芒果细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法

芒果细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法

国家标准 GB/T28094一2011 芒果细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentifieationofXanthomonascampestrispv. mangiferaeindieaePateleal.Robbsetal. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T28094一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位;天津出人境检验检疫局、广东出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:刘鹏、罗加凤、崔汝强、魏亚东、王金成、刘勇、赵立荣、黄国明
GB/T28094一2011 芒果细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了芒果细菌性黑斑病菌的检疫鉴定方法 本标准适用于芒果果实,苗木等植物材料中芒果细菌性黑斑病菌的检疫和鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 sN/T1193基因检验实验室技术要求 sN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 芒果细菌性黑斑病菌基本信息 中文名;芒果细菌性黑斑病菌 学名:Xanhon i/erueindicae(Pate,Moniz8& Kulkarni1948)Robbs, nonascampestrispv mangife Ribeiro8.Kimura1974 病害英文名;mangobacterialblackspot 属细菌界Bacteria,变形细菌门Proteobacteria,7-变形细菌纲Gammaproteobacteria,黄单胞菌目 Xanthomonodales,黄单胞菌科Xanthomonodaceae,黄单胞菌属Xanthomonas 病菌潜伏在病叶,病枝条、病果等组织内越冬,是主要的初侵染源 病菌借风雨、流水和接触传播， 远距离传播主要是带菌苗木,接穗和果实等 芒果细菌性黑斑病菌的其他信息参见附录A 方法原理 依据症状特征,以及该病菌的生物学特性、生理生化特性、分子生物学特性和致病性特征等进行检 测鉴定 仪器用具 生物显微镜,超净工作台、商压灭菌器,恒温培养箱、离心机12000r/mim),分光光度计.PCR仪、 电泳仪、凝胶成像仪、电子天平(感量0.0001g)、恒温水浴锅、恒温光照培养箱、低温冰箱、微量可调加 样器(10L,.100AlL200AL1000AL)等 试剂和培养基 6.1试剂 MgCl.dNTPs(dATr,drTP,dCTP,dGTP),Taq酶,氧化酶试纸条,细菌微量生化鉴定管,引物
GB/28094一2011 xEsyronperF,.Xesrconmrperl.X8yrconlsp等购自生物公司 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,所有试验用水均为灭菌双蒸水 6 培养基 NA培养基,半选择性培养基NCTM3和KC见附录B. 检疫鉴定方法及步骤 现场检疫 芒果种植园的病害调查或进出境芒果样品的现场检疫中,若芒果植株或果实病害症状表现与附录 A中描述类似,取样带回实验室做进一步分离鉴定,取样方法和步骤参照SN/T2122. 