GB/T28099-2011
水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofXanthomonasoryzaepv.oryzicola(Fangetal.)Swingsetal.
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2012-06-01
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
- 文件大小1.19M
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水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法
国家标准 GB/T28099一2011 水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofXanthomonasory:aepv.orycicola(Fangetal. Swingsetal 2011-12-30发布 2012-06-01实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T28099一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标淮起草单位上海出人境检验检疫局、厦门出人境检验检疫 局、江苏出人境检验检疫局、重庆出人境检验检疫局、南京农业大学
本标准主要起草人;易建平,林石明,周国梁、粟寒、印丽、孔德英,许志刚,胡白石
GB/T28099一2011 水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法 范围 本标准规定了水稻细菌性条斑病菌的检测和鉴定方法
本标准适用于水稻种子及植株上水稻细菌性条斑病菌的检测与鉴定
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件
SN/T0800.1进出口粮油、饲料检验抽样和制样方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 水稻细菌性条斑病菌基本信息 中文名;水稻细菌性条斑病菌稻黄单胞菌稻生致病变种 学名:Xanthomonasory2uepv.oryzicola(Fangetal.,1956)Swingsetal.,1990,简称xYoc 异名:Xanthomonascamestri、pv
oryzicolaFangetal.，1956Dye1978;Xanthomona yeicola(Fangetal.,1956)Dowson1943;Xanthononastranslwcens f.sp.oryeicola(Fangetal., 0 1956)Bradbury1971
streakofrice
病害英文名:bacterialleaf 属细菌界Bacteria,变形细菌门Proteobacteria,y-变形细菌纲Gammaproteobacteria 黄单胞菌目 Xanthomonodales,黄单胞菌科Xanthomonodaceae,黄单胞菌属Xanthomonas(Dowson,1939) 病菌主要在病种子和病草上越冬,其次在水稻再生苗或李氏不等杂草上越冬
病菌主要借雨水,流 水等传播.带菌种子是远距离传播的主要途径之一 水稻细菌性条斑病菌的其他信息参见附录A
方法原理 根据症状特征、菌落形态特征、生理生化特征、,PCR反应和致病性测试结果等进行检测鉴定 主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂
三羚甲基胺基甲烧盐酸盐(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烧基硫酸钠(sDS)、十六烧基 三甲基襟化胺(cCTAB)、三氯甲炕、异戊醇,乙醇、蛋白酶,潦化乙锭,酵母粉、琼脂、蛋白陈、牛肉浸膏、营 养肉汤、葡萄糖、蔗糖、谷氨酸钠
培养基和试剂配方见附录B.
GB/r2809g一2011 仪器用具 超净工作台、高压灭菌锅、生物显微镜、培养箱、电子天平,冰箱、离心机,水浴锅、培养皿、三角瓶,剪 刀、电泳仪、PCR仪、凝胶成像系统、BIOL0G微生物鉴定系统、微量可调加样器和离心管
检测与鉴定 7.1现场检疫 按照SN/T2122和sN/T0800.1规定的程序进行现场检疫并抽取样品 7.2实验室检测 有症叶片的分离 7.2.1 有症叶片用无菌水冲洗后取病斑前沿2mm~7mm部分用70%酒精表面消毒15s,无菌水洗三次 后用无菌剪刀剪碎,置于无菌载玻片上,加一滴无菌水,不加盖玻片,置于显微镜下观察喷菌现象,如观 察到喷菌现象,从喷菌处用接种环取一环处理液在NA(PSA或NBY)培养基平板上划线分离,重复3个 平板,27C培养3d5d. 7.2.2无症叶片的分离 取10张无症叶片,剪碎研磨后提取DNNA,进行PCR检测,DNA提取程序和PCR检测程序见附 录C
阳性样品进行病菌分离
另取无症叶片10张,无菌水冲洗叶面.70%酒精表面消毒15s,无菌水 洗三次后用无菌剪刀剪碎,加人适量无菌水,静置15min,用接种环取处理液在NA(PSsA或NBY)培养 基平板上划线分离,重复3个平板,27C培养3d5d
7.2.3从种子中分离 种子处理液在培养基上富集后进行PCR检测.100总种子磨碎后置于200mL含有0.01% Tween20的无菌水中4过夜,取100L处理液在PsA培养基平板上涂布,重复3个平板,27笔培养 2d,每个平板用lmL无菌水洗下,取洗板液用于rCR检测,阳性样品进行病菌分离
取种子处理液 1mL在无菌水中系列稀释三次,分别取稀释和未稀释的处理液100L在NA(PSA或NBY)培养基平 板上划线分离,重复3个平板,27C培养3d5d.
