GB/T18646-2018
动物布鲁氏菌病诊断技术
Diagnostictechniquesforanimalbrucellosis
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2018-09-01
- 文件格式PDF
- 文本页数40页
- 文件大小2.91M
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动物布鲁氏菌病诊断技术
国家标准 GB/T18646一2018 代替GB/T186462002 动物布鲁氏菌病诊断技术 Diugnstictechniquesforamimalbrueelosis 2018-02-06发布 2018-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T18646一2018 引 言 布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌属细菌感染导致人兽共患的传染病,在全世界范围内严重威 胁人类健康并影响畜牧业发展
布鲁氏菌属包括羊种布鲁氏菌(B. 牛种布鲁氏菌(B.abor .1elites7s tuus ),猪种布鲁氏菌(B. Suis ),绵羊附睾种布鲁氏菌(B.a .s ,犬种布鲁氏菌(B. .canis ,沙林鼠种布鲁氏 菌(B. 、鲸种布鲁氏菌B. 、鳍种布鲁氏菌B.pinnil pedialis和田鼠种布鲁氏菌 ，neoto1e ceti B.microti 及新报道的B.inp加i ,其中动物布病主要是由羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌和猪种布 nat， 鲁氏菌感染羊、牛和猪等动物呈急性或慢性经过,是人布病的主要传染来源
其临床主要特征是生殖器 官和胎膜发炎,母畜流产,乳腺炎、不育和各种组织(如睾丸、关节)的炎症
世界动物卫生组织[world OrganizationforAnimalHealth(英),OfficeIntentionaldesEpizootic(法),OIE将布病列为法定报告 的传染病,我国《一、二、三类动物疫病病种名录》规定布病为多种动物共患的二类动物疫病
本标准参考了oIEM陆生动物诊断试验和疫苗手册》转化了其相关的布病诊断方法并引人到本标 本标准修订了原有血清学诊断方法,引人了ELISA诊断方法,建立了我国微量凝集反应,补充了 准中
病原学和分子生物学诊断方法,不仅适用于我国布鲁氏菌病诊断需求,也达到了国际诊断水平
GB/T18646一2018 动物布鲁氏菌病诊断技术 范围 本标准规定了动物布鲁氏菌病的临床诊断、血清学和病原学诊断的技术方法、操作程序和判定 标准
本标准规定的流行特点、临床症状、病理变化适用于动物布鲁氏菌病的临床诊断
虎红平板凝集试验和间接酶联免疫吸附试验,适用于动物布鲁氏菌病的初筛试验; 乳牛全乳环状试验,适用于泌乳母牛布鲁氏菌病的初筛试验 试管凝集试验、补体结合试验和竞争酶联免疫吸附试验适用于牛种羊种和猪种布鲁氏菌病的血清 学确诊 病原的显微镜检查、分离培养适用于布鲁氏菌病的病原学初步诊断;病原的鉴定和PCR试验适用 于动物布鲁氏菌病的病原学确诊
本标准规定的乳牛全乳环状试验,不适用于检测患乳房炎及其他乳房疾病母牛的乳、初乳、脱脂乳 和煮沸过的乳,也不适用于腐败、变酸和冻结过的乳
本标准规定的虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验,不适用于犬种和绵羊附睾种布鲁 氏菌的检测
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB/T18088出人境动物检疫采样 GB19489一2008实验室生物安全通用要求 缩略语 下列缩略语适用于本文件
OIE世界动物卫生组织(worldOrganizationforAnimalHealth(英),Officelntentionm naldesEpi zootic(法) Test RBT虎红平板凝集试验(RoeBhene MRT乳牛全乳环状试验(MilkRingTest) nationTest SAT试管凝集试验(SerumAgglutinm CF:T补体结合试验(ComplementFixationTest) iELISA间接酶联免疫吸附试验(IndireetEnzymeLinkedlmmunosorbentAssay) eELISA竞争酶联免疫吸附试验(CompetitiveEnzymeLinkedlmmunosorbentAssay) ChainReaction PCR聚合酶链式反应(Polymerase DNA脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid) NTPs脱氧核苷三磷酸(DeoxyRibonucleosideTriphosphate) TBE三胫甲基氨基甲炕棚酸乙二胺四乙酸缓冲液(TrisBorieAcidEDTA
GB/T18646一2018 HRP辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase 诊断方法 4.1流行特点 多种动物对布鲁氏菌易感羊牛猪的易感性最强
母畜比公畜易感,成年畜比幼年畜易感
动物 的易感性随着性成熟年龄接近而增高,在母畜中,第一次妖娠母畜发病较多
患病和带菌动物是主要传染源,尤其是感染的妊娠母畜.在流产或分娩时将大量的布鲁氏菌随着胎 儿、胎水和胎衣排出,流产后的阴道分泌物和乳汁中都含有布鲁氏菌 布鲁氏菌病的传播途径主要是消化道,也可通过皮肤、黏膜、,交配等感染,蟀的叮咬可传播本病
布鲁氏菌病呈现明显的接触传播特征,通过直接接触或间接接触均可造成传播,在牧区或农牧区多 发,疾病的发生不具有明显的季节性,在有感染的群体内呈扩散传播特点
一般为散发,羊种布鲁氏菌 病可呈地方流行性发生
4.2临床症状 潜伏期一般为l4d180d. 显著症状是妊娠母畜发生流产,流产后可能发生胎衣滞留和子宫内膜炎,从阴道流出污秽不洁、恶 臭的分泌物
新发病的畜群流产较多;老疫区畜群发生流产的较少,但发生子宫内膜炎、乳房炎,关节 炎、局部脓肿、胎衣滞留,久配不孕的较多
公畜往往发生睾丸炎,、附睾炎或关节炎
4.3病理变化 警示对本病剖检采样过程当中应当防止病原微生物扩散和感染 主要病变为妊娠或流产母畜子宫内膜和胎衣的炎性浸润、渗出、出血及坏死,有的可见关节炎
胎 儿主要呈败血症病变,浆膜和黏膜有出血点和出血斑,皮下结缔组织发生浆液性、出血性炎症
组织学检查可见脾淋巴结肝、肾等器官形成特征性肉芽肿
