饲料中盐霉素的测定

饲料中盐霉素的测定

国家标准 GB/T20196一2006 饲 料中盐霉素的测定 Determinationofsalinomyeininfeeds 2006-07-01实施 2006-02-24发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 小 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20196一2006 饲料中盐霉素的测定 范围 本标准规定了饲料中盐霉素的微生物检验方法和高效液相色谱仪柱前衍生化检验方法 本标准两种方法均适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中盐霉素的测定 最低检出限为 1.25mg/kg 其微生物检验方法为伸裁法 本标准高效液相色谱柱前衔生化法也适用于盐霉素预混 剂中盐霉素的测定 注1:1000 )盐霉素单位(U)相当于1mg的盐霉素(cHon). 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T4789.1食品卫生微生物学检验总则 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 方法1微生物检验方法(仲裁法 3.1原理 用甲醇和水提取试样中盐霉素,提取液过氧化铝层析柱净化,除去饲料中的干扰性物质 洗脱液经 稀释(或浓缩),利用试液中盐霉素与嗜热脂肪芽抱杆菌作用产生抑菌圈,根据抑菌圈大小用标准曲线法 定量测定盐霉素含量 3.2试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水 3.2.1甲醇溶液 9十l(V十V) 3.2.2氧化铝 270目335目经300C活化3h.于干燥器冷却备用 3.2.3氧化铝层析柱 将活化氧化铝装填人层析柱中(高20mm,内径10mm),同时轻轻拍柱至氧化铝表面不再下降 氧化铝的高度为8em~9cem 3.2.4试验菌种 嗜热脂肪芽袍杆菌(Bacillusstearothermohilusvar.calidolactis) 3.2.5盐霉素标准溶液 3.2.5.1盐霉素标准贮备溶液 精确称取盐霉素钠标准品(含量94.1%)0.1063g,置于100ml容量瓶中,用甲醇溶解,稀释至刻 度,摇匀,其浓度为10004g/mL,置于0C冰箱中,有效期两周 3.2.5.2盐霉素标准中间液 准确移取10.00m 标准贮备液(3.2.5.1)于100mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,其浓度 分别为100.04g/mL 当日配制和使用
GB/T20196一2006 3.2.5.3盐霉素标准工作溶液 分别准确移取一定量盐霉素中间液(3.2.5.2),用甲醇溶液(3.2.1)稀释成浓度为5.004g/mL、 0.004g/mL、,15.004g/mL,20.00g/mL、25.004g/m的标准工作液,其中5.00g/mL为参考浓 度的标准工作液 以上溶液须当日配制和使用 3.2.6培养基 按附录B中规定制备 3.2.7菌悬浮液 嗜热脂肪芽抱杆菌接种于培养基I内,于(55士1)C培养(17士1)h 于8000r/min离心15min 弃去上层液 加人适量生理盐水,离心,反复洗涤,弃去洗液 最后加人30ml.生理盐水制成均悬浮 液,于4C冰箱保存,该溶液可使用6周~8周 3.2.8检定平板的制备 在制平板前,先放上牛津杯注人0.10ml.的5ug/ml浓度的标准工作液(3.2.5.3)对菌悬液的最 佳用量进行预测试 以不同量的菌悬液加人经溶化并冷却至50C一55C的培养基l,充分混合,于 55士1)C培养(17士1)h后,选择能使该浓度标准工作液产生直径>12mmm清晰、完整的抑菌圈的菌悬 液用量为最佳用量 于灭菌平皿中加人20mL熔化并冷却至50C一55C的培养基,保持水平,待其凝固后,制成基 再注人已加人最佳用量菌悬液的培养基I,保持水平,使其凝固制成检定平板,所用平板需当天 层 制备 仪器与设备" 高压灭菌锅或灭菌箱 3.3. 3.3.2恒温培养箱;55C士1C,隔板保持水平 旋转真空猴发器 振荡器:往复式 离心机;不低于7000g(9000r/min). 