GB/T31790-2015
马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofPotatospindletuberviroid
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2015-11-27
- 文件格式PDF
- 文本页数14页
- 文件大小1.11M
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马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法
国家标准 GB/T317902015 马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofPotatospindletnberiroid 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中毕人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管厘委员会国家标准
GB/T31790一2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
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本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标准起草单位;检验检疫科学研究院、黑龙江出人境检验检疫局、中华人民 共和国厦门出人境检验检疫局、福建出人境检验检疫局、黑龙江省农业科学院植物脱毒 苗木研究所,甘肃出人境检验检疫局、山东出人境检验检疫局
本标准主要起草人;张水江,刘洪义,刘忠梅、辛言言、陈慧、陈红运、马洁、昌典秋沈建国、廖富荣、 文朝慧、张成标,吴兴海
GB/T31790一2015 马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了基于寄主植物症状及基因组特征的马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法 本标准适用于可能携带有马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯组织材料的检疫鉴定
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18133马铃薯种兽 sN/T2481进境马铃薯种薯检疫操作规程 仪器设备、用具及试剂 3.1仪器设备 电子分析天平(0.001g,垂直电泳槽、小型离心机、台式冷冻离心机、普通PCR仪,实时荧光PCR 仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、4C冰箱、超净工作台、一80C超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、 涡旋振荡器、微波炉等
3.2用具 可调移液器(25L..0,L.0L.I0AL.Iwo,L)入,吸头,离心管(02mL.0
mL.l.5mb)及研 钵等
3.3试剂 除有特殊说明外,所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂
R-PAGE试剂见附录B;RT-PCR试剂见附录C;实时荧光RT-PCR试剂见附录D 检测方法 4.1样品制备 4.1.1脱毒苗制样;对脱毒苗要逐株制样,在无菌条件下,从脱毒凿上剪下长2cmm的茎段,放于小研钵 中,用于提取核酸并进行后续检测;把取样的脱毒苗放回试管中,封好管口并编号,以便根据检测结果决 定取舍
4.1.2种薯制样;在隔离种植前对种薯块茎进行症状检查,对有明显症状的薯块,直接取症状部位0.2g~ 0.5g用于核酸提取并进行后续检测;对于无明显症状的薯块进行隔离种植
4.1.3隔离种植植株制样;种薯隔离种植按照sN/T2481的规定执行,生长温度应至少高于18C(更
GB/T31790一2015 适宜的温度是高于20C)和至少16h的光周期
在生长期间进行严格的症状检查,症状参见附录A
在花朋或接近花期时,对可疑症状的植株,每株采取植顶部完全展开的叶片0.2《一05区单独制样 用于核酸提取并进行后续检测;如果没有发现可疑症状,可5株混合采样用于核酸提取并进行后续 检测
4.1.4田间植株制样;对田间生长的植株作整体观察后,对症状可疑的植株,每株采集症状叶片0.2g~ 0.5只单独制样,进行核酸提取并进行后续检测;如果没有发现可疑症状,则按GB/T18133的要求每 5株混合采样,进行核酸提取并进行后续检测 4.2R-PAGE测定 R-PAGE测定见附录B 4.3RI-PCR检测 RT-PCR检测见附录C
