T19495.1、GB/T19495.6界定的术语和定义适用于本文件
3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件
BAR:来源于杆菌Bacilusamyoliquefaciens草丁麟乙酰转移酶基因phosphinothrieinacety ransferasegene bp:碱基对(basepair romoterfromcauu CaMV35S-P:来自于花椰菜花叶病毒的35S启动子(Pro nliflo oe”osaicr CaMV35S-T;来自于花椰菜花叶病毒的35S终止子(Terminationsequencefromcauliflowe”mo saicuirus CrylAb;苏云金芽袍杆菌杀虫毒蛋白CrylAb基因(Baecilw、huringiensi、lnseetieidaltoxin Cry1Abgene Cry1A105:苏云金芽袍杆菌杀虫毒蛋白Cry1A105基因(BaeillushuringiensisInseetieidaltoxin Cry1A105gene
GB/T33807一2017 dATP;脱氧腺苷三磷酸( deoXyadenosinetriphosphate) dCTP:脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphate dGTP;脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosinetriphosphate rionucleicacid DNA;脱氧核糖核酸(deoxyri dTTP:脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate dUTP;脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridinetriphosphate) y EPSPs:5-烯醉丙酮酰葬草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyru -shikimate-3-phosphatesynthase) FMv35S-P;玄参花叶病毒35s启动子[promoterfromFigwortmosaicvirus(FMIV35s7 rl:玉米转化酶1基因[Zeamaysinvertase(Irl gene NC:阴性对照(Negativecontrol NOS3';胭脂碱合成酶基因终止子(Terminationsequenceofthenopalinesynthasegene) PAT:草丁脚乙酰转移酶基因(phosphinor thrieinN-acetyltransferasegene' PC:阳性对照(Positivecontrol Taq酶;来自于栖热水生菌的DNA聚合酶(ThermusaquaticusDNAPolymerasey UNG酶:尿喘唁-N-糖基化酶(uracilN-glycosyle lase 防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施应按照GB/T19495.2的规定执行
5 抽样与制样 抽样与制样方法应符合GB/T19495.7的相关规定
6 原理 待检样品经DNA模板提取和核酸定量,采用多重PCR扩增体系,扩增其中可能含有的转基因玉 米转基因特异性扩增序列
PCR扩增产物与固定有目标转基因特异性探针的基因芯片进行杂交后,检 测结果可以用肉眼直接判断,或用芯片识读仪对杂交芯片进行扫描并判定结果
试剂与标准品 7.1试剂 除非另有规定,本方法中所用试剂均为分析纯,水为GBy/T6682规定的三级水
7.1.1玉米转基因检测膜芯片法试剂组分应符合7.1.3~7.1.22的规定 7.1.2试剂组分规格和存放条件参见附录A
PCR反应使用的引物序列应符合表1的规定
7.1.3