4.4虎红平板凝集试验(RBr) 4.4.1器材 微量移液器,灭菌移液器吸头、牙签或混匀棒,计时器,洁净的玻璃板(其上划分成4cenm'的方格) 4.4.2试剂 商品化的布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原,布鲁氏菌标准阳性血清和布鲁氏菌标准阴性血清 4.4.3操作方法 4.4.3.1按常规方法采集和分离受检血清
4.4.3.2将受检血清、布鲁氏菌标准阴、阳性血清和抗原从冰箱取出平衡至室温
4.4.3.3涡旋混匀血清和抗原,分别吸取25L的血清和抗原加于玻璃板4cnm方格内的两侧
用灭菌牙签或混匀棒快速混匀血清和抗原,涂成2cm直径的圆形,混匀后4min,在自然光下 4.4.3.4 观察 4.4.3.5试验应设标准阴、阳性血清对照
4.4.4结果判定 4.4.4.1 在标准阴性血清不出现凝集、标准阳性血清出现凝集时,试验成立,方可对受检血清进行判定
GB/T18646一2018 4.4.4.2出现肉眼可见凝集现象者判定为阳性(十),无凝集现象且反应混合液呈均匀粉红色者判定为 阴性(一 4.5乳牛全乳环状试验(MIRT 4.5.1器材 微量移液器,灭菌移液器吸头内径为1emm的灭菌试管
4.5.2试剂 商品化布鲁氏菌全乳环状试验抗原
4.5.3乳样 受检乳样应为新鲜的全乳,或混合奶;采乳样时应将乳牛的乳房用温水洗净、擦干,然后将乳汁前 三把乳不作为检测用)挤人洁净的器皿中;采集的乳样夏季时应于当日内检测
4.5.4操作方法 4.5.4.1将乳样和布鲁氏菌全乳环状试验抗原平衡至室温
4.5.4.2取乳样1000AL,加于灭菌凝集试管内
4.5.4.3取充分振荡混合均匀的布鲁氏菌全乳环状试验抗原50L加人乳样中充分混匀
4.5.4.4置37C38C水浴中孵育60min. 4.5.4.5孵育后取出试管勿使振荡,立即进行判定
4.5.5结果判定 结果判定如下: a 强阳性反应(十十十),乳柱上层乳脂形成明显红色的环带,乳柱白色,临界分明 b) 阳性反应(十十),乳脂层的环带呈红色,但不显著乳柱略带颜色; 弱阳性反应(十),乳脂层的环带颜色较浅,但比乳柱颜色略深 c d 疑似反应(士),乳脂层的环带颜色不明显,与乳柱分界不清,乳柱不褪色; 阴性反应(一),乳柱上层无任何变化,乳柱颜色均匀
ee 4.6试管凝集试验(SAT) 4.6.1微量法 4.6.1.1 器材 96孔U型聚苯乙烯板、微量移液器,灭菌移液器吸头、塑料薄膜,湿盒、振荡器,适宜的稀释用器皿 及温箱(37C士1). 4.6.1.2试剂 商品化试管凝集试验抗原,布鲁氏菌标准阳性血清、布鲁氏菌标准阴性血清、稀释液为含0.5%石炭 酸的生理盐水(用于检验牛血清时稀释血清和抗原)或含0.5%石炭酸的10%氯化钠溶液(用于检验羊 血清时稀释血清和抗原). 4.6.1.3操作方法 4.6.1.3.1按常规方法采集和分离受检血清
GB/T18646一2018 4.6.1.3.2受检血清的稀释 以羊血清为例,每份血清用4个连续的U型孔 a 在聚苯乙烯反应板的第1孔加184L稀释液 b e 第2孔4孔各加人100L稀释液; 用微量移液器取受检血清16L;加人第1孔,并混匀 d 从第1孔吸取100AL混合液加人第2孔充分混匀,如此倍比稀释至第4孔,从第4孔弃去混 e 合液100L 稀释完毕,从第1至第4孔的血清稀释度分别为1:12.5、1l:25、1l:50和1:100 f) 牛血清稀释法与上述基本一致,差异是第1孔加192L稀释液和8l.受检血清,其稀释度分 g 别为1:25、1:50、1:100和1:200 4.6.1.3.3分别取按说明书要求稀释的抗原100L加人上述各孔稀释好的血清中,并振荡混匀,羊的 血清稀释度则依次变为1:25、1:50,1;100和1;200,牛的血清稀释度则依次变为1:50,1;100、 1:200和1:400
将加完样的聚装乙婚反应板各孔用塑料薄膜严" 4.6.1.3.4 "密封盖后,放湿盒内置温箱37C士1)孵 育18h~24h,取出检查并记录结果
4.6.1.3.5每次试验均应设阳性血清对照阴性血清对照和抗原对照,即 a 阴性血清对照:冻干阴性血清按说明书稀释到规定容量后,对照试验中稀释和加抗原的方法与 受检血清相同; b 阳性血清对照:冻干阳性血清按说明书稀释到规定容量后,对照试验中稀释和加抗原的方法与 受检血清相同 抗原对照;抗原按说明书稀释到规定容量,取100AL,再加100AL稀释液,观察抗原是否有自 凝现象
4.6.1.4结果判定及处理 4.6.1.4.1凝集反应程度 凝集反应程度分为5个等级,分别记为“十十十十”“十十十"“十十"“+"一",按以下说明判定: 十十十十;菌体完全凝集,1孔4孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底; a b) 十十十;菌体几乎完全凝集,1孔3孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底,第4孔孔底呈现白色 点状 十十;菌体凝集显著,1孔2孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底,3孔4孔孔底呈现白色点状 c d ;凝集物有沉淀,第1孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底,2孔一4孔孔底呈现白色点状; 人 ;无凝集,1孔4孔孔底均呈现白色点状
e 4.6.1.4.2结果判定 当阳性血清出现完全凝集(十十十十),而阴性血清无凝集(一),抗原对照无自凝(一)现象时,试验 成立,按以下对试验结果判定 a 受检血清出现“十十”及以上凝集现象时,判定为阳性; b)受检血清出现“+”凝集现象时,判定为可疑; c 受检血清出现“一”时,判定为阴性
4.6.1.4.3可疑结果的处理 试验结果可疑牛、羊经30d后采血重检,如果仍为可疑,该家畜判为阳性
GB/T18646一2018 4.6.2常量法 4.6.2.1 器材 玻璃试管,试管架、移液器、灭菌移液器吸头及温箱(37C士1C)
4.6.2.2试剂 商品化布鲁氏菌试管凝集试验抗原、布鲁氏菌标准阳性血清和布鲁氏菌标准阴性血清、稀释液为含 0.5%石炭酸的生理盐水和(或)含0.5%石炭酸的10%氧化钠溶液(用于检验羊血清时稀释血清和抗 原 4.6.2.3操作方法 4.6.2.3.1按常规方法采集和分离受检血清
4.6.2.3.2受检血清的稀释 以羊和猪血清为例,每份血清用4支凝集试管 a 第1管标记检验编码后加920L稀释液 b c 第2管一4管各加人500L稀释液 然后取受检血清80L..加人第1管内,并混合均匀 d 取500l混合液加人第2管并充分混匀,如此倍比稀释至第4管,从第4管弃去混匀液 5004l; 稀释完毕,从第1至第4管的血清稀释度分别为1;12.5、1:25、1:50和1100; f 牛、马、鹿、骆驼血清稀释法与上述基本一致,差异是第一管加960L稀释液和40AL受检血 g 清,其稀释度分别为1:25、1:50、1:100和1;200. 4.6.2.3.3将按说明书要求稀释的抗原液500L分别加人已稀释好的各管血清中,并振摇均匀,羊和 猪的血清稀释度则依次变为1:25、1:50、1:100和1:200,牛、马和骆驼的血清稀释度则依次变为 ;50、1:100、1:200和1:400. 大规模检疫时也可只用2个血清稀释度(加抗原后的终稀释度),即牛、马、鹿、骆驼用1:50和 1:100，猪,山羊、绵羊和犬用1:25和1:50
