白斑综合征(WSD)诊断规程第1部分：核酸探针斑点杂交检测法

白斑综合征(WSD)诊断规程第1部分：核酸探针斑点杂交检测法

国家标准 GB/T28630.1一2012 白斑综合征(wSD)诊断规程 第1部分:核酸探针斑点杂交检测法 Diagnosticprotocolsforwhitespotdisease一 Part1:DotbothybridizationmethodlwithDNAprobe 2012-07-31发布 2012-11-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T28630.1一2012 前 言 GB/T28630(白斑综合征(wSD)诊断规程》分为五个部分 -第1部分:核酸探针斑点杂交检测法; 第2部分;套式PCR检测法; 第3部分:原位杂交检测法; 第4部分;组织病理学诊断法; 第5部分:新鲜组织的T-E染色法 本部分为GB/T28630的第1部分 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本部分由农业部提出 本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/Tc156)归口 本部分起草单位;水产科学研究院黄海水产研究所,农业部全国水产技术推广总站 本部分主要起草人;黄健、杨冰、陈爱平,未晓玲,史成银、杨丛海、魏琦、刘莉
GB/T28630.1一2012 引 言 本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,涉及到国家发明专利“对虾流行病病原检测试剂 盒及其检测方法”(ZL00111336.4)的使用 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场 该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他们愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件 下,就专利授权许可进行谈判 该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案 相关信息可以通过 以下联系方式获得: 专利持有人姓名;史成银,杨冰,黄健、宋晓玲,杨丛海 地址;水产科学研究院黄海水产研究所,山东省青岛市南京路106号 请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任
GB/T28630.1一2012 白斑综合征(wSD)诊断规程 第1部分;核酸探针斑点杂交检测法 范围 GB/T28630的本部分规定了白斑综合征核酸探针斑点杂交检测方法所需试剂与材料、仪器设备 操作步骤和结果判定 本部分适用于对虾的成虾、幼虾、仔虾,幼体和受精卵的活体,冰鲜或冰冻产品和其他对白斑综合征 病毒敏感的甲壳类生物白斑综合征病原的筛查、临床病症的确诊,不适用于对病毒感染活性的估测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有修改单)适用于本文件 GB/T28630.4一2012白斑综合征(wSD)诊断规程第4部分;组织病理学诊断法 原理 3.1白斑综合征的病原和病理学特征 见GB/T28630.4一2012的2.1 3.2技术原理 以非放射性标记物 地高辛标记的白斑综合征病毒(wSSV)DNA片段,即核酸探针,与存在于 样品中的病毒DNNA进行特异性的核酸分子杂交,通过抗原-抗体反应和酶-底物的化学显色反应显示样 品中病毒的存在 试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸水或去离子水或相当纯度的水 含氯消毒剂.医用品或水产药物 4.2 杂交膜硝酸纤维素膜 4.3 4.4PCRDGProbesynthesisKit 十二婉基肌氨酸钠(Sarkosyl);生化试剂 4.5 4.6十二婉基硫酸钠(SDs);生化试剂 4.7 乙 二胺四乙酸二钠(EDTA-Na;2H.,O);生化试剂 4.8疏基乙醇;生化试剂 Tris平衡酚饱和盼);生化试剂 9 4. 