琉球球壳蜗牛检疫鉴定方法

琉球球壳蜗牛检疫鉴定方法

国家标准 GB/T33116一2016 琉球球壳蜗牛检疫鉴定方法 DetectionandidentifieationofAetstadespectaGray,1839 2016-10-13发布 2017-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T33116一2016 琉球球壳蜗牛检疫鉴定方法 范围 本标准规定了琉球球壳蜗牛Ae (Gray,1839)的检疫鉴定方法 cuustaaespecla 本标准适用于琉球球壳蜗牛的检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/T3067软体动物常规检疫规范 术语和定义 SN/T3067界定的以及下列术语和定义适用于本文件 3.1 膜朦epiphragmm 蜗牛分泌的一种与壳口同样大小和形状的乳白色不透明黏液膜,用以封闭壳口 3.2 阴茎penis 蜗牛雄性生殖器官 洼阴茎系统一般由阴茎,阴茎本体,阴牵引肌和鞭状体组成 3.3 矢囊dartsaek 蜗牛雌性生殖系统中一个藏有1枚或多枚骨针的肌肉质的囊状结构 3.4 恋矢 lovedart 矢囊中钙质或壳质的骨针,为蜗牛交配时刺激器官 注恋矢的质地和形状常用于分类 3.5 受精囊bursacopulhatrix 蜗牛的受精器官,由受精囊和受精囊柄组成 注，其中受精囊柄的形态和有无分支常用于分类鉴定 基本信息 yI839),其亚种有.A.depecta.depeta.(Grny,I839);A.de:/peea 学名:Acustadespeca(Gra Pilsbry8&HIirase siebolianaPfeiffer,1850 .1904);A.deperas praelenuis GnyI89.A.deypwia ,1839;EuulotasieboldianaPfeiffer,l1905; 异名:Helirdesecta Sowerby,
GB/T33116一2016 Plsbry ikaiensis EulotakikaiensiPiIsbry,1902;A.desectaikiensis y& Hirase,1904);A.desecta (Plsbry.1902) snail:Koreanroundsnail 英文名:RRyukyuround (Gray,1839),在分类上属于软体动物门Mollusca,腹足纲 分类地位;琉球球壳蜗牛A.des/ecta Gastropoda,柄眼目stylommatophora,巴蜗牛科Bradybaenidae,球壳蜗牛属AcustaAIbers,1860 琉 球球壳蜗牛的近似种有灰球壳蜗牛A.raidaBenson,1842)、红粉缘球壳蜗牛A.tourannensis(Sou leyet,1842) 方法原理 琉球球壳蜗牛昼伏夜出,常隐藏在人们难以发现的地方,易于传播 其传播特点是不需要特定的寄 主,凡接触过地面的物品都可传播 传播方式和途径是确定现场检疫方式的依据 贝壳形态,软体解剖 和分子特征是实验室鉴定的主要依据 器具和试剂 6.1 器具 体视显微镜、放大镜、手电筒、塑料自封袋、广口标本瓶、4mm孔径土壤筛、小铁铲、游标卡尺、白瓷 盘,培养皿、慑子、剪刀、显微子、显微剪刀、微针、解剖蜡盘、标签、移液枪、微型离心机、PCR仪、 1.5mL离心管、0.2mLPCR反应管、恒温金属浴 6.2试剂 75%乙醉,无水乙醇,硫酸镁,动物基因组DNA提取试剂盒,PCR反应液,ddH,(O 现场检测 对来自疫区(参见附录A)的运输工具和货物实施重点查验 仔细检查运输工具废塑料、木质包装 箱、苗木、水果、蔬菜、花卉,未经加工的植物性材料等是否有蜗牛附着其上,琉球球壳蜗牛昼伏夜出,尤 其要注意阴暗蔽光处的检查,用手电筒仔细寻找蜗牛的行迹 琉球球壳蜗牛爬行过后,会留下银灰色的 丝带状黏液痕迹,这是判定是否有蜗牛污染的重要依据 发现蜗牛标本,随时装人塑料自封袋或标本 瓶,带回实验室做进一步的检验鉴定 发现盆景等携带土壤或其他细碎衬垫材料时,需过筛检查是否有 卵或幼螺 实验室鉴定 8.1测量观察和软体解剖 用游标卡尺测量蜗牛贝壳的壳高和壳宽、卵粒直径 用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵和 螺的形态特征 将闷杀(见10.1)处理后的标本,参照SN/T3067解剖软体,分离出生殖系统