4.6.2.3.4每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照,即 阴性血清对照;冻干阴性血清按说明书稀释到规定容量后,对照试验中稀释和加抗原的方法与 a 受检血清相同; 阳性血清对照;冻干阳性血清按说明书稀释到规定容量后,对照试验中稀释和加抗原的方法与 b 受检血清相同; 抗原对照;按说明书要求稀释抗原液500L,再加500L.稀释液,观察抗原是否有自凝现象
4.6.2.3.5将加样后的试管置温箱(37C士1)孵育18h24h,取出检查并记录结果
4.6.2.4结果判定及处理 4.6.2.4.1凝集反应程度 十十十”“十十+” 凝集反应程度应根据参照比浊管制备方法见附录A)来判读,分别记为“十 “十十”“十”“一”,按以下说明判定 十十十十菌体完全凝集,100%下沉,上层液体100%清亮 a b 十十十菌体几乎完全凝集，上层液体75%清亮; 十十菌体凝集显著,液体50%清亮;
GB/T18646一2018 d 有凝集物沉淀,液体25%清亮 十 e 无凝集物,液体均匀混浊
4.6.2.4.2试验成立条件及结果判定 当阳性对照血清出现完全凝集(十十十十),阴性对照血清无凝集(一),抗原对照无自凝(一)现象 时,试验成立,可对结果进行如下判定 牛、马鹿和骆驼1t10血清稀释度,猪.山羊,绵羊和犬150血清稀释度,出现"十十"及以 a 上凝集现象时,判定为阳性; b) 牛、马、鹿、骆驼1:50血清稀释度,猪、山羊、,绵羊和犬1;25血清稀释度,出现“十十”以上凝 集现象时,判定为可疑
4.6.2.4.3结果处理 试验结果可疑的家畜经30d后采血重检,如果仍为可疑,该牛,羊判为阳性
猪和马经重检仍保持 可疑水平,而农场的牲畜没有临床症状和大批阳性患畜出现,该畜判为阴性
猪血清偶有非特异性反应,应结合流行病学调查判定,必要时配合补体结合试验和鉴别诊断,排除 耶森氏菌交叉凝集反应
4.7补体结合试验(CFT) 4.7.1微量法 4.7.1.1 器材 96孔聚苯乙烯板、微量移液器,灭菌移液器吸头、离心机、稀释用器皿、温控范围为37C38丫和 54~64C水浴锅、计时器 4.7.1.2试剂及其制备 4.7.1.2.1稀释液 巴比妥缓冲液(pH7.2),配制方法见附录B 4.7.1.2.2受检血清 其采集和处理见附录B 4.7.1.2.3绵羊红细胞悬液 采取成年公绵羊血,按常规方法脱纤,洗涤、离心,用稀释液洗涤至上清无色为止,最后一次以200r/min 离心沉淀10min,取下沉的红细胞沉积物,以稀释液配制成2.5%红细胞悬液(2.5mL/100mL)
4.7.1.2.4商品化布鲁氏菌补体结合试验抗原,布鲁氏菌标准阳性血清,布鲁氏菌标准阴性血清 商品化布鲁氏菌补体结合试验抗原在有效期内按说明书稀释，稀释前需震荡混匀
4.7.1.2.5商品化溶血素 商品化溶血素在有效期内根据标示效价使用,对每批次溶血素都需要进行效价测定,方法见附录 将100%溶血的最高稀释度所用溶血素作为一个单位溶血素工作效价,试验中用2倍溶血素工作 效价
GB/T18646一2018 4.7.1.2.6商品化冻干补体 除使用商品化冻干补体外,也可使用新鲜豚鼠血清作为补体
补体制备及效价测定方法见附录D
个单位体积的标准红细胞悬液中50%红细胞发生溶解的补体量为一个补体单位,试验中用6倍补体 工作效价
4.7.1.3操作方法 4.7.1.3.1受检血清的前处理 按常规方法采集,分离和灭能受检血清,见附录B 4.7.1.3.2血清样品稀释 96孔板第1,2排作为血清抗补体对照,血清稀释度为1/2、1/4;从第3排到第8排血清样品稀释度 分别为1/2,1/4,1/8,1/16,1/32、1/64,按如下步骤操作 第1排每孔分别加50aL稀释液,第2、4、5、6、7,8排每孔分别加稀释液25aL; aa b 第1排每孔加50L灭能血清,混匀后吸取25AL加人其后的第2排孔,混匀后弃去25AL 从第1排孔混匀液体中先后各吸取25AL分别加人同列的第3、4排孔,混匀 c d)从第4排起倍比稀释,即从第4排孔吸取液体25AL到同列第5排孔,混匀,以此类推到第 8排 第8排孔吸取25L液体弃去
4.7.1.3.3加抗原 除第1、2排外,上述每孔分别加工作量抗原25AL 4.7.1.3.4加补体 上述每孔分别加工作量补体25L,轻轻混匀,置4C孵育过夜或37C孵育30min. 4.7.1.3.5制备致敏红细胞 将23%红细胞及游血素等体积混匀至室温0 min
4.7.1.3.6复温孵育 将4.7.1.3.4中孵育过夜的96孔板从冰箱取出置37C孵育10" mln
4.7.1.3.7加致敏红细胞 上述每孔加人50!L致敏红细胞,轻轻混匀,37C孵育30" min
4.7.1.3.8细胞沉降 室温300片离心5min10min或者在4C放置2h~3h让细胞自然沉降,观察判定
4.7.1.3.9设立对照及主试验各要素的添加 每次试验需设阳性血清,阴性血清、抗原、致敏红细胞和补体对照
主试验各要素添加量和顺序如
GB/T18646一2018 表1所示
表1布鲁氏菌病补体结合试验的主试验 单位为微升 受检血消 阳性血消 阴性血清 血清 对照管 阳性血清 阴性血清 受检血清 抗补体对照 抗补体对照 抗补体对照 致敏 血清稀释度1/2~1/641/2~1/41/21/641/2~1/4 1/2~1/4 补体 1/21/64 抗原 红细胞 血清加人量 25 25 25 25 25 25 25 25 75 稀释液 25 25 50 o 25 25 抗原 25 25 25 25 25 25 工作量补体 25 25 25 25 轻轻混匀后,置37孵育30min或4C孵育过夜(以4C孵育过夜为例 你 二天;制备致敏红细胞将提前配好的2.5%红细胞和溶血素(分别储存在冰箱)等体积混匀,置室温 10min l0min 后,将96孔板从4C冰箱取出,置37C孵育10min(保证致敏红细胞置于室温201 min 50 50 50 50 致敏红细胞 50 50 50 50 50 轻轻混匀,37"C孵育30min 300从室温离心5min~10min或4C放置2h~3h让细胞自然沉降 4.7.1.4结果判定 4.7.1.4.1试验成立条件:阴性血清对照阴性血清抗补体对照、阳性血清的抗补体对照、抗原对照和补 体对照呈完全溶血反应,致敏红细胞对照呈完全抑制溶血
4.7.1.4.2上述对照正确无误后即可对受检血清进行判定
