河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中九种糖皮质激素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中九种糖皮质激素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T22957一2008 河豚鱼鳗鱼及烤鳗中九种糖皮质激素 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determinationofninegluccorticoidsresiduesinfugu,eelandbakedeel LC-MIS-Msmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22957一2008 前 言 本标准的附录A、附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局 本标准主要起草人:刘永明、李金、吴艳萍、冯冠、曹彦忠、庞国芳
GB/T22957一2008 河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中九种糖皮质激素 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中泼尼松龙、泼尼松、氢化可的松、可的松、甲基泼尼松龙、倍他米 松,地塞米松,倍氯米松、醋酸氟氢可的松九种糖皮质激素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中九种糖皮质激素残留量的测定 本标准的方法检出限泼尼松龙、泼尼松、氢化可的松、,可的松、甲基泼尼松龙、倍他米松,地塞米松 为0.2g/kg;倍氯米松、醋酸氟氢可的松为1.0g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 GB/T6379.1一2004,1IsO5725-1l:1994,IDT GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,I1sO5725-2:1994,IDT GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,IsO36961987,MOD 原理 河豚鱼、鱼、烤鳗样品中加人无水硫酸钠,用乙酸乙酯提取,提取液浓缩后,经过硅胶固相萃取柱 净化,液相色谱-串联质谱仪测定,外标法定量 试剂和材料 水:GB/T6682,一级 4.2甲醇;色谱纯 乙睛:色谱纯 乙酸乙酯;色谱纯 4.5甲酸;优级纯 4.6正己烧:色谱纯 7 丙色谱纯 4.8丙解正己婉溶液;丙酮十正己熔(2十3) 量取200mlL丙酮与300mL正己炕混匀 4.9无水硫酸钠:分析纯 在650C马弗炉中灼烧6h,储存于干燥器中 4.10泼尼松龙(CAS:50-24-8).泼尼松(CAs53-03-2、氢化可的松(CAs:50-23-7)可的松(CAs53 06-5),甲基泼尼松龙(CAs;83-43-2),倍他米松(CAs378-44-9),地塞米松(CAs:50-02-2,倍氯米松 CAs:4419-39-0)醋酸氟氢可的松(CAS514-36-3)标准物质:纯度>98% 4.111.0 mg/mL标准储备溶液:分别准确称取适量的糖皮质激素标准物质,用甲醇溶解,分别配制成
GB/T22957一2008 1.0 mg/mL储备溶液 配成的标准储备液应在温度低于一20C冰箱中保存 4.125.04g/mL标准工作溶液;分别准确吸取适量的糖皮质激素标准储备溶液,用甲醉分别配制成 5.04g/mlL标准工作溶液 配成的标准工作溶液应在温度低于4C冰箱中保存 4.13混合标准工作溶液I:分别吸取适量的氢化可的松和可的松标准工作溶液,用甲醉配成浓度为 0.054g/mlL的混合标准工作溶液 此溶液应在温度低于4C冰箱中保存 测定样品使用时,用20% 乙睛溶液将混合标准工作溶液I配成不同浓度的的混合标准工作溶液 14混合标准工作溶液I;分别吸取适量的泼尼松龙、泼尼松,甲基泼尼松龙、,倍他米松,地塞米松,倍 氯米松、醋酸氟氢可的松标准工作溶液用甲醇配成泼尼松龙、泼尼松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米 松为0.054g/mL,倍氯米松,醋酸氟氢可的松为0.254g/mL的混合标准工作溶液 此溶液应在温度 低于4C冰箱中保存 4.15基质混合标准工作溶液;用空白样品提取液将混合标准工作溶液配成不同浓度的基质混合标 准工作溶液 此溶液应现用现配 CleanertSilica固相萃取柱或相当者:500mg,6mL 使用前用6mL正己婉预处理,保持柱体 16 湿润 4.17滤膜:0.2m. 