GB/33807一2017 表1CR反应使用的引物序列 目标基因 引物名称 序列 扩增片段大小/bp Forward 5'-GCGCGATCATACGGAAAAGAT-3” EPSPS 123bp 5'-biotin-'TcGATGAcTTGGccG(GTG;AG3 Reverse Forward 5-TGATATGGccGcGGTTTG;TGAT-3" 18obp PAT Reverse 5'-biotin-(GGCCCAGcGTAAGCAATACC-3” Forward 5'-CACCTGCTGAAGTCCCTGGA-3” BAR 193bp Reverse 5’-biotin-GTACCGGCAG;GCTGAAGTCCA-3” Forward ACTCGATCAGGTACAATGCCA-3’ Cry1A105 113bp 5'-biotin:GCATCTGTTAG;GCTcTcCAc3 Reverse 5'-G;ACATGAACAGcGcCTTGAC3" Forward Cry1Ab 164bp Reverse 5'-biotin-TTGATGGTTGCAGCATcGAA-3” Forward 5'-AGTCCAAAGCCTCAACAAG(G;3” FMV35SP 168bp Reverse 5’-biotin-CCCACTAACTTTAAGTCTTCGiGTG3 Forward 5'-GGCCATCGTTGAAGATGCCTC-3’ CaMv35s-P 144bp Reverse 5'-biotin-TCATCCCTTACGTCAGTGGA-3” 5*-CcAGATAAG;GGAATTAGGG;TTc3 Forward CaMV35ST 132bp 5-biotin-AcTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGA-3 Reverse 5’-TGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTT-3 Forward NOS3” 113bp 5'-biotin-GcGcGcGATAATTTATcCTAGTTT-3" Reverse Forward 5*-GCTcCTAGCATTcCAcGTcC3 1tp Ivr Reverse 5'-biotin-CCCTTGTGATACAGCGGACCT-3" 7.1.4膜芯片表面包被的目标基因探针序列应符合表2的规定 表2目标基因探针序列 名称 序列 修饰基团 EPSPS5'-ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCCGCCTGGAAGGCCGCGGC3’ 5'-AminoinkerC6 PAT 5'.GCAAGATAGATACCCTTGG;TTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTTGTGGCTGGTATTGCTT3’ 5'-AminolinkerC6 GCATGACGTGGGTTTCTG3” -AminoinkerC6 BAR [5'-CGCGGCATGCTGCGGGCGGCCGGC'TTCAAGCACGGGAACTGGCA -AminolinkerC CrylAI055'-GACCCGTGAATGTCCCAGTACTGGTTCCCTCTGGCCACTTTCTGCCCAATCTCCCATTG3" 5'-(GCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTcGAGAcGTTAGCGTGTTTGGGCAAAG(GTG(GGG3" CrwlAb 5'-AminolinkerC FMV35S-P5'-CAAAGTAAACTACTGTTcCAGCACATGCATCATGGTCAGTAAGTTTCAGAAAAAGACAT-3’ 5'-AminolinkerC CaMV35S-P5'-AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTcCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATG3’5'=-AminolinkerC CaMV35S-Tl5'-AGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAAT-3’5'-AminolinkerC NOS3’5'-TTATGATTAGAGTccCGcCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGcGC-3’5'-AminolinkerC vr 5'-AGATATTGTcccATcAGCTGCTAMCTTTGcGTATTGATGTGTG.AcATTTTGcANcGcA3” 5'-AminoinkerC6