受检血清的判定参照溶血标准比色记录结 果,溶血标准比色孔的制备方法见附录E
4.7.1.4.3按表2判定,溶血抑制程度>20IU/mL判为阳性
表2微量补体结合试验判定标准 溶血抑制 血清稀释度 25%(+ 0K(+ 十 %++++ 5%+十+) 11.67 8.33 10 13.33 1/4 23.33 26.67 16.67 20" 1/8 33.33 40 46.67 53.33 1/16 66,67 80 93.33 106.67 /32 133.33 160 187 213.33 1/64 266,67 320 373.33 426.67 1/128 533.33 640 746.67 853.33 1/256 1066.67 280 1706.67 493.33 溶血抑制程度>20U/ml. 判为阳性
GB/T18646一2018 4.7.2常量法 4.7.2.1器材 内口径1cm玻璃试管,试管架,移液器、灭菌移液器吸头.适宜的稀释用器皿及温控范围为37飞四 38C和54C64C水浴锅
4.7.2.2 试剂及其制备 4.7.2.2.1稀释液 0.85%生理盐水
4.7.2.2.2受检血清 受检血清的采集和处理见附录B
4.7.2.2.3绵羊红细胞悬液 采取成年公绵羊血,按常规方法脱纤、洗涤、离心,用稀释液洗涤至上清无色为止,最后一次以 2000r/min离心沉淀10min,取下沉的红细胞沉积物,以稀释液配制成2.5%红细胞悬液(2.5ml/100mlL. 4.7.2.2.4标准血清 商品化布鲁氏菌标准阳性血清,布鲁氏菌标准阴性血清
4.7.2.2.5溶血素 商品化溶血索在有效期内根据标示效价使用,如需进行效价测定见附录c
4.7.2.2.6补体 除使用商品化冻干补体外,也可使用新鲜豚鼠血清作为补体
补体制备方法见附录D. 4.7.2.2.7抗原 商品化抗原在有效期内根据标示效价使用,如需进行效价测定见附录F
4.7.2.3操作方法 按常规方法采集和分高受检血请 4.7.2.3.1 4.7.2.3.2将1:10稀释受检血清灭能(见附录B)后,分别加人2支玻璃试管内,每管500AL
4.7.2.3.3其中一管加工作量抗原500AL,另一管加稀释液500AL 上述2管均加工作量补体,每管500AL.振荡混匀
4.7.2.3.4 4.7.2.3.5置37C水浴20min,取出放于室温环境中
每管各加2单位的溶血素500L和2.5%红细 胞悬液500l
充分振荡混匀
4.7.2.3.6再置37C水浴20min,之后取出立即进行第一次判定
每次试验应设阳性血清、阴性血清、抗原、溶血素和补体对照
主试验各要素添加量和顺序 4.7.2.3.7 如表3.
GB/T18646一2018 表3布鲁氏菌病补体结合试验的主试验 单位为微升 对照管 被检血消 血清 阳性血清 阴性血清 抗原 溶血素 补体 血清加人量 500 500 500 500 500 500 稀释液 500 500 1500 1500 500 抗原 500 500 500 1000 500 500 500 500 500 500 500 500 工作量补体 37C38C水浴20min 二单位溶血素 500 500 500 500 500 500 500 500 2.5%红细胞 500 500 500 500 500 500 500 500 500 -38水浴20min 37 判定结果举例 十十十一 十十十十 十十十十 十十十十 4.7.2.4判定 4.7.2.4.1试验成立条件;第一次判定,不加抗原的阳性血清对照管,不加或加抗原的阴性血清对照管 抗原对照管呈完全溶血反应
初判后静置12h作第二次判定,第二次判定时溶血素对照管,补体对照 管应呈完全抑制溶血 对照正确无误即可对受检血清进行判定,受检血清加抗原管的判定参照标准比色管记录结 4.7.2.4.2 标准比色管的制备方法见附录E. 果
4.7.2.4.3结果判定 040%溶血判为阳性反应 a b50%90%溶血判为可疑反应 c 100%溶血判为阴性反应
牛,羊和猪补体结合反应判定标准均相同
4.8间接酶联免疫吸附试验(iELISA) 实验室可按下列方法进行实验操作和结果判定,或根据商品化试剂盒进行实验操作和结果判定
4.8.1器材 6微孔聚苯乙烯板,单道移液器,多道移液器,灭菌移液器吸头,酶标仪或分光光度计,具备414nm 或405nm波长的滤光片,旋转振荡器,保湿盒,盖板,洗板机等
4.8.2试剂 牛种布鲁氏菌s1119-3株或S99株脂多糖抗原,抗原的提取和包被见附录G 4.8.2.1 4.8.2.2商品化酶标多克隆抗体(兔抗牛或免抗羊)或酶标单克隆抗体,见附录H
4.8.2.3商品化布鲁氏菌标准阳性血清和标准阴性血清
4.8.2.4抗原包被缓冲液:0.05mol/1.的pH9.6碳酸盐/碳酸氢盐缓冲体系,配制方法见附录l的I.1
4.8.2.5稀释缓冲液(用于稀释酶标抗体和血清):0.01mol/L的pH7.2磷酸盐缓冲体系PBSTl,配制 方法见1.2 10
GB/T18646一2018 4.8.2.6洗涤缓冲液;0.01mol/L的pH7.2磷酸盐缓冲体系PEBST2,配制方法见L.3
4.8.2.7底物溶液:3%过氧化氢溶液，配制方法见I.4
4.8.2.8底物缓冲液;pH4.5柠檬酸缓冲液,配制方法见I.5
4.8.2.9显色液:0.16mol/LABTs(2,2-二氮-双(3-乙基苯并嚓幽-6-磺酸))溶液,配制方法见I.6
4.8.2.10终止液;0.5mol/L叠氮化钠,配制方法见1.7
4.8.3操作方法 4.8.3.1所有待检血清和对照血清吸取25AL加至1mlL血清稀释液中做1/40初始稀释
4.8.3.2取包被酶标板,每孔加人80AL稀释液
s 4.8.3.3在第1列10列的各孔分别加人20!L初始稀释的待检血清(终稀释度为1/200),在第l1列 的各孔分别加人20L初始稀释的阳性对照血清,在第12列的前7个孔分别加人204L初始稀释的阴 性对照血清,第12列的最后1孔不加人稀释缓冲液做空白对照(见图1). 说明 B -空白对照孔; 阳性对照孔; T一待检血清孔; -阴性对照孔
图1酶标板微孔排列示意 酶标板加盖,在旋转振荡器上室温孵育30min(或30C静置1h) 4.8.3.4 4.8.3.5甩出微孔中的液体,用洗涤液润洗5次,在吸水纸巾上反复拍打酶标板,确保酶标板各孔内无 残留液体
4.8.3.6每孔加人100AL.用稀释液稀释至工作浓度的酶标抗体结合物溶液,加盖在旋转振荡器上室温 孵育30min(或30C静置1h)
4.8.3.7按4.8.3.5进行洗涤
4.8.3.8每孔加人100AL配制好的底物显色混合液混合液配制见l.6),在旋转振荡器上室温孵育 10min一15nmin
4.8.3.9每孔加人1004L终止液
用吸水纸巾吸去酶标板底部的水珠,在酶标仪405nm测定吸光度 (OD)值