实时荧光R-PCR检测 4,4 实时荧光RT-PCR检测见附录D. 结果判定 显症马铃薯样品经4.2,4.3及4.4中的一种方法检测为阳性,则判定样品携带PSTVd;无症马铃薯 样品经单一方法检测为阳性,需不同原理的检测方法确认一次,两次结果均为阳性,则判定样品携带 PsTVd
样品保存与结果记录 样品保存 结果判定为阳性的样品应妥善保存,并作好登记和标记,以备复核用
保存期满后,需经灭活处理
6.2结果记录 完整的试验记录应包括;样品的来源,种类,时间,试验检测时间,地点、方法和结果,并有试验人员 的签字;种薯隔离种植的显症植株应有显症照片;R-PAGE测定应有银染色结果图片,RT-PCR检测应 有电泳结果图片,实时荧光RT-PCR检测应有扩增曲线结果图片
GB/T31790一2015 附录 A 资料性附录 马铃薯纺锤块茎类病毒相关资料 A.1背景资料 马铃薯纺锤块茎类病毒基本信息 A.1.1 indlletuberuiroidl
学名;Poatospin 缩写;PSTVd. 异名;Potatopindletubervirus,Potatogothicvirus和Tomatobunchytopvirus 分类地位;马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pos力iuiroidae),马铃薯纺锤块茎类病毒属(Posbiuiroid) 传播途径;远距离传播主要通过国际间或地区间种薯贸易;田间可通过机械接触及被感染的农机具 等进行传播
A.1.2方法原理 根据PSTVd在寄主植物上的症状进行初步判定;根据其RNA自然状态和变性后的不同结构分子 在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率的差异进行往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(returnpolyaerylamidegel electrophoresis,R-PAGE)检测;根据其基因组特征进行常规RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测,通过 电泳条带大小或扩增曲线的变化进行结果判定 A.2寄主范围 自然寄主有马铃薯(Solatuerown),晋茄(Lyopersicieculenut),鳄梨(Perseaameriana、人 参果(Solanummuricatum、曼陀罗(Dalurasramoniumn、素馨叶白英(Solanumjasminoides)、蓝花 茄(S.rantoneti),果酱木(S/reptosoleniamesonii)和灯笼果(Ph.ysaliseruiana)
人工接种寄主有 31属94种
鉴别寄主:常用的鉴别寄主有鲁特格尔斯番茄Lycopersicon Rutgers)和苣蓉 escuulentncv， Sopolia.sinwensi). A.3地理分布 北美洲:美国(堪萨斯、缅因,马里兰、密西根、纽约、威斯康星,加拿大(阿尔伯特、哥伦比亚、新布伦 斯维克、安大略、爱德华岛,魁北克). 欧洲:捷克、法国、德国,匈牙利、荷兰、波兰、斯洛伐克、瑞士、土耳其、英国、苏格兰、前苏联
南美洲;阿根廷、乌拉丰,巴西,秘鲁、古巴
非洲;南非,尼日利亚
亚洲:阿富汗、印度、日本、(河北、黑龙江、江苏)
大洋洲;澳大利亚(新南威尔士,维多利亚).
GB/T31790一2015 A.4传播途径 被感染的繁殖材料如实生种子及种薯等是远距离传播的主要途径;田间可通过机械接触、汁液接 种、农民的衣物、被感染的农机具及切取块茎的切刀等进行传播
咀嚼式昆虫的传播已有报道,但还未 定论
当sTVd和马铃薯卷叶病毒(Pnaioadral Uir.s， ,PLRV)混合侵染时,PSTVd可通过蚜虫 传播
A.5症状特征 PSTvd侵染马铃薯引起的症状表现与其株系、栽培品种品系及环境条件有关
PSTvd可以引起 植株矮化,茎科直立僵硬,叶片叶柄与主茎的夹角变小,呈半闭半合状和扭曲,叶片叶柄常呈锐角形态向 上竖起
有的全株失去润泽的绿色,有的从上方观察叶子是暗绿色和皱缩的;有的顶部叶片变小,卷曲、 耸立,有的感病植株不表现症状(见图A.1)
块茎变小,畸形,有的顶端变尖,圆形的块茎变长,有的表 面开裂,有的芽眼突出,典型的块茎症状为纺锤形或哑铃形(见图A.2) A.6基因组特征 PsTVd是一种含356个351个核苷酸、具有侵染性、无外壳蛋白、高度碱基配对的棒状共价闭合 环状单链小的RNA分子
PsTVvd的RNA变性后转变为开环状分子,这种开环状的RNA分子在聚丙 烯酰胺凝胶电泳中迁移率比相同相对分子质量的线状分子要慢得多
图A.1受马铃薯纺锤块茎类病毒侵染的马铃薯植株症状