GB/T33807一2017 表2(续 名称 序列 修饰基团 PC 5'=-(GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG3’5'-AnminolinkerC6 NC 5'-GGTTCC'TTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC-3 5'-Aminolinker(C6 注，阳性寡核苷酸单链DNAPositiveOligo,10mol/L.);核苷酸序列与阳性对照核酸探针(P)序列互补,用于膜 芯片杂交过程质量控制,5'端带生物素(biotin)标记,序列如下 5'-biotin-CTGGTACTTTGGACACTcGTTCTTcTcGcACTGCTCATTATTGCTTcTGATcTGGATGC3’ 7.1.5 乙 二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na，CHNNa,O);分析纯
7.1.6十二烧基磺酸钠(sDs,CHso,Na);分析纯
7.1.7氢氧化钠(NaOH);分析纯
7.1.8氯化钠(NaC);分析纯
219稍股二氢的CNHo,Ho.分析纯 7..10 碱性磷酸酶标记链霉亲和素AP-streptavidin)
就样动做脚化学星爸爬物公祝中数学年股丽般化暗旅四狐哗兰r以m 7..2 重PCR即用型预混液(MultiplexPCRMasterMix). 7.1.13多重CR引物颜混液(MwliplexPCRPimerMhix);每条引物24molL. 7..1420xssPE缓冲液3mLNacCI，20mmLNaH.Po,.，2DmmLEDTA，pH7.！ .1.15 去活化液:100mmol/INaOH
7.1.10 去活化清洗液;2×ssPE,0.1%sDs
7.7杂交液2XssPE,0.%sDs. nT" 杂交清洗液;2×SsPE,0.5%SDs
2h9 酶孵育液;2×SSPE,0.5%SDs 1" 孵育清洗液1;2×SSPE,0.5%SDS 7.1.21孵育清洗液2;2xssPE 7.1.22底物显色液;碱性磷酸酶化学显色底物NBT/BCIP显色液
7.2标准品 7.2.1Bt11Maize转基因玉米标准品Bt11品系 Btl1品系含待检测转基因Cry1Ab,PAT,CaMV35S-P,NOS3’
7.2.2CBH-351Maize转基因玉米标准品CBH-351品系 CBH351品系含待检测转基因BAR,CaMV35SP,CaMV35S-T，NOS-3'
7.2.3Tc1507NMaize转基因玉米标准品Tc1507品系 TC1507品系含待检测转基因;PAT,CaMV35SP,CaMV35S-T 7.2.4MON88017Maize转基因玉米标准品MON88017品系 MO88017品系含待检测转基因,EPsPs,CaMv35S-P,NOs3” 7.2.5MoN89034Maize转基因玉米标准品MoNN89034品系 MONN89034品系含待检测转基因:Cry1A105，FMV35S-P,CaMV35SP,NOS3”
GB/33807一2017 7.2.6Non-ModifelMaiz非转基因玉米标准品 仪器与设备 8.1基因扩增仪
8.2超净工作台
8.3消毒灭菌锅
8.4制冰机
8.5核酸蛋白分析仪 8.6冷藏冷冻冰箱
8.7纯水仪
8.8研磨仪 8.9分析天平 8.10膜芯片识读仪
8.1台式离心机;最高转速12000r/min. 8.12 Mini个人离心机
8.13涡旋混合器
8.14恒温水浴锅
8.15分子杂交炉 8.16膜芯片自动杂交仪
8.17微量移液器(量程0.2L2AL，l4L10AL,20L100AL，100AL1000L)及枪头
试验方法 g.1样品 9.1.1实验室样品代表性应符合GB/T19495.7的规定
g.1.2标准品、实验室样品及测试样品的保存应按照GB/T19495.1的规定执行
g.1.3所有测试样品的制备操作应按照GB/T19495.2的规定执行,小心操作确保防止任何的污染和 样品组分的改变
9.2膜芯片的制作和检测步骤 g.2.1试验用膜芯片按照附录B的方法进行制作 9.2.2膜芯片检测步骤按照附录C进行
g.3样品制备 g.3.1DNA的提取 样品中DNA的提取,应按照GB/T19495.3中的规定执行
每个测试样品提取时应做两个重复 并按照GB/T19495.3中规定的DNA定量方法对提取后的DNA进行定量
