贝类染色体组型分析

国家标准 GB/T32757一2016 贝类染色体组型分析 Moluseskaryotypeanalysis 2016-06-14发布 2017-01-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T32757一2016 贝类染色体组型分析 范围 本标准给出了贝类染色体组型分析的方法原理,仪器和设备,玻片标本的制备和组型分析方法 本标准适用于贝类染色体组型分析 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T18654.12养殖鱼类种质检验第12部分;染色体组型分析 术语和定义 GB/T18654.12界定的以及下列术语和定义适用于本文件 3.1 胚胎法earlyembryomethod 利用贝类胚胎为材料分析其染色体组型的方法 3.2 担轮幼虫法trochophoramethodt 利用贝类担轮幼虫为材料分析其染色体组型的方法 3.3 成体鲤组织法gitissuemethod 利用贝类成体觎组织为材料分析其染色体组型的方法 异形染色体heteromorphicchromosomes 形态不同的一对同源染色体 3.5 次缢痕 semdarycmstretnn 染色体上部分DNA松懈形成核仁组织区的缢缩部位 3.6 随体satelte,trabant 通过次缢痕与染色体主要部分相连,位于染色体末端的、圆形或圆柱形的染色体片段 原理 利用PHA等增加细胞分裂相、秋水仙素破坏细胞中的纺锤丝,采用怒同方法制备染色体玻片标 本,获得数目完整,形态清晰的染色体图像,用于染色体组型分析
GB/T32757一2016 药品和试剂 5.1氯化钾(KCI);分析纯 5.2甲醇(CHOH):分析纯 5.3冰乙酸(CHO):分析纯 5.4二甲苯[CH,(CH)];分析纯 5.5中性树胶 5.6秋水仙素溶液:注射液用生理盐水配制,处理液用蒸馏水或海水配制,4笔避光保存 5.70.075mol/几氯化钾溶液;称取5.59只氯化钾,定容至1000mL. 5.825%海水:取洁净的过滤海水,用蒸溜水稀释至25% 5.9植物血球凝集素(PHA)溶液:用生理盐水稀释至适宜的浓度 5.10卡诺氏(Carnoy'、)固定液;3份甲醇加人1份冰乙酸(体积比),现用现配 mol/L.pH值为7.2,量取0.2molL的磷酸氢二钠(NaIHPO 5.11磷酸缓冲液(PBS):浓度为0.2 72mL和0.2mol/L的磷酸二氢钠(NaH,Po.)28mL,混合均匀 5.12吉姆萨(Giemsa)染液;称取0.5gGiemsa粉、甘油33mL,在研钵内用少量甘油与Giemsa粉混 合,研磨至无颗粒时,再加人剩余的甘油,56丫条件下保温2h后,加人33mL甲醇,过滤保存于棕色瓶 内,使用前用PBS稀释10倍 5.132%醋酸洋红;先将100nmL45%乙酸水溶液置人200mL的锥形瓶中煮沸,停止加热,然后慢慢 地分多次加人2g洋红粉末(切记不可一次倒人) 待全部倒人后,再煮沸1min一2min,并悬人一生锈 的小铁钉于染液中,过1nmin后取出,静置12h后过滤于棕色瓶中置于避光处备用 5.14卡宝品红(Carbolfuchsin)改良液 A液;3只碱性品红溶于100mL.70%乙醇,可长期保存; B液:10mLA液加人90mL5%苯酚水溶液,限14d内使用 染色母液;B液45mL.37%甲醛6mL.冰乙酸6mL. 卡宝品红改良液;染色母液10ml,45%乙酸90mL,山梨醇1g,放置2周后使用 5.15醋酸地衣红;取100ml45%的乙酸煮沸,慢慢加人地衣红至饱和,冷却后过滤 5.16醋酸铁苏木精水合氯醛染色液 A液;2g苏木精溶解在100mL45%冰乙酸中; B液;0.5g铁铵明研[FeNH.(SO.,12H.O]溶解在100ml45%冰乙酸中 染色液;使用前一天将A液和B液等体积混合,每5mL中溶人2g水和氯醛[CCl,CH(OH)],配 制后在2d~14d内使用 仪器和设备 6.1天平;感量0.1mg 6.2解剖工具 6.3试管:l0ml具塞刻度试管 6.4表面皿或培养 6.5注射器及针头 6.6可调移液器及枪头 6.7显微镜(带显微摄影) 6.8游标卡尺:精度0.01 mm
GB/T32757一2016 6.9离心机:3000×g一6000× Xg 染色体标本的制备 实验材料的选择 按不同方法选择胚胎、担轮幼虫或飓组织 7.2预处理 7.2.1胚胎法 将胚胎放人含秋水仙素的水中处理,秋水仙素浓度和处理时间因种类而不同，一般秋水仙素浓度 10mg/I50mg/L,处理时间20min40min 7.2.2担轮幼虫法 将担轮幼虫放人含秋水仙素的水中处理,秋水仙素浓度和处理时间因种类而不同,一般秋水仙素浓 度10mg/L~100mg/儿L.,处理时间1h一2.5h 7.2.3成体鳗组织法 剪取部分鳗组织放人含秋水仙素的水中处理,秋水仙素浓度100mg/L一400mg/L,处理时间 30min2h 7.2.4整贝 7.2.4.1秋水仙素预处理 可分为以下两种方法 a)秋水仙素肌肉注射后暂养一段时间,注射剂量为24g/g体重84g/g体重,暂养时间3h~ 15h3 b对个体较小,不便于注射的贝类,可放置在含有秋水仙素浓度为0.1g/L1g/1的水中暂养 4h~12h 7.2.4.2PHA十秋水仙素预处理 可分为以下两种方法 a)按54g/g体重一84g/g体重肌肉注射PHA,暂养16h一24h后,按24g/g一84g/g体重注 射秋水仙素,暂养3h6h;还可以在第一次注射PHA后18h~20h,同剂量重复注射1次 暂养5h一6h后再注射秋水仙素 b先将贝放人添加1004g/ml.PHA的水中暂养16h一24h,再放人含504g/mL秋水仙素的水 中暂养4h一6h 7.3低渗 可以采用以下方法之一进行低渗处理: 75mol/L.的KCI低渗,处理时间因种类不同,从10min~2h不等; a b用25%海水低渗,处理时间30min50min. 低渗前可采用胰蛋白酶消化、剪碎等方法提高低渗效果
GB/T32757一2016 7.4固定 1000×尽离心10min,弃上清,加人新配制的卡诺氏固定液用吸管吹打至绸胞散开,冰浴固定 30 nmin;重复3次一5次 7.5解离 固定液替换为50%冰乙酸对固定样品进行细胞的解离,也可在固定液中用吸管轻轻吹打至细胞散 开 用冰乙酸进行解离时需要换回卡诺氏固定液保存 7.6制片 7.6.1 压片法 将解离后的样品置于清洗干净的载玻片上,滴上适量染色液染色后压片 此法适合于用组织块进 行染色体的制备 染色方法可选用以下方法之 2%醋酸洋红染色201 a min b卡宝品红改良液染色5 min; e)醋酸地衣红染色30min~1h; d)醋酸铁苏木精水合氯醛染色液染色12h24h 7.6.2滴片法 将细胞悬液摇匀,待大颗粒下沉后,取上层悬液,加人新鲜配制的固定液,用吸管吹打均匀 吸取细 胞悬液在约45°倾斜的玻片上滴2滴一3滴(玻片可预热至50C一60C或冷冻),并轻轻吹动使细胞铺 散开,空气干燥法干燥后用4%20%的吉姆萨液染色5nin30min,用清水冲洗干净后晾干 7.6.3封片 二甲苯透明,中性树胶封片,干燥后镜检 组型分析方法 按GB/T18654.12的规定执行 其他形态特征的观察 除计数和分组外,还应观察染色体的其他形态特征,如有无异形染色体,次缢痕,随体等,并计人 结果