4.8.4结果判定 实验成立的条件 4.8.4.1 空白对照孔的oD值和7个阴性对照孔的平均oD值应<0.100,8个阳性孔的平均oD值应 a >0.700; b结合率应>10,结合率计算按式(l)
8个阳性对照孔的平均OD值 结合率一 7不阴性对照孔的平巧O值 1
GB/T18646一2018 4.8.4.2判定;8个阳性对照孔的平均OD值×10%定为阴阳性的临界值
待检血清的OD值临界值 判为阳性,待检血清的OD值一临界值判为阴性
4.9竞争酶联免疫吸附试验(cELISA 实验室可按下列方法进行实验操作和结果判定,或根据商品化试剂盒进行实验操作和结果判定
4.9.1器材 96微孔聚苯乙烯板,单道移液器,多道移液器,灭菌移液器吸头,酶标仪或分光光度计,具备450 nm 波长的滤光片,微量振荡器,旋转振荡器,保湿盒,盖板,洗板机等
4.9.2试剂 4.9.2.1牛种布鲁氏菌Sl1l19-3或羊种布鲁氏菌16MM表位)脂多糖抗原,抗原的提取和包被见附 录G 4.9.2.2酶标单克隆抗体，见附录H. 商品化布鲁民菌标准阳性血清和标准阴性血请 4.9.2.3 4.9.2.4 稍释缓冲液(用于稍释结合物).00lml/Lpit7.2精股盐缓冲体系(PsT).配制方认见12 4.9.2.5洗涤缓冲液;0.01mol/几磷酸氧二钠缓冲溶液(PBST2),配制方法见I.3
49.2.6底物显色液邻苯二(oPD)与过氧化氢混合溶液,配制方法见I8 4.9.2.7终止液:0.5mol/L柠檬酸溶液,配制方法见I.9
4.9.3操作方法以检测牛血清为例 4.9.3.1取包被酶标板,在1列~10列每孔加人20L待检血清,在Al1、A12,B11、B12,c11、c12备 孔各加人20L阴性血清,在F11、F12,G11,G12,H11、H12各孔各加人20AL阳性血清,在D11、,D12、 E11、E12各孔不加人稀释缓冲液,留作酶标结合物对照(见图2). 说明: -酶标结合物对照孔; -阳性对照孔; -待检血清孔; -阴性对照孔
图2酶标板微孔排列示意 4.9.3.2酶标板每孔加人稀释至工作浓度的酶标单克隆抗体100AL
4.9.3.3将酶标板放到微量振荡器上振摇2min,加盖在旋转振荡器(160次/mim)室温孵育30; min
当没有旋转振荡器时,则需要手动振摇
先振摇30s,之后每10min振摇10s,时间共持续1h
手动 振摇不应使孔内液体溢出
4.9.3.4甩出微孔中的液体,用洗涤液润洗5次,在吸水纸巾上反复拍打酶标板,确保酶标板各孔内无 残留液体 12
GB/T18646一2018 115 4.9.3.5每孔加人100Al现配的底物显色液(混合液配制见I.6),室温孵育10minr min
4.9.3.6每孔加人100L终止液
用吸水纸巾吸去酶标板底部的水珠,在酶标仪450nm测定吸光度 OD)值
4.9.4结果判定 4.9.4.1实验成立的条件 a 6个阴性对照孔的平均OD值应>0.700,6个阳性对照孔的平均OD值应<0.100,4个酶标结 合物对照孔的OD值应>0.700. b 结合率应>10,结合率计算按式(2) 6个阴性对照孔的平均OD值 结合率= 2 6个阳性对照孔的平oD值 4.9.4.2判定:4个酶标结合物对照孔的平均OD值×60%定为阴阳性的临界值
待检血清的OD值< 临界值判为阳性,待检血清的oD值>临界值判为阴性
警示以下的病原学操作包括涂片染色镜检、分离培养、细菌鉴定、布鲁氏菌Bruee-L.adder检测 方法中涉及细菌活菌操作等应在满足GB19489一2008的SL-3级生物安全实验室内进行,检测人员 应采取针对性防护措施
4.10涂片染色镜检 将组织或生物液体进行涂片,加热或酒精固定后,用改良萎-尼氏(Ziehl-Neelsen)方法染色后 镜检,布鲁氏菌菌体染成红色球杆菌或短棒状杆菌,背景为蓝色
革兰氏染色呈阴性，一般不发生 两极着染
4.11分离培养 4.11.1细菌分离 对于采集的动物组织及疑似感染病料按以下方法处理并接种于培养基,样品采集符合GB/T18088 出人境动物检疫采样
组织样品:对无菌采集的组织.剔除多余部分(如脂肪)剔除后,取5g组织剪成小块,加人10mL无 菌PBS缓冲液进行研磨后,取200ML接种于选择培养基表面,培养基见附录J
阴道冲洗液、精液、关节液、胃内容物等,取200"L接种于选择培养基表面,培养基见附录J
取15ml乳样,2000！离心15nmin,用10AL接种环取奶油层2环,接种于选择培养基表面
培 养基见附录. 每份样品均一式两份,分别置于普通培养箱和5%~10%cO培养箱中,37C培养3d10d
4.11.2 菌落观察 形态观察;布鲁氏菌菌落呈圆形,直径1mm一2mm,边缘光滑
透射光下,菌落呈浅黄色有光泽 半透明
从上面看,菌落微隆起,灰白色
随时间推移,菌落变大,颜色变暗
染色观察:用移液器吸取结晶紫稀释染液配制方法见附录K),浸没菌落15s一20s,然后吸取染 色液弃置到消毒液中
光滑型菌落不着色,变异菌落被染成紫色或红色
13
GB/T18646一2018 4.12细菌鉴定 4.12.1对cO需求试验 培养物分离后立即测定,用菌悬液接种4支含血清琼脂斜面,2支置于普通培养箱,2支置于5% 0%CO培养箱,37C培养2d3d,观察比较4支斜面生长情况
4.12.2HS试验 将HS试纸条放人接种培养物的斜面培养基管内,夹在管壁和塞子之间,且不和培养基接触
置 于37C培养箱培养,若有HS产生,则试纸条顶端变黑
每天记录结果并更换试纸条,持续4d
4.12.3氧化酶试验 新鲜配制氧化酶试剂,配制方法见附录L,取约载玻片大小的滤纸条在该试剂中浸溃后置于平皿中 备用
用接种环蘸取一环新鲜培养物,涂压在准备好的滤纸条上,l0s后观察颜色变化
氧化酶阳性可 使涂压培养物处变为黑色
4.12.4脉酶试验 用接种环蘸取一环新鲜培养物,涂压在含2%尿素的培养基上,培养基配制方法见附录M,观察颜 色变化
室温保存该培养基,24h,约5h观察一次
分解脉的菌株可使培养基由黄色变为粉红色
4.12.5对硫董、复红染料的敏感性试验 用无菌棉拭子浸蘸菌悬液在分别含硫革,复红染料的培养基(染料浓度为204g/mL)上划一横 线.置于7笔培养箱培养.3d一4d后观察平里随落生长情况
每个平皿上的不同菌悬液械线不得交 叉、接触
4.12.6特异性血清凝集反应试验 光滑型菌应用布鲁氏菌A和M表面抗原特异单价血清进行凝集反应试验,粗糙型菌应用布鲁氏 菌R抗原的单价血清进行凝集反应试验
出现明显的凝集反应可确定菌株为相应种、型的布鲁氏菌 表4
表4布鲁氏菌生化反应及单因子血清试验 在染料中的生长 单因子血清集试验 菌落 对CO HS 生物型 氧化酶 种 脉 形态 需求 产生 硫革 复红 M + 羊种 光滑 +" × 十d 十 十d X 十 × X 中 父 牛种 光滑 十" 十d 十 + 十 14