7.3鉴定方法 7.3.1形态特征鉴定 NA培养基上菌落平滑,不透明,有光泽,圆形,凸起,边缘完整;初始为白色,后变为浅黄色;NBY 培养基上的菌落浅黄色,圆形,凸起,粘液状;PSA培养基上菌落浅黄色,粘液状,有光泽
挑取可疑菌 落在NA培养基平板上纯化三次后进行鉴定
7.3.2生理生化鉴定 病菌能使明胶液化,使石燕牛乳陈化,使阿拉伯糖产酸;不还原硝酸盐,产生氨和硫化氢;不产生咧 嗓;可分解蔗糖、葡萄糖果糖、木糖和乳糖等产生酸,但不产生气体;对青霉素,葡萄糖反应钝感
也可 用BIOL0G微生物自动鉴定系统进行鉴定
GB/T28099一2011 7.3.3PCR方法鉴定 制备分离物10'CFU/mL细菌悬浮液，lml
菌悬液提取DNA后进行PCR检测,检测程序见附 录C 致病性测试 三种鉴定方法之一为阳性的分离物进行致病性测试
30d45d龄期大小的IR24或汕优63种植 在12h光照/黑暗的循环条件下,最适温度为28C32C/22C白天/夜晚)
用无菌生理盐水配制 10'CFU/mL细菌悬浮液,无菌接种针蘸取菌液后针刺接种于叶片中部,每张叶片针刺两个点,共接种 30张一40张叶片
接种植株用塑料袋保湿24h,12h光照/黑暗的循环条件下30C培养,接种48h 72h后观察症状,最长至14d
初始症状为接种点出现红色条斑,通常10d后显症,病斑边缘为线条 形,沿叶脉扩展
如果产生典型症状,从接种病斑上再次分离病菌,培养基上形态特征相符或PCR检测 为阳性即可认为接种分离物为水稻细菌性条斑病菌
结果判定 从样品中分离得到的可疑分离物用形态特征,生理生化或CR检测等三种方法之 进行鉴定;阳 性分离物进行致病性测试,出现典型症状,判定为检测出Xoe;其余情况判定为未检出Xoe 样品保存 阳性种子样品至少保存6个月,至少1000粒,以备复核、谈判和仲裁;阳性的植物材料及时销毁处 理;分离菌株应妥善保存,将菌株转接到NA试管斜面上,28C培养48h
然后置于4C冰箱中保存,定 期(30d)转接;或在菌悬液中加人15%一30%甘油于一80C下保存;必要时可将菌株冻干,一80C下长 期保存
GB/r2809g一2011 附 录A 资料性附录 水稻细菌性条斑病菌其他信息 A.1检疫重要性 《进境植物检疫性有害生物名录>(2007年)中的检疫性有害生物之一,目前国内受 害病区已超过11个省
欧洲和地中海国家植物保护组织(EPPO)的A1类检疫性有害生物
目前分布 于热带亚洲地区、西非和澳大利亚等地
A.2寄主植物 主要寄主是水稻Oryza.satia;其他寄主包括;稻属Oryxaspp.,李氏禾属Leersiaspp.,丝千金子 Leptochloaiiformis,圆果雀碑Paspalumorbiculare,娄白Zizaniaaquatica,沼生荻Z.palwstris和结 缕草Zoysiajaponica
A.3形态特征 病菌为革兰氏染色阴性,短杆状,大小(0.44m~0.6m)X1.1Hm2.04m);无芽袍和荚膜,菌 体外具粘质的胞外多糖包围;单生,很少成对,不呈链状;极生鞭毛一根
最适生长温度25C28C 生长温限838
A.4症状特征 整个水稻生育期的叶片均可受害
病菌进人气孔在叶片薄壁组织内繁殖,主要感染叶片薄壁组织 细胞,局部侵染
病斑初呈暗绿色水请状半透明的小点,渐形成叶脉间透明条斑,限在叶脉之间延伸,颜 色由黄褐转橙褐色,这种透明条斑与白叶枯病的不透明症状差异明显
病斑上常泌出许多露珠状的蜜 黄色菌脓(参见图A.1)
病情严重时,许多条斑融合,连接在一起,成为不规则的黄褐色至枯黄色斑块， 此时病叶枯萎,变褐,最后死亡,后期的症状与白叶枯病有些相似(参见图A.2).
GB/T28099?2011 ?A.1???? ?A.2??
GB/r2809g?2011 B ? 淶?? ?? B.1NA ?5g,?3g,?18g,??1000mLpH6.87.0,121C?15min B.2NBYNutrienBrothYeastExtraetAgarMedim) Sol.1:?8g;?2g;KHPO2g;KHPO0.5g;?18g;?950ml Sol.2;5.0g??50.0mLС Sol.3;lmol/LMgsO7H,O1mL(2.46gMgSO7H.0?10mL?) ?121C?15min,??45C~50C???塣 B.3sA 10g,?10g,?1g,?17g,??1000mL,pH6.87.0, ?121C?15min. B.4TE-? 1mol/LTris-HCl,pH80.5mol/LEDTA??,1mol/LTris-HClI,10mL;0.5mol/L EDTA,2ml;?1000ml B.510%sDs(??) 10g100ml? B.6CTAB(?? 10gCTAB100ml0.7mol/INaCI?(0.7mol/INaCl:4.1gNaCl10ml.? B.75TAE? 54gTris;27.5g;0.5mol1EDTA,pH8,20mL;?1L?0.5 TAE?