GB/T33116一2016 8.2球蜗牛属AestaAIbers,1860鉴定特征 贝壳圆球形,有脐孔,体螺层特大,膨胀,胚螺层常光滑,口缘呈椭圆形,口唇简单,锋利 阴道上的 矢囊十分长,恋矢石灰质,无鞭状体 8.3琉球球壳蜗牛A.despeetaGray,1839)鉴定特征 8.3.1卵 卵粒圆形白色,直径20mm左右 8.3.2贝壳 8.3.2.1成螺 贝壳中等大小,壳质薄,但坚固,呈圆球形 有5个一6个螺层,前几个螺层均匀增长,略凸出,螺旋 部低矮,呈矮圆锥形 体螺层增长迅速,下部特别膨大,呈弧形 壳顶钝,缝合线深 壳面为褐黄色或淡 褐色或赤褐色,具有细致而稠密的生长线和较粗的皱纹 壳口宽大圆形,口缘简单,不外折,锋利,内唇 贴覆于体螺层上形成细薄的淡白色畔骶部,轴缘外折,略遮盖脐孔 挤孔狭小,呈孔穴状 壳高 17.5mm~21.0mm,壳宽21.0mm~23.0mm 参见附录B中图B.1 本种有三个亚种;琉球球壳蜗牛指名亚种A.despectadespecta(Gray,1839);锡伯琉球球壳蜗牛 & A.despectasieboldianaPfeffer，1850);镶边琉球球壳蜗牛A.despectapruelenuiPilsbry Hirase,1904) 各亚种之间在形态上基本一致,略有微小差异 参见附录C中表C,1 8.3.2.2幼螺 幼螺贝壳较小,壳质薄,透明,易碎,形态特征与成螺贝壳基本一致 8.3.3螺体 动物软体多为淡灰色到茶色,螺体色泽变化较大，一般透过贝壳可以看到动物外套膜的形态 触角 颜色明显比腹足为深 参见图B.2 8.3.4生殖系统 输卵管短、粗大 阴道有部分插人到矢囊,远端稍呈球形到扁球形 副矢囊被压扁成弧状,中间有 两枝黏液腺,分叉成葡萄状 输精管和阴茎本体之间的界限不明显 阴茎牵引肌的基部稍变粗 阴茎 鞘明显比阴茎牵引肌肥厚,粗细均匀 受精囊顶部稍肥厚,其后逐渐变细 受精囊呈小乳头状 参 见图B.3 8.3.5co基因序列鉴定 按附录D方法提取DNA、PCR扩增和双向测序,将所测序列与已知琉球球壳蜗牛的cO1基因序 列(Genbank登录号为AB852623.1)进行比对,相似度一般应>92% 参见附录D 结果评定 以贝壳形态为基本鉴定依据,螺体和生殖系统解剖形态为辅助鉴定特征,并注意与近似种鉴别(参 见表C.2),符合8.3.2或同时符合8.3.2,8.3.3.8.3.4形态特征的蜗牛鉴定为琉球球壳蜗牛A.desprecta ,1939) 单独查获的卵粒符合8.3.1形态特征,应通过孵化和饲养实验(参见SN/T3067),做进 Gnmy
GB/T33116一2016 -步的鉴定 符合8.3.5作为前期初筛或最终鉴定结果的分子佐证 10 标本处理和保存 10.1 标本处理 将蜗牛置于盛满水的瓶中,盖上瓶盖,进行闷杀,蜗牛在慢慢窒息的死亡过程中,逐渐伸展身体;或 逐渐加人少量硫酸镁,进行麻醉闷杀 将闷杀后伸展的蜗牛标本置于无水乙醉中浸泡1d一2d,然后在75%乙醉溶液中固定,每隔1d 2d换1次乙醇溶液,共换3次一4次,便可长期保存于75%乙醇溶液中 10.2标本保存 经处理后的标本,至少妥善保存6个月,并注明时间、产地、寄主,采集人等信息
GB/T33116一2016 附 录A 资料性附录 琉球球壳蜗牛寄主,地理分布及其他信息 A.1寄主植物 杂食性,以各种绿色植物为食 幼螺以腐殖质、植物的幼苗和嫩芽为食;成螺取食各种绿色植物的 茎,叶和果实,喜食蔬菜和花卉等园艺作物 A.2地理分布 日本、朝鲜,缅甸、东帝泣、前苏联,美国(关岛(台湾) A.3生物学习性与危害性 Grny,1939)是我国颁布的进境植物检疫性有害生物 该蜗牛有 琉球球壳蜗牛Ae cusladlesecla 明显的夏眠和冬眠习性,常以蜡状膜封闭壳口越冬越夏 当环境条件不利时,尽管不在休眠季节,该 螺也会分泌黏液形成白色的膜靡封住壳口,以抵御外界不良环境,该蜗牛的这一习性决定了它可在无水 分和食物的情况下长时间远距离传播 琉球球壳蜗牛是一种重要的农业、园艺有害生物,常危害粮、棉、 麻,蔬菜、豆类等农作物以及桑,果树、花卉,烟草等经济作物 该蜗牛不但直接危害作物,而且蜗牛爬行 过后留下的白色黏液痕迹,大大降低了水果蔬菜的商品价值,同时该蜗牛可传播人畜共患寄生虫病,影 响人类健康和畜牧生产
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GB/T33116一2016 附 录 D 资料性附录 琉球球壳蜗牛co基因辅助鉴定方法 D.1DNA提取 取适量腹足肌肉,用sDs方法或动物基因组DNA试剂盒方法提取DNA D.2co1基因引物 LCO14905'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3' HcO2198;5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 D.3反应体系 反应体系为20AL;其中DNA模板2aL,Lco1490(10mol/L0.5pL,Hc02198(10Amol/L) .,2×MasterMix10AL,ddH.O7AlL 0,5A. D,4CR扩增条件 nmin,4C 945min;94C50s,45C30s,72C50s,30个35个循环;72101 D.5测序 将PCR扩增样品送有资质的生物技术公司测序 D.6 比对鉴定 将双向测序获得的600bp一700bp长度的DNA序列片段，经软件拼接和人工校对后,与已知琉球 球壳蜗牛的co1基因序列(Genbank登录号为AB852623.1)进行比对,相似度>92%的待鉴样品确定 为琉球球壳蜗牛的疑似样品