仪器 51液相色谱-串联质谐仪;配有电喷雾离子源(ESI 5.2分析天平;感量0.1nmg和0.01g 5.3固相萃取真空装置 55 .4 真空泵;真空度应达到80kPa 5.5均质器 5.6振荡器 5.7高速冷冻离心机转速13000r/min 5.8旋转蒸发器 5.9氮气浓缩仪 10具塞塑料离心管50mL 5 5. .11样品管;10mL . .12梨形瓶:150ml 试样的制备与保存 试样的制备 从全部样品中取出有代表性样品约1kg,充分搅醉,混匀,均分成两份,分别装人洁净容器内 密 封作为试样注明标记 在抽样和制样的操作过程中,应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化 试样保存 将试样于一18C冷冻保存 测定步骤 7 提取 称取5g试样(精确到0.01g),置于50ml具塞塑料离心管中,加人l0g无水硫酸钠,加25mL 乙 CleanerSsiliea固相萃取柱是Agela公司产品的商品名称,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不是 表示对该产品的认可 如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T22957一2008 酸乙酯,用均质器均质1min,在振荡器中振荡20min,以10000r/min离心10min,取上清液至梨形瓶 中 再用25ml乙酸乙酯提取一次,合并上清液,用旋转蒸发器于45C水浴上减压燕发至近干,用 lml乙酸乙酯和5mlL正己烧溶解 7.2净化 将提取液移至经预处理的CleanertSiliea固相萃取柱中,用6ml正己婉洗涤梨形瓶和萃取柱,弃 去全部流出液 减压抽干1min,用6mL丙酮十正己炕(2十3)洗脱,收集洗脱液于10mL样品管中,用 氮气浓缩仪吹干,用1ml.20%乙晴溶液溶解残渣,以4000r/min离心5” ,上清液过0.2m滤膜， min 供液相色谱-串联质谱仪测定 7.3测定条件 7.3.1液相色谱参考条件 色谱柱.AtlanisCw,3Am,l50mmx×2.1mm(内径)或相当者; a D) 柱温:30C; 进样量;20L; c d)流动相,流速和梯度洗脱条件见表1 表1流动相、流速和梯度洗脱条件 时间/min 流速/(Al/min 乙睛/% 0.1%甲酸溶液/% 20 80 0.00 200 10.00 70 200 30 13.00 90 200 0 13.01 200 20 8o0 20.00 200 20 80 7.3.2质谱参考条件 a)离子源;电喷雾离子源(ESI); 扫描方式;负离子扫描; D e检测方式;多反应监测 d)气帘气压力:0.138MPa 雾化气压力:0.276MPa; e 辅助加热气压力;0.138MPa 离子源温度:500C; g h 定性离子对、定量离子对,去簇电压和碰撞能量见表2 表2糖皮质激素的定性离子对、定量离子对,去簇电压和碰撞能量 化合物中文名称化合物英文名称定性离子对(m/:定量离子对(m/2 去簇电压/V 碰撞能量/V 405/329 -30 25 泼尼松龙 prednisolone 405/329 405/359 -30 -15 403/327 -21 -19 泼尼松 prednisone 403/327 一19 -15 403/357 407/331 一25 氢化可的松 407/33 hydroeortisone 407/361 -15 一22 405/329 一24 405/329 可的松 cortisone 405/359 -22 -15
GB/T22957一2008 表2(续 化合物中文名称 化合物英文名称定性离子对(m/:定量离子对(m/ 去簇电压/V 碰撞能量/V 419/343 -32 -23 甲基泼尼松龙 methylprednisolone 419/343 419/373 一32 -16 437/361 一24 -25 倍他米松 betamethasone 437/361 5 437/391 -15 437/361 -24 25 437/361 地塞米松 dexamethasone 25 437/391 -15 453/377 2 -20 倍氯米松 453/377 beclomethasone 2 17 453/407 ludrocortisone 467/421 -28 -17 醋酸氟氢可的松 467/421 -28 -32 acetate 467/349 液相色谱-串联质谱测定 定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个子离子,在相同试验条件下,样品中待测物质的保留时间与混 合标准工作溶液的保留时间偏差在士2.5%之内;且样品谱图中各组分监测离子的相对丰度与浓度接近 的混合标准工作溶液谱图中对应的监测离子的相对丰度进行比较,偏差不超过表3规定的范围,则可判 定为样品中存在对应的待测物 表 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示 