1 PRCRDGProbesymthesisKit是由Roche公司提供的产品的商品名 给出这一信息是为了方便本部分的使用 者,并不表示对该产品的认可 如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T28630.1一2012 4.10封闭剂;BlockingReagent,生化试剂 4.11碱性磷酸酶偶联的DG抗体(AP抗DG,0.75U/AL,4C):生化试剂 4 12琼脂糖;电泳级 4 131kbDNAMarker;生化试剂 4 14 CaqDNA聚合酶(5U/AlL);生化试剂,一20C保存 41510xPCR缓冲液;生化试剂,无Mg,随TraqDNA聚合酶提供，一20笔保存 4.16氯化镁溶液(25mmol/L);生化试剂,-20C保存 4.17dNTP生化试剂,含dATP.drTP,dGTP租dCTP各10mmol/L的混合物，一20笔保存 4.18核酸探针引物序列F:5'CTGTAATTGGAcGAGGAG-3 出 核酸探针引物序列R:5'-CTGCCAACCTTAGAGTTC-3' 4.20研磨液见附录A的规定 4.21泡膜液;见附录A的规定 4.22预杂交母液:见附录A的规定 4.231X缓冲被A.见附录A的规定 4241×缓冲液B,见附录A的规定 4251X请洗液.见附录A的规定 4.261×清洗液I;见附录A的规定 427显色剂A,见附录A的规定 4.28显色剂B;见附录A的规定 4.29溶有显色剂A和显色剂B的1×缓冲液B;见附录A的规定 4.30扁头错子 4.31剪刀 4.32洗涤皿:直径5cm9cm的平皿 4.33吸管 4.34玻璃研磨棒或塑料研磨棒 4.35杂交袋 4.36暗盒:不透光的容器,可用任何能避免强光直射的盒子或袋子代替 4.371.5ml塑料微量离心管;经高压蒸汽灭菌 4.38 -次性塑料手套 4.39滤纸 仪器设备 5.1普通冰箱具冷藏箱,并带一18C以下冷冻箱体 5.2台式高速离心机;用于1.5ml塑料微量离心管的离心,最高转速可达12000r/min以上 5.3恒温箱可满足80C士5C 5.4水浴锅可满足65C士1C 5.5振荡器;振荡频率40r/min一220r/ r/min 5.6塑料封口机:可满足5cm以上杂交袋热塑封口,溶液溢出到电阻丝或外壳上时不会发生漏电 电炉或其他加热设备;可满足200mL2000mL水在敞口容器中沸腾10min. 2 BockingReagentI是由Roche公司提供的产品的商品名 给出这一信息是为了方便本部分的使用者,并不表 示对该产品的认可 如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T28630.1一2012 5.8微量移液器;量程0.5A10AL 5.9温度计;量程0C100C,精度士1C 操作步骤 6 样品的准备 .1.1样品采集的要求见GB/T28630.4一2012中附录B的规定 6. 6. .1.2取对虾的个体(适用于3em以下幼虾、仔虾,幼体和受精卵)或对虾的胃或飓丝组织(适用于活 体或冰冻的养成期幼虾,成虾和亲虾)样品约0.1g,置于1.5mL灭菌塑料微型离心管中,加人0.3mL 研磨液,用研磨棒将样品充分研磨后,于8000r/min~10000r/min离心2min取上清备用 6.1.3为防止交叉污染,接触样品的工具及研磨棒要浸于新配制的有效氯含量3,0×10-含氯消毒剂 中5min,再充分清洗后方可用于下一个样品 6.2核酸探针的制备 模板为纯化病毒核酸 标记之前需优化并确定CR反应条件 100L反应体系.10AL.10x PCR缓冲液、1AL10mmol/L.dTTP,2LdNTP,8AL25mmol/LMgCl,5AL引物F(10ng/AL) 5L引物R(10ng/L)、2L模板、灭菌双蒸水66aL;混匀后,进行一个热启动(94C10min、55C 5min);离心后加人1L TaqDNA聚合酶(5U/aL),进行35个循环(92C30s,52C30s,72C 1min),72C5nmin后4C保存 PCR产物大小:546bp 6. 2.2核酸探针标记方法按照4.4的说明进行 6.3泡膜 按样品数量隔着衬纸在杂交膜上用软铅笔划格,每样为5mm×5mm小格,同时要加上阴性对照 和阳性对照的数目.