GB/T18646一2018 表4(续 单因子血清凝集试验 对co. Hs 在染料中的生长 菌落 种 生物型 氧化酶 脉酶 形态 需求 产生 复红 M 硫革 光滑 十" 十 猪种 十" 沙林鼠种 光滑 绵羊附睾种 粗糙 粗梳 +" 犬种 中等速度,有些菌株很快 除参考株A544和少数野毒株为阴性外,其余为中等速度
快速
在初级分离时通常为阳性
在南美和东南亚分理处一些对复红有抗性的菌株
大多数为阴性
硫革浓度10g/ml可生长
-些在加拿大、英国和美国分离株不能在染料上生长， 4.12.7噬菌体溶解试验 应用本方法可将布鲁氏菌鉴别到种(表5)
以无菌生理盐水将待检菌株制成10亿/ml.悬液,然后涂布于干燥的琼脂平皿上,稍干后,用直径 为2mm的铂金耳环勾取标准噬菌体液加于平皿上,置37C恒温箱中经24h初步观察结果,再放置室 温下,经24h后判定最后结果
结果判定依据;细菌完全不生长,判为十阳性);部分生长,判为士(可疑);细菌生长良好,判为 阴性)
表5噬菌体对不同种布鲁氏菌的溶解 F Tb wb BK2 R/ R/c 布鲁氏菌种 牛种菌 羊种菌" 猪种菌" 士 沙林鼠种菌" 绵羊附睾种菌 犬种菌 为光滑型菌株
为噬菌体浓度大于等于10RTD时裂解
为部分裂解 15
GB/T18646一2018 4.13布鲁氏菌Br Brue-Ladder检测方法 4.13.1布鲁氏菌DNA的制备 从平板上选择单个菌落,用灭菌接种环取一环菌,接种到200生理盐水中,煮沸30min,12000g 离心30s,取1!L上清液作为DNA模板用于PCR扩增(约0.l!g/L),或使用商品化的DNA提取试 剂盒提取DNA作为模板,DNA模板可置于-20C保存备用
4.13.2PCR反应体系 PCR反应体系见表6.
表6PCR反应体系总体积为25L 成分 终浓度 体积 10倍PCR缓冲液 l倍 2.5aL dNTPs(2mmol/L 400mol/L/个 5,0AL 镁离子(50mmol/I 3.0mmol/1 1.5AL 8对引物混合液(12.5Mmol/L 6.25pmol/条 7.6AL 超纯水 7.1AL. 1.5U 1DNA聚合酶 Ta 0.3AL DNA模板 0.l 1AL 14g/Al PCR反应管中依次加人上述成分,充分混匀后,瞬时离心,确保所有反应成分混匀并集于管底
4.13.3PCR对照 同时设阴性对照、阳性对照,阳性对照为标准菌株DNA.阴性对照为不含DNA的反应体系 4.13.4扩增程序 将上述加有DNA模板的RCR管,置于CR仪内进行反应
反应条件如下;95C7min预变性" 然后进行25个循环的扩增(95C变性35s,64C退火45s,72C延伸3min),最后72C延伸6min. 保存
4.13.5电泳 用1倍TBE缓冲液,参见附录N,配制1.5%琼脂糖凝胶平板,同时,加人0.005%GoldView核酸 染料,取PCR产物7AL与适量6倍嗅酚蓝缓冲液混合,加样,7L/孔,同时,设定1kbpluDNA ladder标准分子量标准,120V稳压电泳1h,紫外灯下观察条带
4.13.6结果判定 4.13.6.1试验成立的条件 当阴性对照不出现条带、阳性对照出现条带,试验成立时,参照图3进行判定
4.13.6.2判定 4.13.6.2.1牛种布鲁氏菌电泳同时出现152bp,450bp587bp,774bp和1682bp共5条带
16
GB/T18646一2018 4.13.6.2.2羊种布鲁氏菌;电泳同时出现152bp,450bp,587p、774bp、1071bp和1682bp共6 条带
4.13.6.2.3绵羊附睾种布鲁氏菌:电泳同时出现152bp、450bp587bp、774bp和1071bp共5条带
4.13.6.2.4猪布鲁氏菌;电泳同时出现152bp,272bp,450bp,587bp,774bp1071bp和1682bp共 条带
4.13.6.2.5s19疫苗菌株;电泳同时出现152bp、450bp,774bp和1682bp共4条带 4.13.6.2.6RB51疫苗菌株;电泳同时出现152bp,450bp,587bp、774bp和2524bp共5条带
4.13.6.2.7Revl疫苗菌株;电泳同时出现152bp218bp,450bp,587bp、774bp、l071bp和1682bp 共7条带 4.13.6.2.8 犬种布鲁氏菌:电泳同时出现152bp272bp、450bp,587bp、1071bp和1682bp共 6 条带
4.13.6.2.9沙林鼠种布鲁氏菌:电泳同时出现272bp、450bp,587bp、774bp、1071bp和1682bp共 6条带
4.13.6.2.10海洋种布鲁氏菌(鳍型布鲁氏菌、鲸型布鲁氏菌):电泳同时出现152bp、587bp、774bp、 1071bp、1320p和1682p共6条带
田鼠种布鲁氏菌电泳同时出现152p,272bp、450bp,510bp587bp.,774bp、1071bp 4.13.6.2.11 和1682bp共8条带
4.13.6.2.12B.inopinata布鲁氏菌;电泳同时出现152bp,272bp、450bp,587bp、774bp和1682bp 共6条带
绵阳 盗
" 然" Make牛种羊种 附来猪种 犬种 海洋种田鼠种inopinaa RB51 一2524 2000 682 650 320 1o71 1000 850 774 650 500 400 300 272 1I8 IS 52 100 图3布鲁氏菌种PCR扩增图谱 17
GB/T18646一2018 附 录 A 规范性附录) 试管凝集试验参照比浊管的制备 每次试验需配比浊管.作为判定凝集反应程度的依据,先将已经稀释好的工作抗原用等量稀释液作 对倍稀释,然后按表A.1配制比浊管
表A.1参照比浊管的配制 管号 对倍稀释后的抗原液/L 稀释液/AL 清亮度/% 记录标记 + 1000 100 十十十 250 750 75 500 500 50 750 250 25 1000 18
GB/T18646一2018 附录 B 规范性附录 补体结合试验试剂配制及受检血清的采集和处理 B.1巴比妥缓冲液(p7.2) 取巴比妥0.575g,巴比妥钠0.185g,氯化钠8.500g,六水氯化镁0.168g,无水氯化钙0.028g,加蒸 馏水使溶解并稀释至1000mL,用2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.2,过滤即得
B.2血清稀释 以常规方法采血和分离血清
微量补体结合试验用巴比妥缓冲液(B1)将血清作1:4稀释(25"l 血清加人75L稀释液);常量补体结合试验用稀释液(4.7.2.2.1)将血清作1:10稀释,按表B.1规定的 水浴灭能
表B.1各种被检动物血清的灭能温度和时间 灭能时间/min 血清类别 灭能温度/ 羊 5859 30 马 58一59 30 驴、骡 63一64 30 黄牛,水牛、猪 56~57 30 鹿、骆驼 54 30 19