GB/T28099一2011 c 附 录 规范性附录 CR检测方法 C.1DNA提取程序 叶片样品组织3g一5g在研钵中研磨后取0.lg转人1.5mL离心管,提取DNA;从种子或叶片上 分离的菌株,NB培养基中30C振荡培养过夜,取1.5mL转人离心管,12000r/min离心10min,弃上 清液,沉淀提取DNA;组织浸出液1 Y? r/min离心10nmin,弃上清液,沉淀提取DNA
000r 20 DNA提取步骤:加人500ALTE缓冲液悬浮沉淀,加人10%SDs75ML和10mg/mL的蛋白酶 10pL37轻轻振荡孵育1h;加人5molLNacCl120AL，上下颠倒几次充分混匀,加人cTAB(10% CTAB溶于0.7mol/LNaC溶液中)100l;充分混匀后65C孵育20min;加人等体积(约700AL)的 三氯甲烧;异戊醉(24:1),振荡混匀30min;室温下15000r/min离心30min,取上层水相转人离心 管;加人等体积的异丙醉,室温下15000r ,弃上清液,沉淀转人750L70%乙醇中(乙 /min离心30min 醇洗前可以放人冰箱中过夜);14000r/min离心8min,沉淀在空气中干燥后溶于50ALTE中(可70C 孵育加快溶解),4C冰箱中保存备用
商用kit也可用于样品DNA的提取
C.2引物 上游引物XooeF;5atatgeetgE[eeEtga.3;下游引物xooeR.5ttgEtaegegatgeettgeEaegg3;扩增 产物为338bp C.3PCR反应体系 PCR反应体系(G0L)10×PCR缓冲液,2.5mmolL的MgCl.,0.2mmolL的各种dNTP混合 物,2U的TaqDNA聚合酶,25pmol/1的每对引物各1.0ML,2L.的细菌悬浮液或DNA模板
C.4CR反应条件 94C5min;94"C30s,62C30s,72C1min,35个循环;72C10min
c.5电泳分析 取10L扩增产物与3AL的6×上样缓冲液混合均匀,在0.5×TAE缓冲液配制的1.5%琼脂糖 凝胶中,4V/em~6V/cm电泳30min,澳化乙锭(EB)染色后在成像系统中观察,拍照并保存
c.6PCR结果判定 阴阳性对照正常的情况下,如果扩增出338bp的特异性条带表明样品中存在Xoc
水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法GB/T28099-2011
水稻是我国的重要粮食作物之一，但由于气候、土壤等因素的影响，水稻很容易受到各种病害的侵袭。其中，细菌性条斑病是一种常见的病害，严重威胁着水稻的产量和质量。
因此，对于进出口种子、苗木、农产品以及相关检疫工作，对水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定非常重要。我国已经制定了GB/T28099-2011标准，规定了水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法。下面我们来详细介绍一下这个方法的具体步骤。
一、样品采集
样品采集是检疫鉴定的第一步，也是非常关键的一步。在采集样品时，需要注意以下几点：
- 样品应该来自于病株上的病斑组织或含有病菌的种子和苗木等样品。
- 采集时要避免污染，使用消毒工具，尽量避免手接触。
- 样品应该及时送到实验室进行后续处理。
二、分离培养
在实验室中，需要将采集到的样品进行分离培养，以便获得纯净的水稻细菌性条斑病菌菌株。具体步骤如下：
- 取小块样品，消毒后放入无菌离心管中；
- 加入适量的无菌蒸馏水，摇动离心管使样品均匀悬浮；
- 取少量悬浮液涂抹在琼脂平板上；
- 在28℃条件下培养，待菌落出现后进行移植。
三、生化鉴定
在获得纯净的菌株后，需要进行生化鉴定。这个步骤主要是通过检测病原菌的代谢产物和酶活性等生化特征来鉴定水稻细菌性条斑病菌。具体步骤如下：
- 选取生长良好的菌落，制备细菌液；
- 加入不同的生化试剂，观察颜色变化、气味、沉淀形成情况等；
- 根据实验结果，判断是否为水稻细菌性条斑病菌；
- 如果是水稻细菌性条斑病菌，则需要进一步进行分子鉴定。
四、分子鉴定
分子鉴定是检疫鉴定的重要手段之一，能够更加准确地鉴定水稻细菌性条斑病菌。具体步骤如下：
- 提取细菌DNA；
- 使用引物对目标基因进行PCR扩增；
- 进行电泳分析，判断扩增产物大小和数量；
- 进行序列分析，与数据库比对，确认鉴定结果。
总的来说，水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法GB/T28099-2011包括样品采集、分离培养、生化鉴定和分子鉴定等多个步骤。这些步骤都是非常关键的，只有在各个步骤都操作正确的情况下，才能准确鉴定水稻细菌性条斑病菌。