200mm， 游标卡尺:测量范围0n n,精度0.02mm;或抑菌圈测量仪 mm一 培养皿;内径90mm,底部平整光滑的玻璃皿,具陶瓦盖 牛津杯;内径6.0mm,高10.0 mm， ,外径7.8mm的不锈钢管 nL1000 3.3.9可调微量移液器:200l 0Ala 注2:可调微量移液器需经过校准 3.3.10实验室常用玻璃器m 试样的制备 按GBy/T1469.1倒料采样方法采样,选取倒料样品至少500e,四分法缩诚至少100g,廊碎,通过进 n孔筛,混匀,装人密闭容器中,避光低温保存备用 0.28 m 3.5分析步骤 3.5.1试液制备 3.5.1. 微生物实验室的操作注意事项按GB4789.1执行 3.5.1.2准确称取一定量试样,精确至0.0001g,于250mL具塞三角瓶中,准确加人20.0mL样品 提取液(3.2.1),在往复振荡器上振荡1h,静置片刻,全部转移到准备好的氧化铝柱(3.2.3)中,用样品 提取液(3.2.1)不间断地洗脱 用100ml容量瓶接收至刻度 3. 1.3根据提取液(3.5.1.2)中盐霉素预计浓度(依据标示量、称样量和提取液量确定分取量,参见 了 附录A)吸取一定量提取液(3.5.1.2)置于旋转蒸发器中,减压至干 加人适量样品提取液(3.2.1)稀 1可以用一次性使用的仪器代替可重复使用的仪器
GB/T20196一2006 释,使试液中盐霉素含量为5g/ml20g/mL 3.5.2标准曲线的制备 以5.0g/mL浓度的标准工作液作为参考浓度 标准曲线上的每个标准浓度各取3个检定平板 为一组 在每个平板上放置6个牛津杯,使牛津杯在半径为28mm的圆面上成60"角间距 其中3个 牛津杯滴加0.1ml的参考浓度,另3个滴加0.1mL其他一种浓度的标准工作液 参考浓度溶液与标 准浓度溶液要间隔放置 4种浓度的标准工作液共用12个检定平板 将陶瓦盖盖好,于4C放置1h2h后,在(55士1)C培养(17士1)h 除去牛津杯 精确地测量所 产生的抑菌斑(精确到o 求出每组3个检定平板上5.0ug/m浓度的抑菌斑直径读数(B)与 mm 其他浓度标准液的抑菌斑直径读数的平均值(A) 再求出参考浓度(5.04g/mL)的所有36个抑菌斑直 径读数的平均值(B' 用3 36个 参考浓度抑菌斑直径的平均值(B')与每组中9个参考浓度抑菌斑直径 平均值(B)之差来校正其他各浓度标准工作液的抑菌斑读数的平均值(A' 以溶液浓度为横坐标,该溶液被校正后的抑菌斑的直径(A')为纵坐标,绘制标准曲线图或计算回 归方程 校正按式(1)计算 A'=B'一B十A 式中 A'被校正后的抑菌斑直径读数,单位为毫米(mm): B 标准对照溶液抑菌斑直径读数总平均值,单位为毫米(mm) 被校正溶液组内的标准对照溶液抑菌斑平均读数,单位为毫米(mm); 被校正溶液的抑菌斑直径的平均读数,单位为毫米(rmm). A 3.5.3测定 每份样液用三个检定平板,在每个平板上放置6个牛津杯,使牛津杯在半径为28mm的圆面上成 0"角间距 其中3个牛津杯滴加0.1nml样液,另3个滴加0.1mL参考浓度(5.004g/nmL.)的标准工 作液,样液与参考浓度标准工作液要间隔放置 将陶瓦盖盖好,于4C放置1h一2h后,在(55土1)C培 养(17士1)h 除去牛津杯 精确地测量所产生的抑菌斑的直径(精确到0.1mm) 校正后,求其平 均值 3.6结果计算 3.6.1如样液呈现抑菌圈直径小于12mm,即报告为“阴性” 如样液呈现抑菌圈直径平均值大于等于12mm,经校正后,从标准曲线上查出(或计算出)相应盐 霉素的浓度,再按式(2)计算试样中盐霉素含量 如测定结果为阳性,即所显抑菌圈直径平均值大于等于12mm,必要时,尚需进行确证试验(可用 生物自显影法,参见附录C),以证明抑菌物确系盐霉素 3.6.2饲料中盐霉素含量按式(2)计算 m 式中 -试样中盐霉索的含量,单位为毫克每千克(mg/kg); -从标准曲线上查出的试样液中盐霉素浓度,单位为毫克每千克(mg/kg); 稀释倍数; m -称取试样的质量,单位为克(g). 3.6.3平行测定结果用算术平均值表示,保留3位有效数字 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的测定值的绝对差值