GB/T18646?2018 ? 淶??) ??Ч?? C.1?? ?0.2ml??,9.8mL??100?????,C.1 ??? c.1??? λ?? ? 10 200 100 00 100 100 00 100 100 100 00 100 00??? ?? 800 900 1400190024002900340039004400 49005400 2500 ??? 500 1000 15002000 30003500 4000 4500 5000 5500 C.2C.2??,37C38C??20 min C.2??Ч?? λ?? ?? ??? 250 250 500 1000 2000 3000 4000 5000 6000 25 25 25 25 25 25 25 25 ??? 25 2.5%? 25 25 25 25 25 25 25 25 25 75 50 50 50 50 50 50 50 50 ?? 25 25 25 25 10?? 25 25 25 25 ?,37C??30 min 300g600?5min10minm ????? 20
GB/T18646一2018 表C.3常量法溶血素效价测定表 单位为微升 对照管 l0 m 管号 溶血素补体稀释液 3 500400o450050005500 游 稀释倍数500100o150o200o250o300o 100 500 500 500 500500 500 500 加人量 500 500 500 500 500 0 稀释液 1000100o100o1000100o1000100010001000100o100o150015002000 20倍稀释补体500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 2.5%红细胞 500 500500 500 500 500 500 500 500500 500 500 500 500 37 -38C水浴20min 十十 十十+什++十十十十+十十++十++十 结果(例 全部溶血 部分溶血 全部不溶血m C.3 溶血素效价 从水浴中取出,立即判定结果,能使2.5%红细胞液25L微量法)或500AL(常量法)完全溶血的 最小量溶血素为溶血素效价或称一单位溶血素
以表C.3为例,对照管均不溶血，1管一6管完全溶血， 测定溶血素效价为3000倍稀释
在主试验时溶血素的工作效价为滴定效价的倍量或称二单位溶血素,则工作效价为1500倍稀释
效价测定后,2~3个月内可按此效价使用,不必重测
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GB/T18646一2018 附 录 规范性附录) 补体制备 D.1 补体采集 选择健康豚鼠3只5只,于使用前一天早晨喂饲前或停食后6h从心脏采血,分离血清后混合保 存于普通冰箱中,也可从兽医生物药品厂购买冻干补体,使用前加稀释液恢复原量后使用 每次补体结合试验,应于当日测定补体效价
D.2补体效价测定 D.2.1微量法补体效价测定 D.2.1.1稀释补体并加各种成分 应于补体结合试验当日测定补体效价
按商品使用说明书提供稀释度稀释(以1:100为例)
用 稀释液配制1:100稀释补体(如果测定过程中发现补体含量低,可做其他稀释度选择),按表D.1加人 各种成分后,前后经37C30nmin水浴2次
D.2.1.2效价测定 经过2次水浴,在二单位溶血素存在情况下,阳性血清加抗原的试管完全不溶血,而在阳性血清未 加抗原及阴性血清无论有无抗原的试管发生完全溶血所需要最小补体量,就是所测得的补体效价
以 表D1为例,第7管1:I00稀释的补体100L即为一个补体单位 表D.1 微量补体结合试验补体效价测定 单位为微升 1 13 溶血对照 管号 10 12 完全完全 0.2 0.25 0.3 0.35 0.450.50.55 0.65 0.7 0.75 0.8 稀释度 0.4 0.6 溶血抑制 补体1/100 40 50 60 70 80 90 100 l10 120 130 140 150 160 400 稀释液 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 抗原 200 200 200 200 200200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 稀释液 200 200 200 200 200 200200200200200 200200 200 400 振荡混匀后置37C水浴30min 致敏红细胞" 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 振荡混匀后置37水浴30min,300离心5min10min 致敏红细胞:提前红细胞和溶血素等体积混合,放置室温20min;剩余致敏红细胞可存放4于主实验用
-单位补体工作效价;将完全溶血及完全抑制各取500AL至试管中,制备成50%溶血补体稀释 度;对照准备对比各个补体稀释度,取颜色与50%溶血补体相近稀释度的补体量为一单位补体工作 效价
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GB/T18646一2018 原补体使用时应稀释倍数的计算:对比颜色时以自然光或白色为背景对比
以上表为例,第7管 l100稀释的补体100L.即为一单位补体工作效价
以一个微孔反应板为例,根据以下式计算出所 需补体用量:100/200×1/100X6×25×100=75AL D.2.2常量法补体效价测定 D.2.2.1稀释补体并加各种成分 应于补体结合试验当日测定补体效价
用稀释液配制1:20稀释如果测定过程中发现补体含量 低,可做1:10稀释或其他稀释度选择)补体,按表D.2加人各种成分后,前后经37C3820m 水浴2次
D.2.2.2效价测定 经过2次水浴,在2单位溶血素存在情况下,阳性血清加抗原的试管完全不溶血,而在阳性血清未 加抗原及阴性血清无论有无抗原的试管发生完全溶血所需要最小补体量,就是所测得的补体效价
以 表D.2为例,第6管1;20稀释的补体250AL即为一个补体单位
表D.2补体效价测定 单位为微升 对照 管号 10 11 13 12 20倍稀释补 100 60 190 220 280 31l0 340 370 500 130 250 体加人量 稀释液加人量 400 370 340 310 280 250 220 190 160 130150015002000 工作量抗原加 人量 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 不加抗原量 加稀释液 10倍稀释阳 500 500 500 50o 500 500 500 500 500 500 阴)性血清 加人量 振荡均匀后置37C一38C水浴20min" 500 500 二单位溶血素 500 500 500 500 500 500 500 500 500 2.5%红细胞悬液500 500 500 500 500500 500 500 500 50o 500 500 500 振荡均匀后置37C38C水浴20min 阳性血清 十十十开十十开十十开十十中十十中十十中十十中十十十十开十十中什十十开十十十+十十 加抗原 阳性血清 十十 不加抗原 结 果 阴性血清 十十 十十十十十十十十+ 加抗原 阴性血清 十十十十 不加抗原 23