琉球球壳蜗牛检疫鉴定方法GB/T33116-2016

琉球球壳蜗牛（学名：Ovachlamys fulgens）是一种来自日本的陆生蜗牛，因其外表美丽而备受喜爱。然而，由于它们广泛存在于普通土壤中，并且容易危害农作物，因此被列入检疫范围。

针对琉球球壳蜗牛的检疫工作，国家制定了GB/T33116-2016标准，明确了检疫鉴定方法。该标准主要包括样品收集、前处理、显微镜检查和PCR技术检测四个方面。

首先，在样品收集方面，需要在检疫点周围地区进行采样，并留意可能存在的蜗牛及其卵、粪便等。采样时应注意保持样品完整性和干燥状态。

在前处理方面，主要是对样品进行筛选和识别。样品先要经过筛孔大小为2mm的筛子筛选掉杂质，然后将其中较大的蜗牛分离出来，进行形态学鉴定。

接下来是显微镜检查环节，通过显微镜观察琉球球壳蜗牛的外部特征，如头部、足部、触角等形态，并结合颜色、纹理等特征进行鉴定。

最后是PCR技术检测，如果显微镜检查结果不确定，就需要进行基因检测以确保准确性。该方法通过提取DNA进行扩增并与参考标准比对，从而确定是否存在琉球球壳蜗牛。

总之，GB/T33116-2016标准提供了科学、标准化的琉球球壳蜗牛检疫鉴定方法，对于保护农业生产和维护生态平衡具有重要作用。

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