GB/T31790?2015 ?:龥??PsTva??,??;???龥? ?A.2?龥??龥?? ?;?A.l?A.2EPpostandardsPM7/33.Pwatospindletalerospiiroid
GB/T31790一2015 B 附 录 规范性附录) 往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法(R-PAGE) B.1试剂与材料 以下所用试剂,除特别注明者外均为分析纯试剂,水为符合GB/T6682中规定的一级水
B.1.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠(NnEDIA2Ho)溶液(pH8.0 称取乙二铵四乙酸二钠(NaEDTA2H.O)186.1g,溶于700ml水中,用氢氧化钠(NaOH)调 pH至8.0,加水定容至1000ml B.1.2水饱和酚pH4.0) B.1.3焦碳酸二乙醋(DEPC)处理的水 在100mL水中,加人焦碳酸二乙酯(DEPC)50AL,室温过夜,121C高压灭菌20min
B.1.43mol/L.乙酸钠(c,H,Nao3H.o)溶液(pH5.2 称取乙酸钠(CH,Na(O3Hl.O)24.6g,加水80ml.溶解,用冰乙酸(C,H,O.)调pH至5.2,定容 至100mL 1mo/L三羚基甲基氨基甲烧-盐酸(Iris-IHC)溶液(p8.0) B.1.5 称取三羚基甲基氨基甲婉(Tris)121.1g,溶解于800mL水中,用浓盐酸(HcI)调pH至8.0,加水 定容至1000mL,121C高压灭菌201 min B.1.6RNA提取缓冲液 称取三羚基甲基氨基甲烧(Tris)12.12g,氧化钠(NaCl)5.88g,乙二胺四乙酸二钠(Nae,EDTA 2H.O)3.75g,加水至900mL溶解后用浓盐酸(HC1)调pH至9 9.5,加水定容至1000ml,121C高 压灭菌20 min
B.1.75×三胫基甲基氨基甲完-础酸(TBE)电泳缓冲液 称取三胫基甲基氨基甲炕(Tris)27g,棚酸(H,BO.13.75g,量取0.5mol/1乙二铵四乙酸二钠溶 液(NaeEDTA2HO,pH8.0)10ml,加灭菌双蒸水400ml溶解,定容至500ml B.1.830%胶贮液 称取丙烯酰胺(CH,NO)29g,N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(C,HN.O1g,加水定容至100mL,过 滤除菌,4C储存
B.1.910%过硫酸铵[(NH)s.o,]溶液(现用现配 称取0.1g过硫酸铵[NH)S,O.],加水定容至1ml
GB/T31790一2015 B.1.10四甲基乙二胺(TEIED) B.1.115%聚丙烯酰胺(PAM)凝胶 量取5XTBE电泳缓冲液9nL30%胶贮液7.6mL.四甲基乙二胶(TEMED)44L.10%过硫酸 铵[(NH).S,O,]溶液200AL,加水至45mL B.1.12固定液
量取无水乙醉(CH,OH)30ml及冰乙酸(CH,O.)3ml,加水定容至300ml. B.1.13染色液 称取硝酸银(AgNO,)0.6g,加水溶解,定容至300ml
B.1.14显色液(现配现用 在300mL水中,加人氢氧化钠(aOH)3及甲醛(HCHo)1mL.混合均匀
B.1.,15终止液 称取碳酸钠(Na.cO.)3.7g,加水溶解,定容至300mlL
注:电泳中用到的丙烯酰胺(CHNO)是神经毒剂,避免接触皮肤,操作时要带手套
B.2 实验步骤 B.2.1样品RNA的提取 分别称取阴性(健康)对照、阳性(染病)对照及待检样品0.5g,放于灭菌冷冻研钵中,加人1mL RNA提取缓冲液、1mL水饱和酚和1mL三氯甲婉,充分研磨后倒人1.5mL离心管中,于4c下 13000r/min 离心151 nmin,用移液器小心将上层水相移人另一离心管中
再加人3倍体积无水冷乙醉 及 1/10体积的3nmol/L乙酸钠溶液后混匀,-20沉淀1.5h以上
4C下13000r/min离心15min, 弃掉上清液,用1ml70%乙醇清洗沉淀,然后离心,再用吸头彻底吸弃遗留在管中的上清液,在自然条 件下干燥至核酸沉淀变成白色或透明状态,再将核酸沉淀溶于30AL.DEPC处理水中
一20C贮存 备用
注，可采用等效的RNA提取试剂盒完成RNA的提取
B.2.2电泳 正向电泳 B.2.2.1 电泳用5%聚丙烯酰胺凝胶,1×Tris-棚酸(TBE)电泳缓冲液,电泳方向从负极到正极,电流量为每 厘米凝胶5mA
点样量为6L10AL
当二甲苯睛示踪染料迁移到凝胶板底部时停止电泳
B.2.2.2反向电泳 将正向电泳缓冲液倒出,然后把电泳槽放到70C80C的烘箱中预加热,样品变性30min
同时 将倒出的电泳缓冲液在微波炉中加热到80C
倒人电泳槽中,变换电极进行反向电泳
当二甲苯睛示 踪染料迁移到凝胶板顶部时,停止电泳,进行凝胶染色