相对离子丰度K K>50 20GB/T22957一2008 结果计算 九种糖皮质激素残留量的测定结果按式(1)计算 1000 -xY X=G "* 式中: 试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(4g/kg); 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); -样品溶液最终定容体积,单位为毫升(mL); 样品溶液所代表最终试样的质量,单位为克g). N 计算结果应扣除空白值 精密度 9.1一般规定 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 9.2重复性 在重复性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,糖皮质激素添加浓 度范围及重复性方程见表5 表5添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克 重复性限" 化合物名称 添加浓度范围 再现性限R 一0.7782 泼尼松龙 0.25.0 R=0.1703十0.0319 lgr=0.8594lgm一 r=0,2100m一0.0006 lgR=1.0798l 泼尼松 Ig一0.6190 0.25.0 0.2~5.0 lgR=1.1142lgm一0.6614 氢化可的松 lgr=1.0962g朋一0.7226 可的松 0.2~5.0 lgr=0.9552lgm一0.7584 R=0.2366m一0.0041 甲基泼尼松龙 0.2~5.0 lgr=1.0621lgm一0.7187 lgR=0.9643lgm-0.6423 倍他米松 0.25.0 lgr=1.0686lgm一0.6899 lgR=l.1585lgm-0.6168 地塞米松 0.25.0 lgr=1.1217lgm一0,6900 gR=1.1882lgm-0.6229 倍氯米松 lg"=0.9993lgm一0.7222 1.0一25 lgR=0.8613lgm一0.4783 1.0~25 2m十0.1279 醋酸氟氢氨可的松 lgR=0.9292Igm一0.5915 r=0.1092刀n 注;m为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9.3再现性 在再现性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,糖皮质激素添加浓 度范围及再现性方程见表5
GB/T22957一2008 附 录 A 资料性附录 九种糖皮质激素的多反应监测(NM)色谱图 九种糖皮质激素的多反应监测MRM色谱图见图A.1 11.96 电 1,63 1.72 发 4000- 界2we 好2000 值 化 泼尼松龙 3200可的松 1600 1600 泼尼松 2400 1200 1200 800 1600 800 400 400 800 不百下6/min ;而 0G/minm 46/min 12,71 13,00 14.58 响 说 应400o 值 3200 1600甲基泼尼松龙 1600酷酸氟氢可的松 倍他米松 2400 120o 1200 800 1600 800 400 400l 800 o3 0s 246804I6/min 268046/min 百;D百min 13.43 1.,79 13.10 蔑aun 样4oo 值 霍 240o倍氧米松 3200地塞米松 160o氧化可的松 1800 1200 2400 800 200 1600l 600 400 800 28246/minm 百百/n 046/mmin 图A.1九种糖皮质激素的多反应监测(MRM1)色谱图
GB/T22957一2008 B 附 录 资料性附录 回 收 率 本方法九种糖皮质激素的添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B.1 表B.1九种糖皮质激素添加浓度及其平均回收率的试验数据 化合物名称 加浓度/4g/kg 平均回收率/% 0." 83.4 0.4 87.1 泼尼松龙 1.0 93.7 5.0 79.4 92.5 0.2 0.4 84.5 泼尼松 1.0 82.0 5.0 83 w 0.4 100.1 氢化可的松 1.0 100." 5.0 91.0 96.O O.? o. 89." 可的松 l.0 98.5 5.0 8A.4 0.2 84.7 0.4 87.3 甲基泼尼松龙 9.9 1.0 5.0 0 0.2 92.5 94.5 0.4 倍他米松 1.0 84.9 5.0 60 0.2 89. 0." 91.8 地塞米松 82.9 1.0 5.0 78. 89.4 1.0 20" 86.5 倍氯米松 5.0 81. .3 35 82.0 78.O 1.0 77.5 2.0 醋酸叙氢可的松 5.0 80.5 25 81.4