GB/T18646一2018 D.2.2.3原补体使用时应稀释倍数的计算 原补体使用时应稀释倍数按式(D.l)计算 补体稀释倍数 原补体稀释倍数 ×使用时每管加人量 (D.1 测得效价 式中“补体稀释倍数”为补体效价测定试验补体的实际稀释度,“测得效价”为稀释后的补体加人量， “使用时每管加人量”为主试验时每管需加的含一个工作单位补体的液体量
20 以表D.1为例,按式(1)计算 ×500=40倍 5 即此例补体应作40倍稀释,每管加500AlL,即为一个补体单位
考虑补体性质不稳定,操作过程 中效价会降低,正式试验时使用浓度比补体效价要大10%左右,本例补体工作单位应作36倍稀释,每 管使用500AL
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GB/T18646一2018 录 附 E 规范性附录 标准比色管/孔 E.1微量补体结合试验溶血标准比色孔的制备 制备时以完全溶血的对照(抗原对照或补体对照)和完全抑制溶血的对照(致敏红细胞对照)各取 50L做50%溶血对照,见表E.1
表E.1微量法溶血标准比色孔的制备 单位为微升 75 50 100 25 溶血对照/% 十十 十十十 十十十十 25 50 75 100 稀释液 75 25 溶血上清"'/L 100 50 可从主试验中100%溶血的孔中吸取上清制备
E.2常量补体结合试验溶血标准比色管的制备 配制方法如表E.2,牛、羊和猪补体结合反应判定标准均相同
表E.2常量法溶血标准比色管的制备 单位为微升 10 20 50 溶血溶液/9% 30 40 60 70 80 90 l00 250 1000125015001750200022502500 500 750 溶血溶液" 2.5%红细胞液 500 450 400 350 300 25o 200 150 100 50 稀释液 200018001600140012001000 800 600 400 200 + 判定符号 十十十+十十十+十十+ +++十 十 十十 十+ 判定标准 阳性 可疑 阴性 试验中全溶血的试管内液体即为溶血溶液
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GB/T18646一2018 附录 F 规范性附录) 抗原效价测定 -般按照兽医制药厂产品说明书的效价使用
在初次使用或过久等其他原因需要测定时按下述步 骤进行
P.1测定抗原效价 取用两份阳性血清(分别为强阳性和弱阳性血清)和一份阴性血清来测定抗原效价
阴性血清和阳性血清稀释 F.2 用稀释液对阴性对照血清仅作1:10稀释,阳性血清稀释成1:10,1;25,1:50,1:75和1:100, 5个稀释度
F.3稀释抗原 用稀释液将抗原稀释成1:10、1:50、1:75、1:100、1:200、l;300、1:400和1:500等稀释度
F.4加样 按表F.1加人各种成分,并经37C38c20min水浴2次
表F.1布鲁氏菌补体结合抗原效价测定 单位为微升 对照 管号 10 10 50 75 100 150 200 300 400 500 补体对照 溶血素对照 稀释倍数 抗原 加人量 500 500 500 500500 500 500 500 500 500 各种血清稀释度加人量 500 500 500 500500 500 500 500 500 工作量补体 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 3738 水浴20mim 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 二单位溶血素 2.5%红细胞 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 37C38C水浴20min F.5记录抗原测定结果 从水浴中取出反应管,观察溶血百分数,记录结果
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GB/T18646一2018 例举范例如表F.2
表F.2布鲁氏菌补体结合抗原效价滴定结果(举例 抗原稀释倍数 l0 300 400 500 50 100 150 200 10 100 25 100 50 100 0 10 血清稀释倍数 0 20 50 20 S 75 100 20 30 50 20 1c 100 100 80 20 80 80 100 F.6抗原效价 抗原对阴性血清应完全溶血
对两份阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗 原效价
在正式试验时抗原的稀释度应比测定的效价浓25%
以表F.2为例,其效价为1:150,正式试验 时按1:112.5稀释使用
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动物布鲁氏菌病诊断技术GB/T18646-2018详解
一、标准简介
GB/T18646-2018《动物布鲁氏菌病诊断技术》是由中国农业行业标准化技术委员会发布的行业标准。该标准主要从病原学检测、临床诊断、免疫学检测等多个方面规定了动物布鲁氏菌病的诊断技术及相关要求。
二、适用范围
本标准适用于所有动物布鲁氏菌病的诊断，包括家畜、野生动物等各种类型动物。
三、诊断方法
本标准规定了动物布鲁氏菌病的多种诊断方法，包括：
- 临床症状检查：通过观察动物的临床表现来初步判断是否患有布鲁氏菌病；
- 病原学检测：采用培养、PCR等方法对动物体内血液、尿液、组织等样品进行检测，确诊布鲁氏菌病的存在；
- 免疫学检测：采用ELISA、AGID、SAT等方法对动物血清进行检测，诊断动物是否感染布鲁氏菌。
四、质量控制要求
在使用诊断方法时，需要注意质量控制要求，包括：
- 实验室环境的卫生和清洁；
- 仪器设备的维护和标定；
- 试剂、耗材的储存和保管；
- 操作人员的资质和技能要求。
五、结果解释
在诊断后得出初步结果后，需要对结果进行解释。对于不确定或矛盾的结果，需要进行复检或者进一步检测，确保诊断结果的准确性。
六、总结
GB/T18646-2018《动物布鲁氏菌病诊断技术》是保障动物健康和人类健康的重要标准。各相关单位在进行相关诊断时应严格按照本标准的规定进行操作，确保诊断结果的准确性和可靠性。