GB/T31790一2015 B.2.3染色 固定 B.2.3.1 将电泳胶片放在盛有300mL核酸固定液的容器中,轻缓振荡10min后,倒掉固定液
B.2.3.2染色 向容器中加人300m染色液,轻缓振荡15min后,倒出染色液
用蒸僧水冲洗胶板,反复冲洗 4次
B.2.3.3显色 加人300mL显色液,轻缓振荡,直至显现清晰的核酸带,然后用自来水冲洗,反复冲洗4次 B.2.3.4终止 将胶板放人300mL终止液中终止反应 B.3结果判定 在凝胶板下方四分之一处的核酸带为类病毒核酸带,与上部寄主核酸带之间有一定距离,二者可明 显分开
以电泳时载人的阴阳性样品作为对照,进行结果判定;满足前面条件,并出现与阳性对照一致 的条带则判定为阳性;设有相应条带出现为朋性
GB/T31790一2015 C 附 录 规范性附录) RT-PCR检测方法 C.1试剂 c.1.1RNA提取缓冲液或合格的试剂盒 C.1.250xTAE电泳缓冲液(pH8.0 三胫甲基氨基甲烧(Tris)242g、冰乙酸(CH,O.)57.1mL、乙二胺四乙酸二钠(NagEDTA 2H.O)37.2g,蒸憎水定容至1000mL,用时稀释至1×TAE
C.2实验步骤 C.2.1植物材料总核酸提取 可采用附录B或附录D提取植物材料总核酸法,也可采用等效的试剂盒提取总RNA
c.2.2引物合成 上游引物;5'-ATccCCGGGGAAAccTGGAGcGAAC-3” 下游引物:5'-CccTGAAGcGcTcCTccGAG3' C.2.3eDA合成 在样品管中加人5L下游引物(4Anmol/L)及5LRNA样品,混匀,瞬时离心5s;90C温浴 5min,完全变性RNA和引物;4C瞬时离心5s,把样品管放在冰上或一20预冷的冰盒上
在变性过程中,准备RT主要反应液(DEPC水1.9AL,反转录酶I缓冲液4AlL,0.1MDTT2AL RNA酶抑制剂0.5L,25mmol/L.dNTPs0.8AL,200U/aL反转录酶0.8uL;共10lL);混匀,瞬时 离心,冰上顶冷.备用
在变性后的样品臂中加人10,山RT主要反应液,0" `C温浴1h,95C温浴 3min， ,破坏I型逆转录酶活性,瞬时离心
PCR或一20C保存备用
c.2.4CR扩增 每个cDNA样品一式两份;用已知健康、感病的样品的cDNA和DEPC水分别做阴性对照、阳性对 照和空白对照
PCR反应体系见表C.1
反应程序:94C9min15s;94C45s,62C45s,72C60s,40个循环;72C10min
表C.1PCR反应体系 组 分 积/L DEPC水 9.57 AmpliTaq缓冲液(无MgCl 2.2
GB/T31790一2015 表c.1(续 组 体 积/l MgCl,(25mmol/L 1.32 dNTPs(1mmol/L) 4.4 上游引物(204mol/L 1.l 下游引物(20Amol/L . AmpirTaqGoldDNAPoymerase(5U/pL 0.l11 2.2 cDNA模板 22 总体积 C.2.5琼脂糖凝胶电泳 制备1%的琼脂糖凝胶,按比例混匀电泳上样缓冲液和CR扩增产物,用DNAMarker作为分子 量标记,进行电泳分析
电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA 条带,并拍摄记录
C.3结果判定 C.3.1阳性对照在359bp左右处有扩增片段,阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品出现与阳 性对照一致的扩增条带,可判定为阳性
C.3.2阳性对照在359bp左右处有扩增片段,阴性对照,空白对照及待测样品无特异性扩增,可判定 结果为阴性
l0
GB/T31790一2015 D 录 规范性附录 实时荧光RI-PCR检测方法 D.1试剂 十六院基三甲基澳化胺(crAB)提取缓冲液 D.1.1 十六烧基三甲基化胺(CTAB)20g100mmol/儿1三胫基甲基氨基甲烧-盐酸(Tris-HCI)pH8.0) 20mmol/L乙二铵四乙酸二钠(NaEDTA2H,(O),氯化钠(NaCI)81.8g,加燕僧水定容至1L,121C 高压灭菌20min,室温储存
D.1.21%十二婉基磺酸钠(sDs)三胫基甲基氨基甲烧(Iris)乙二胺四乙酸二钠(Na,EDTA2H,o) SDS-TE缓冲液 10mmol/L三胫基甲基氨基甲烧-盐酸(Tris-HCI)pH8.0),1 mmol/L乙二铵四乙酸二钠 NaEDTA2H.O),1%十二熔基碱酸钠(SDS) D.2试验步骤 D.2.1核酸提取 称取100mg一200mg样品组织于研钵中,液氮研磨后加1mL2mLCTAB提取缓冲液(现用现加 上新的1%Naso,,2%PVP40)
将汁液移到1.5mL离心管中,65C温浴30 min;室温13000r/min离 心5nmin