沿框线将所需大小的杂交膜剪下,共需两张 左上角剪角的一张为测试膜,左上角 用软铅笔点点标记的为对照膜 将杂交膜飘浮于蒸溜水表面,吸水后沉人水中10min,后浸泡于泡膜 液中5min,再将膜置于滤纸上晾干 6 点样 将准备好的样品上清液(包括阴性对照和阳性对照)在100C水浴中煮沸10min,再迅速置于冰水 浴中2min以上 稍离心使管内水珠集中,在晾干的测试膜和对照膜相应方格内点样,每样1L，自然 晾干 6.5交联 将晾干的杂交膜夹于两张滤纸中间,放于80C烘箱中烘烤2h 6.6预杂交 按杂交膜大小准备适量的预杂交母液(0.2mL/em')并加人封闭剂每毫升预杂交母液加人10mg 封闭剂),在65不断搅动溶解 将两张膜分别置于两个杂交袋中,加人溶有封闭剂的预杂交母液,封口,在65C水浴中孵育2h 杂交 按膜大小计算所需探针含量:每毫升溶有封闭剂的预杂交母液中加人1AL4L标记核酸探针
GB/T28630.1一2012 将探针于100C水浴中煮沸10min,再迅速置于冰水浴中,2min后,剪开测试膜杂交袋一角,加人探 针,封口 混匀袋中液体,两个杂交袋在65C水浴中孵育6h16h. 加入抗体 按杂交膜大小,在适量1×缓冲液A(0.2ml/em')中加人封闭剂(每毫升1×缓冲液A加人10mg 封闭剂),在70C90C水浴中不断搅动溶解 完全剪开两个杂交袋,取出杂交膜,按下列步骤洗涤 a)1×清洗液I,5min/次×2次,室温(在洗涤皿中进行,间歇摇晃); b 1×清洗液l,15min/次×2次,65C(在杂交袋中分别进行，>0.5mL/cm',每次换袋); 1×缓冲液A,2min/次×1次,室温(在洗涤皿中进行,间歇摇晃); D 将两张杂交膜分别置于两个杂交袋中,加人溶有封闭剂的1×缓冲液A,封口,室温放置 30min; 剪开两个杂交袋一角,分别加人1/50体积的100×碱性磷酸酶偶联的DIG抗体(AP抗 DG),在振荡器上于室温振荡30" mln 显色 完全剪开两个杂交袋,取出膜,按下列步骤洗涤， 1×缓冲液A,15min/次×2次,室温在平皿中进行,间歇摇晃); b)1×缓冲液B,2min/次X1次,室温(在平皿中进行,间歇摇晃) 将两张杂交膜分别装于两个杂交袋中,加人溶有显色剂A和显色剂B的1×缓冲液Bo.2mL/cmi). 封口,置于暗盒中显色15nin~120min(显色时间与温度有关) 中间可取出短时间观察,勿搅动,观察后 立即放回 6.10观察 测试膜上阳性对照样品明显出现颜色而杂交膜本底刚有所变色时,立即剪开杂交袋,取出膜,置于 蒸水中漂洗15min30min终止显色 将膜置于滤纸上晾干 对光观察,记录结果 结果判定 7.1测试膜上阳性对照样品的显色应为淡蓝褐色,阴性对照样品无色,对照膜上两个样品均无色 膜 上的黄色、红色等颜色都不属于病毒导致的显色 检测结果的判定要将测试膜与对照膜对照进行 测 试膜上样品斑点显蓝褐色而对照膜对应斑点不显色或颜色比测试膜上浅得多时,该样品判断为阳性 依据显色结果强弱分为弱阳性结果(十、阳性结果(十十,+十十)和强阳性结果(十十十十). 7.2测试膜斑点不显色,该样品判断为阴性 7.3测试膜与对照膜均有明显的颜色,表明样品存在明显的非特异性反应干扰,测试结果无效,应重新 取样检测 白斑综合征(wSD)核酸探针斑点杂交检测结果示意图参见附录C 阳性结果表明存在wSSVDNA 活虾和敏感宿主阳性表明已受到wSsV感染;对虾产品和其他 产品阳性表明携带wSSV 7.5结果可疑时,补充组织病理学诊断或PCR检测进行结果确认
GB/T28630.1?2012 ?A 淶?? ?? A.1??(20SSC ?(NaCD 175.32g (2H,(O) 88.23g 1000 ??? ml pH7.0 ?,档 A.2?? 20SSC 125ml 0.5mol/LEDTA 70mL 10%SDS 50mnL ? 2.5ml Tris?(??)? 15mL20mL ? 500ml ?????4C,??? A.35xSSC' 20SSC 250ml ? 750ml ,0.45um??C ???? 5Ssc 10ml 20%Sarkosyl 50L 20a 10%SDs ,4C档 A.510?A Tris 121.1g (NaCD 87.7g 800 ?? ml ?pH7.5