GB/T20196一2006 盐霉素的含量<4.00×10mg/kg时,不超过算术平均值的15% 盐霉素的含量>4.00×10'mg/kg时,不超过算术平均值的10% 方法2;高效液相色谱仪柱前衍生化检验方法 原理 4，1 用甲醇提取试样中盐霉素,以2,4-二硝基苯阱(DNP)为衍生剂,应用高效液相色谱柱前衍生化法、 采用紫外检测器对饲料中的盐霉素进行测定 4.2试剂和材料 除非另有说明,仅使用分析纯试剂 4.2.1 水 GB/T6682,一级 4.2.2三氯乙酸溶液 c=500 0g/儿. 4.2.3甲醇 色谱纯 4.2.4衍生化试液 c=0.5mg/ml;称取50mg2,4二硝基苯耕置于100ml容量瓶中,用甲醇充分溶解后稀释至 刻度 4.2.5提取液 用甲醇与水(90十10,V+V)配制而成 4.2.6盐霉素标准溶液 4.2.6.1盐霉素标准贮备溶液 精确称取盐霉素钠标准品(含量94.1%)0.1063g,置于100ml容量瓶中,用甲醉溶解,稀释至刻 度,摇匀,其浓度为1004g/ml.,置于0C冰箱中,有效期二周 4.2.6.2盐霉素标准工作溶液 分别准确移取.0mL0.00mL标准贮备液(4.2.我.1)下10mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻 度,摇匀,其浓度分别为10.04g/mL.I00.04E/mL.,现配现用 4.2.7流动相 将1.5mL冰乙酸(优级纯)加人98.5mL水中,并按10190的比例和甲醉混合 用前超声或做其 他脱气处理 4.3仪器与设备 4.3.1实验室常用玻璃器皿 43.2振荡器,往复式 4.3.3旋转真空燕发器 4.3.4 离心机.不低于70og(900!/mm) 4.3.5微型混合器 可调微量移液器,D,Al-50L.l0儿一2o,L.30oAL~1o00,AL. 4.3.6 注3:可调微量移液器需经过校准 4.3.7高效液相色谱仪:配有四联泵、柱温箱、紫外(UV)或二极管阵列检测器,ODsC色谱柱(如粒 度4Am,长150mm,内径3.9mm). 试样的制备 按GB/T14699.1饲料采样方法采样,选取饲料样品至少500g,四分法缩减至少100g,磨碎,通过 0.28 84m孔筛,混匀,装人密闭容器中,避光低温保存备用
GB/T20196一2006 4.5分析步骤 4.5.1试液提取 4.5.1.1称取一定量试样(参见附录A),精确至0.0001g于250mL具塞三角瓶中,准确加人 00.0ml样品提取液(4.2.5),在往复振荡器上振荡1h,静置片刻,取上清液10ml于离心管中,以 1000g(3500r/min)离心10min 4.5.1.2如需将试液浓缩,根据提取液(4.5.1.1)中盐霉索预计浓度(依据标示量、称样量和提取液量 确定分取量,参见附录A)吸取一定量提取液(4.5.1.1)置于旋转燕发器中,减压至干,再加人700L 样 品提取液(4.2.5),使试液中盐霉素含量为20ug/mL100ug/mL 4.5.2试液衍生化 用可调微量移液器(4.3.6)准确吸取700L上清液于具螺口的离心管中,准确加人100L三氧乙 酸水溶液(4.2.2),盖紧后,在微型混合器上混旋20s,室温放置10. min,再准确加人200l二硝基苯阱 衍生化试液(4.2.4)盖紧,同样混旋20、后,置于55C水浴锅中反应30min后,取出,待冷却后进行 检测 如发现衍生化液混浊,需7000g(9000r/min)离心后,取上清液上机测定 4.5.3标液衍生化 用可调微量移液器(4.3.6)准确吸取10L20l,50L,100L、,200AL,300L、500l盐霉素 标准工作液(4.2.6.2)于具螺口的离心管中,用甲醉稀释至700AL,另设1个空白管加700L 甲醉作 对照,按4.5.2衍生化方法衍生 4.5.4测定 4.5.4.1高效液相色谱仪(HPLc)测定参数的设定 色谱柱oDsC柱,粒度4am,长150mm,内径3.9mm或性能类似的分析柱 柱温;30c 流动相同4.2.7,流速1.0mL/min 检测器;紫外(UV)或二极管阵列检测器 检测波长:392nm 进样量:l0L20l 4.5.4.2定性,定量测定 取适量的4.5.2获得的衍生化试液和相应浓度的4!.5.3衍生化标准工作液进行测定 以保留时间 和衍生液紫外光区特征光谱定性 以色谱峰面积积分值做单点或多点校准定量 4.6结果计算 4.6.1饲料中盐霉素含量按式(3)计算 P×VXe×V.×" 3 P×m×V×V 式中 试样中盐霉素的含量,单位为毫克每千克(mg/kg) -标准工作液衍生化液中(4.5.3)中盐霉素浓度,单位为毫克每千克(g/kg); 标准工作液衍生液峰面积值 -标准工作液衍生液进样体积,单位为微升L); 试样行生液峰面积值; 试样稻生液进样体积,单位为微升(aL) 试样体积,单位为毫升(mL) 参与衍生的试液体积(4.5.2),单位为毫升(mL) -稀释或浓缩倍数 -称取试样的质量,单位为克(g). m