贝类染色体组型分析GB/T32757-2016

前言

贝类是重要的海洋生物资源之一，其繁殖力和遗传多样性的研究对于保护和利用贝类资源具有重要意义。染色体组型分析是研究生物个体间遗传关系的常用方法之一，也是研究贝类自然种群结构和遗传多样性的重要手段之一。本文将介绍贝类染色体组型分析的标准GB/T32757-2016。

一、标准概述

GB/T32757-2016《贝类染色体组型分析》是由中国国家标准化管理委员会发布的标准，适用于各种贝类染色体组型分析，包括单倍型分析、基因频率分析等。该标准规定了贝类染色体组型分析的原理、方法、实验操作、数据处理及结果分析等内容。

二、方法

贝类染色体组型分析的方法包括多态性标记的选择、DNA提取、PCR扩增、电泳分离、数据处理等。具体操作如下：

（一）多态性标记的选择

根据研究需要和实验条件，选择适当的多态性标记进行分析。常用的多态性标记包括限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、序列相关性标记（SSR）等。

（二）DNA提取

将样品中的DNA提取出来，常用的DNA提取方法有CTAB法、琼脂糖法、盐溶法等。

（三）PCR扩增

用PCR方法扩增DNA片段，通常需要设计引物并对其进行优化。PCR反应体系包括模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶等。

（四）电泳分离

将PCR扩增产生的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并进行可视化染色。

（五）数据处理

对电泳分离结果进行数据处理，包括测序、基因型分析、遗传距离计算等。

三、注意事项

在进行贝类染色体组型分析时，需要注意以下几点：

• 样品采集应当选择适当地区和时间，避免环境因素对实验结果的影响。
• 实验操作过程中应当采取严格的质量控制措施，确保实验结果的可靠性。
• 数据处理应当采用统一的标准和方法，避免误差和主观因素对结果的影响。

四、结论

贝类染色体组型分析是研究贝类遗传多样性和种群结构的重要手段。GB/T32757-2016《贝类染色体组型分析》为贝类染色体组型分析提供了标准化方法和规范，使得不同实验室之间进行数据比较和共享变得更加容易和可靠。通过该标准的实施，可以更加深入地探究贝类种群的遗传多样性、基因流动以及环境适应性等问题。

总之，贝类染色体组型分析是一项非常有意义的研究工作。在实际操作中，我们需要严格按照GB/T32757-2016标准进行操作、数据处理和结果分析，以确保实验结果的可靠性和科学性。相信随着技术和方法的不断改进，贝类染色体组型分析将会在贝类遗传资源保护和利用中发挥越来越重要的作用。

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