GB/T28630.1?2012 1000mL ?? ?,4C档 A.61?A 100ml 10?A 900ml ? ,0.45m??,4C档 A.710?B Tris 121.1 g ?(NaC 58.4 e 800ml ?? ?H.5 ???(MgC6H,o) 101.6g ?? 1000ml ,0.45um??,4C,? A.81?B 10?B 100ml ? 900ml ,0.45Am??4C,? A.91??I 20Ssc 10ml 10%SDs 0.lml ? 100ml ,,??????á A.101??I 20SsC 0.5ml 0.1 10%SDs ml ? 100ml ,,??????á A.11?A 100 ?(NBT mg 0.931ml ?
GB/T28630.1?2012 0.402ml ? ?,?20C档 A.12?B 1001 5--4--3--?(BCIP mg 2mL ? ???20档 A.13?A?B1?B 1?B 1mL ?A 4.5Al ?B 3.5l ?á
GB/T28630.1?2012 ? B ?? ??(wSSw)???? AGTTTCCAGAAGACAACATAATTTAGCTGTAATTGGACGAGGAGACTTCTTGTAATGAG GAACCACAAAATTCTTcTTcCCGTCTTTTCTGGTATAAAAGTAGTCCCATAATATGTTCC 61 121TTCTGGACTACCACATTATCTTCGTTAAGGGAACANTATCTGACCGACTTTCTCATCAA 181GGGCTGATCTCCANTTTCTTGTTGTGCTTAGAGCCGANTTTGTNTTCCCCGTCG:TTCACGTT 241ANTAGTTGCANTATAGAACAGTGGGATGAAAGGAACTGTCGGTTACGTGTTCAGTTGTAC 301AAGATAACTGGACGCANTTTGCTAG:TTCTGGAGGGACGTCCTGGTTTTGTTTATTGTTGA 361AGTAGGTTTTATCTTTTCCTATTTAAGCACACACCCTTTGAATTAATGTGTATGCGANTT 421CGCATTGATGTANTATGCAGATTGTG;AGTGCTGGAGAAAATGGTATCTCAAAATCGGTAGc 481TGGTTCATAANTTTCTGGTTCAACTTCCTGTTGTTCTTCTTCCTCATCTTTCTCTTCCTT 541ATTTTTGACACCTAGAACTCTAAGGTTGGCAGTACTAATTATTCTGGCTGCAGCCGTGCT R 6o1GGTAGCAGAAGGGGAAGA
GB/T28630.1一2012 附 录 c 资料性附录 白斑综合征(wSD)核酸探针斑点杂交检测结果示意图 -阳性对照 D4 D5 -阴性对照; B1 强阳性结果,，+ C4 -阳性结果,十 C5 阳性结果,十十 弱阳性结果,十 C1 其他为阴性结果 图c.1白斑综合征(wSD)核酸探针斑点杂交检测结果示意图

白斑综合征(WSD)诊断规程第1部分：核酸探针斑点杂交检测法GB/T28630.1-2012

白斑综合征(WSD)是一种严重危害虾类养殖业的病害，已成为全球性问题。为了准确快速地对WSD进行诊断，国家标准化管理委员会发布了GB/T28630.1-2012《白斑综合征(WSD)诊断规程第1部分：核酸探针斑点杂交检测法》。

该标准规定了核酸探针斑点杂交检测法在WSD诊断中的应用。具体来说，该方法采用特异性核酸探针与WSD病原体DNA杂交，通过检测杂交后形成的斑点来判断样本中是否存在WSD病原体。该方法具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性好等优点。

在执行该方法时，标准规定了样本采集、DNA提取、核酸探针标记等技术要求，以保证测试结果的准确度和可靠性。此外，为了能够更好地应对实际检测需求，该标准还规定了检测方法的适用范围、设备和试剂的选择等内容。

总之，GB/T28630.1-2012标准为白斑综合征(WSD)诊断提供了一套科学、规范、可靠的核酸探针斑点杂交检测法，有助于提高WSD的诊断水平和防治效果。

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2022/10/28 18:47:59 现行