GB/T20196一2006 4.6.2平行测定结果用算术平均值表示,保留3位有效数字 4.7重复性 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的测定值的绝对差值: -盐霉素的含量<4.00×10mg/kg时,不超过算术平均值的15%; 盐霉索的含量>4.00×10'mg/kg时,不超过算术平均值的10%
GB/T20196一2006 附 录 A 资料性附录 试样的称样量 给出饲料样品标示量、称样量及盐霉素提取液稀释度示例 见表A.1,表A.2 表A.1饲料样品标示量、称样量及盐霉素提取液稀释度(微生物检验方法) 提取液量中 检测预计 盐霉素标示量 称样量m 提取液量V 提取液稀释 饲料类别 盐霉素浓度 浓度 或浓缩倍数" g/kg ml g c/wg/ml 4g/ml 7000000 140 l0 14.0 预混合饲料 100 60 3000000 12.0 350000 17.5 17.5 浓缩饲料 100 150000 7.5 7.5 14 70000 配合饲料 l0 0.5 100 30000 饲料样品标示量、称样量及盐霉素提取液稀释度(HPLc 表A.2 注人HPLC预 提取液量中 盐霉素标示量 称样量" 提取液量V 提取液稀释 饲料类别 盐霉素浓度 计浓度 4g/kg ml 或浓缩倍数n c/ug/ml g/ml 70.0 l00000000 1.0 1000.0 l0.0 盐霉素预混剂 100,0 120000000 0.8 960.0 10.0 42.0 7000000 2.0 140.o 1.0 98.0 预混合饲料 100.0 3000000 4.0 120.o 1.0 84.0 350000 20.0 70.0 1.0 49.0 浓缩饲料 100.0 150000 21.0 20.0 30.0 70000 20.0 14.0 0,5 19.6 配合饲料 100.0 30000 20.0 0." 21.0
GB/T20196一2006 附录 规范性附录 培养基和试剂制备 B.1培养基I B.1.1成分 蛋白陈 5.0g 牛肉浸膏 1.0g 氯化钠 5.0g 酵母浸膏 2.0g 琼脂 15.0g 水 1000mL B.1.2制法 将上述各成分于水中加热溶解,调节pH值7.4士0.1,分装于试管中,于121C灭菌15min 制成 斜面备用 B.2培养基I B.2.1成分 胰蛋白陈 5.0g 葡萄糖 l， .0g 酵母浸膏 2.5g 琼脂 5.0g 1000mL 水 B.2.2制法 将上述各成分于水中加热溶解,调节pH值7.0士0.l,分装于锥形瓶中,于121C灭菌15n min B.3 生理盐水 称取8.5g氯化钠,溶于1L水中,于121C高压灭菌15 min
GB/T20196一2006 附录 C 规范性附录 微生物检验方法确证试验 原理 C.1 确证试验采用生物自显影法,用标准品作对照,求R，值,以确证样液中存在的抑菌物是否确实是 盐霉素 生物自显影法条件 C.2 c.2.1薄层板 硅胶Q/YT25785sG,5em×20em 使用前于110C活化2h. c.2.2点样量 20L.点状 c.2.3展开 在饱和槽内进行 c.2.4检测 将每个样液及标准溶液分别点在四块薄层板上;先于每块薄层板下端2cm处划一条基线;然后在 这条基线上分别点20L样液和2.0g/m盐霉素标准溶液,试液和标准溶液点相距2.5em 在展开 缸中用甲醇进行展开,直至溶剂前沿线距板顶端1.5cem处为止,取出薄层板,风干后备培养用 将薄层板水平置于高压灭菌的长方形培养皿中,在无菌条件下将已熔化并冷却至50C55C的生 物自显影用培养基均匀地喷在其表面上,然后用10mL上述接种芽抱菌悬液的培养基铺满整个薄 层板,保持水平,待其凝固,于(55士1)C培养(17士1)h 经过培养后,在薄层板上与盐霉素标准液产生抑菌圈的,R，值相同位置上,显现抑菌圈者即证明抑 菌物确是盐霉素