g.3.2PCR扩增 将9.3.1的核酸提取物加人到PCR反应体系进行扩增
GB/T33807一2017 g.3.3CR反应体系 按照表3配制PCR反应体系
每次试验中,利用转基因玉米标准品的基因组DNA作为阳性质 控,非转基因玉米标准品的基因组DNA作为阴性质控,核酸提取空白作为空白质控,以对后续的PCR 扩增体系、膜芯片杂交反应进行质控
表3PCR反应体系体积(50uL 反应液组成 检测反应 阳性质控 阴性质控 空白质控 MultiplexPCRMasterMix 25Al 25L 25AL 25 MultiplexPCRprimerMix 5L 5L 5l. 5AL 检测样品基因组DNA 200ng 200 转基因玉米标准品基因组DNA ng 非转基因玉米标准品基因组DNA 200ng 核酸提取空白 10AL 无核酸酶灭菌水 至50儿L 至50儿l 至50儿. 至50L PCR体系最终含有Mg(CL1.5mmol/L，dATP,dcTP,dGTP,dTTP和dUIP各0.2mmol/L,UNG酶1U. 去 Taq酶2U,每条引物0.24mol/I
9.3.4CR反应循环参数 按照表4设计PCR反应参数
表4PCR反应参数 步骤 温度 反应时间 37 10min 95 10min 95C 30s C 55 30s 72C 30s a.4.5循环0次 10min 保温 g.4膜芯片杂交 9.4.1杂交体系 按照表5配制杂交体系液
GB/T33807一2017 g.4.3.2自动杂交仪测定过程 按膜芯片自动杂交仪操作说明书开机,预热,之后将包装有膜芯片的杂交盒放人自动杂交仪中开始 杂交过程,依次自动完成去活化、杂交、清洗、酶孵育、显色等步骤
具体过程如表8所示
表8自动杂交仪测定过程 程序名称 试剂名称 温度/" 时间/min 37 去活化 去活化液 去活化清洗 去活化清洗液 60 42 45 杂交 杂交液 杂交清洗 52 杂交清洗液 杂交清洗 杂交清洗液 52 酶孵育 孵育液 42 30 42 孵育清洗1 孵育清洗液l 孵育清洗1 42 孵育清洗液1 37 孵育清洗" 孵育清洗液2 37 孵育清洗 孵育清洗液2 显色 显色液 37 15 显色清洗 去离子水 37 显色清洗 去离子水 37 结果判读 根据杂交点显色情况进行结果判读 9.5膜芯片结果判读 9.5.1 目测判读 显色后的膜芯片可以用肉眼直接判读检测结果
阳性杂交信号为肉眼明显可见的蓝色斑点
如果 杂交点部位没有显色,和膜芯片背景相同,则判读为阴性杂交信号
9.5.2膜芯片识读仪判读 膜芯片显色后,使用膜芯片识读仪进行扫描分析,根据杂交点的灰度值判断检测结果,阳性杂交信 号的判断阔值是3倍背景灰度值加上3倍背景灰度值标准差 10结果判断 10.1质量控制 10.1.1核酸提取空白对照和多重CR扩增试剂空白对照 膜芯片上内源基因探针点杂交信号阴性,转基因探针点杂交信号阴性,阳性对照探针点杂交信号阳 性,阴性对照探针点杂交信号阴性
GB/33807一2017 0.1.2非转基因标准品对照 膜芯片上内源基因探针点杂交信号阳性,转基因探针点杂交信号阴性,阳性对照探针点杂交信号阳 性,阴性对照探针点杂交信号阴性
10.1.3转基因标准品对照 膜芯片上内源基因探针点杂交信号阳性,转基因探针点杂交信号阳性,阳性对照探针点杂交信号阳 性,阴性对照探针点杂交信号阴性
0.1.4质量控制原则 试验中设置10.1.110.1.3所述的质控对照,其膜芯片杂交检测结果应符合以上情况
如果出现 非10.1.l10.1.3中所述的杂交结果,则应判断实验不成功,需重做试验
10.2结果判断 样本检测结果中阳性对照探针点杂交信号阴性,可初步判读膜芯片杂交过程不成功,应确认各 10.2.1 杂交试剂是否过期或保存条件不当,更换可疑试剂后重新试验
10.2.2样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阴性,表明未能从样本中提取出适宜多重PCR扩增 的核酸模板,需要重新进行样本核酸提取和多重PCR扩增
样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阳性转基因探针点杂交信号阴性,表明样本核酸提 10.2.3 取、多重PCR扩增和膜芯片杂交过程正常,判断样本中未检出测定转基因成分