取700Al上清液,加700Al三氯甲婉;乙酸异戊酯(24:1),颠倒混匀;l3000r/min离心 5min
取500上清液,加500l三氯甲烧:乙酸异戊酯(24:1),颠倒混匀;13000r/min离心5nmin. 取上清液,加0.5倍体积的5nmol/1NaCI和等体积预冷的异丙醇,混匀,-20C过夜;13000r/min离 心10nmin.沉淀核酸
用200aL1%SDSTE缓冲液悬浮沉淀;加100aL5mol/LNaCl和300aL预 冷异丙醇.混匀，一20C放置30min;13000r/min离心10min;用400L乙醉洗沉淀,离心4min;留 沉淀,干燥;用100LDEPC水重悬沉淀，-20C保存
D.2.2引物探针合成 PSTVd231F;5'-GcccccTTTGcGcTGT-3' PsTvd-296R;5'-AAGcGGTTcTcGGGAGcTT-3" PSTVd-251T:5'-FAM-CAGTTGTTTCCACCGGGTAGTAGCCGA-TAMRA-3 D.2.3实时荧光RT-PCR反应 取两个离心管,分别配制第一阶段主要混合液(7.5mol/LPSTV-296R1.0AlL,DEPC水3.0L 和第二阶段主要混合液(见表D.1)
每个反应一式两份，一个RNA阳性对照,一个空白对照，一个无感 染RNA阴性对照
按上面规定的顺序和数量加试剂冰浴
准备0.2mLPCR管
向每个管里加 1L总RNA或对照材料,加4L第一阶段的反应液,把管放到PCR仪上
反应程序;:95C3min. tmnin101 1个循环;离心管4C冷却5 min;同时向荧光PCR管加20L第二阶段的反应液;变性完成
GB/T31790一2015 后,吸取第一个反应阶段的混合液加到相应的第二阶段混合液管内,确保这个混合液分散到每个管的底 部;将荧光R管放到实时荧光R仪中 反应程序;48c30nmin;95C,10min;95c15s,601min,40个循环 表D.1实时荧光PCR反应体系 组 分 加样量/Al 10×PETaqGold缓冲液A 2.5 MgCl.25mmol/L) 5.5 dNTPs(6.25mmol/L 2.0 PSTV-231F(7.5mmol/L) 1.0 PSTV-251T(7.5mmol/L 0.5 AmpliTaqGoldDNAPolymerase(5U/al 0.125 M-MLVRtase(2004mol/L) 0.05 灭菌DEPC 8.325 总体积 20 D.3结果判定 D.3.1基线的设置 实时荧光RT-PCR反应结束并分析结果后,应设置无效基线范围
基线范围选择在3个15个循 环,如果有强阳性样本,应根据实际情况调整基线范围
D.3.2结果的判定 在空白对照及阴性对照无C值且无扩增曲线、阳性对照Ct值<30并出现典型扩增曲线的条 件下: 待测样品的Ct值>40时,判定PSTVd阴性
a b)待测样品的Ct值<35时,判定PSTVd阳性
待测样品的35
马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法GB/T31790-2015
随着全球化的进程，各种病毒和有害生物也愈来愈容易通过物品和人员流动进行传播。尤其对于农业，病毒和有害生物的入侵会给农作物带来巨大的损失。其中，马铃薯纺锤块茎类病毒是引起马铃薯感染的主要病原体之一，可以导致严重的经济损失。
为了加强马铃薯纺锤块茎类病毒的防控工作，国家标准化管理委员会发布了GB/T31790-2015《马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法》。该标准规定了马铃薯纺锤块茎类病毒的检测和鉴定方法，为我国的农业生产提供了有力保障。
GB/T31790-2015标准的主要内容包括：
- 术语和定义：明确了标准中所使用的专业术语和定义。
- 样品的采集和处理：对于采样地点、时间、方式和样品数量等进行了具体规定，并详细介绍了不同样品类型（如马铃薯组织、提取液、土壤等）的处理方法。
- 病毒检测方法：该标准介绍了多种检测方法，包括酶联免疫吸附试验、逆转录聚合酶链反应、核酸杂交等，以及不同方法的优缺点和操作流程。
- 病毒鉴定方法：根据病毒性状、寄主范围、分布地域等特征，将马铃薯纺锤块茎类病毒分为不同种类，并介绍了如何根据病毒形态、组成等特征进行鉴定。
- 结果判定和报告：对于检测结果的判定和报告，GB/T31790-2015也做出了详细规定。
总体来说，GB/T31790-2015标准为马铃薯纺锤块茎类病毒的检测和鉴定提供了科学规范，并充分考虑了不同实际情况下的操作流程和检测方法选择。该标准的实施可以有效地防控马铃薯纺锤块茎类病毒的传播，为保障我国农业生产安全做出重要贡献。
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