样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阳性各转基因探针点杂交信号部分或全部阳性,表 10.2.4 明样本核酸提取、多重PCR扩增和膜芯片杂交过程正常,判读样本中存在阳性信号点对应的转基因 成分 结果表述 11 11.1未检出 未检出××××基因,阴性质控探针杂交点、阳性质控探针杂交点的检测结果正常
11.2检出 检出××××基因,阴性质控探针杂交点、阳性质控探针杂交点的检测结果正常
GB/T33807一2017 附 录 A 资料性附录) 膜芯片法试剂组分的规格和存放条件 将膜芯片法所用试剂组分的规格和存放条件列于表A.1中
表A.1膜芯片法试剂组分规格和存放条件 称 序号 规格 数量 存放条件 1250AL -20 多重PCR即用型预混液 1管 1管 多重PCR引物预混液 2504L -20 无核酸酶灭菌水 2管 -20 lml -20 转基因标准品基因组DNA(50ng/pL) 1管 200Al .10Amol/1 50 -20 A性鲜核甘放单佳NAO 1管 Al 去活化液 60mL 室温 1瓶 去活化清洗液 60mL 1瓶 室温 杂交液 60ml 1瓶 室温 2瓶 杂交清洗液 60ml 室温 1瓶 室温 酶孵育液 60ml " 1 碱性磷酸酶标记的链霉亲和素 25l 管 12 60mL 室温 孵育清洗液1 2瓶 13 孵育清洗液2 60ml 室温 2瓶 14 BCIP/NBT显色底物 25ml 1瓶 4 15 膜芯片 50片 室温 0
GB/33807一2017 录 附 B 规范性附录 膜芯片制作方法 B.1膜芯片制作 采用微定量喷点式膜芯片点样仪,将各个核苷酸探针(探针浓度25mol/L)分布在带负电荷尼龙 膜芯片上的特定位置区域
芯片表面包被的探针布局如图B.1
杂交阳性对照;PC,监测芯片杂交过程是否正常
内对照lrl,指膜芯片上用来质控PCR扩增过程是否正常的对照,使用玉米特异性内源基因lvrl 扩增片段互补的一段寡核苷酸作为探针
阴性对照;NC,指膜芯片上用来质控探针杂交特异性的对照
一般使用一段与靶标分子序列相近 或无关的寡核苷酸作为探针
Irl EPSPS BAR PT FMv355-P CaMy355S-P Cn1A105 Cny1Ab CeaMv355S-" N0S-3' PC Nc rl;玉米转化酶1基因;EPSPs,5婚醉丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶;BAR,草丁腾乙酰转移酶基因;PAT,草丁脚 乙酰CoA转移酶基因;CrylAl05:苏云金芽袍杆菌杀虫毒蛋白CrylAl05基因;CrylAb:苏云金芽抱杆菌杀虫毒蛋白 Cry1Ab基因;FMV35sP玄参花叶病毒35s启动子;CaMV35sP;花椰菜花叶病毒35S启动子;CaMV35sT;花椰菜花 叶病毒35S终止子;Nos3’;胭脂碱合成酶基因终止子;Pc:阳性对照核酸探针;NC:阴性对照核酸探针
图B.1芯片探针布局 B.2膜芯片的质量控制 膜芯片点样后扫描无漏点,连点,位点规则,大小均匀一致,点与点的距离为3004m~ -500m;杂 交后阳性质控试验杂交信号清晰可见
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玉米中转基因成分的测定基因芯片法GB/T33807-2017
玉米是世界上被广泛种植和应用的作物之一，然而其中存在着许多转基因品种。因此，对于玉米中的转基因成分的准确测定，一直是学术界和产业界的关注点。
现在，基因芯片技术为我们提供了一种新的检测方法。基因芯片是一种高通量、高度自动化、并行检测的技术平台，可同时检测数千个基因，具有快速、高灵敏度、高特异性、高重复性等优点。
GB/T33807-2017《农产品中转基因成分检测技术要求及检测方法》是国家标准和推荐行业标准，规定了基因芯片检测方法。该标准分别从样品制备、杂交反应、芯片扫描和数据分析等方面进行了规范。
具体来说，在样品制备方面，需要进行DNA的提取、纯化和定量。在杂交反应方面，基因芯片会同时检测多个基因位点，通过与探针的杂交反应，可以确定样品中转基因成分的含量和种类。
在芯片扫描方面，需要使用高分辨率芯片扫描仪对芯片进行扫描，并保存数据以备后续分析。在数据分析方面，需要对芯片数据进行标准化、归一化、差异分析等多个步骤，最终得出检测结果。
总的来说，基因芯片技术是一种快速、高效、可靠的玉米中转基因成分检测方法。随着该技术的不断发展和完善，相信其在农产品质量检测领域将有越来越广阔的应用前景。
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