7.2病原菌分离 选择较新鲜的发病组织,切取病健交界部位,用无菌水清洗三次 在培养皿中滴人几滴无菌水,将 病组织放人无菌水中,并用灭菌玻棒研碎,10min后用接种环蘸取,在半选择性培养基NcTM3或Kc 平板上划线分离,做不少于3个平板 置于28C下,NCTM3培养基培养5d一6d,KC培养基培养 4d~5d后观察 Xem在这两种培养基上菌落特征相似,直径3mm一4mm,圆形,轻微凸起,边缘整 齐,白色或乳白色(少见黄色),黏液状 挑取可疑单菌落点接在氧化酶试纸条上,选择60s内不变色的单菌落(排除假单胞菌)在NA培养 基上进行分离纯化 7.3分子生物学鉴定(rCR方法) 分子生物学检测中安全措施方面要求按照sN/T1193 纯化后的菌株经28C培养24h后,制备模板DNA,扩增gyrB基因,用无菌双燕水代替模板做空 白对照,扩增目的片段大小约为700bp PCR产物回收后测序,测序结果与GenBank数据库中的已知 模式菌株序列进行比对,该检测方法见附录B 7.4生化指标测定 采用生化鉴定管对可疑菌株和芒果细菌性黑斑病菌标准菌株进行下列指标的检测,包括硝酸盐还 原,七叶灵水解,尿酶产生,H,S产生,淀粉水解,明胶液化,阿拉伯糖、纤维二糖、半乳糖和果糖发酵,呵 嗓产生,精氨酸双水解 Xcm生化指标检测结果应为硝酸盐还原阴性,七叶灵水解阳性,HS产生阳性,淀粉水解阳性,明 胶液化阳性,能从阿拉伯糖、纤维二糖,半乳糖和果糖产酸,咧嗓产生阴性,尿酶阴性,精氨酸双水解 阴性 7.5致病性测定 针刺接种苗木在温室或田间进行,离体叶片法接种在室内平皿保湿进行 取在NA培养基上培养 24h的菌株用无菌水配成约为10'CFU/mL的菌悬液接种 用无菌水作阴性对照,芒果细菌性黑斑病 菌标准菌株作阳性对照 接种后的苗木保持湿度90%;离体叶片置培养皿中,叶柄用浸有50×10-" 6-节氨基喋岭(6-BA)培养液的脱脂棉保湿 温度白天30C,晚上26C,光照12h 接种9d后观察是 否出现水溃状病斑
GB/T28094一2011 结果判定 分离纯化得到的细菌菌株同时符合以下三个方面的检测结果,则可以判定检出Xcmn. a)在半选择性培养基上的菌落特征与描述相符; b)生理生化测定结果与描述相符; PCR扩增产物测序结果与已知Xcm的gyrB基因同源性在98%以上;或致病性测定表现典型 c 症状 样品保存 检出Xcm的样品至少保存6个月以备复检,谈判和仲裁;保存期满后,需经灭菌后方可处理 10 菌种保存 分离并最终鉴定为Xcm的菌株应转接到NA培养基试管斜面上,经登记和经手人签字后置于4 低温冰箱中保存,30d一60d转接一次.以防止病菌死亡.以备复核.谈判和伸裁 必要时将菌株用真空 冷冻干燥机冻干后长期保存
GB/28094一2011 附录A 资料性附录 芒果细菌性黑斑病菌其他信息 A.1分布 巴西、南非、苏丹,埃及、巴拉、多米尼加、马拉维、墨西哥、刚果,莫桑比克、法属丰亚那、索马里、摩 洛哥、印度、巴基斯坦、澳大利亚、马来西亚、日本、(台湾、广东、海南) A.2寄主范围 nlale),巴西胡椒(S:hin nacarliuumoccidlen 芒果(NMangiferaindica),腰果(An nthiolius)、加 nsterebe 椰芒果(Spondiascytherea)、槟榔青(Sondiasmombin)等漆树科植物 人工接种也可以侵染野芒果 Spondiasmangifera)和紫藏科(Bignoniachamberlayni)植物等 A.3危害 芒果细菌性黑斑病主要危害芒果叶片、枝条、花芽,花和果实 感病叶片开始时呈水溃状斑,后扩展 为褐色至黑色的多角形病斑,表面隆起,周围常有黄晕,大小约1 3mm,病斑边缘常受叶脉限制 mm 有时多个病斑融合成较大的病斑,老病斑最后转为灰白色 枝条和花穗发病呈黑褐色溃杨斑-有些病恋 开裂,伴有胶黏汁液渗出;果实上病斑呈水溃状小点,直径1mm1.5mm,常有胶粘汁液流出,后扩大 成黑褐色,表面隆起,溃疡开裂 嫩茎感染后明显褪绿,并纵向开裂,渗出胶液变成黑斑 各部位病组织 作显微镜检查,有大量细菌溢出 A.4生物学特性 病原菌在NCTM3和KC培养基上菌落特征相似,培养6d后菌落直径3mm一4mm,圆形,轻微 凸起,边缘整齐,白色或乳白色(少见黄色),黏液状 在营养琼脂(NA)培养基上菌落圆形,白色至乳白色,也有黄色 在KB培养平板上,菌落为薄圆型,轻微凸起,边缘整齐 菌落颜色最初为灰白色,逐渐变为白色到 乳白色 老龄菌落逐渐变为浅黄褐色 不产生荧光 一1.@pm),极生单鞭毛,革兰民染色阴性,运动,好 病原菌菌体杆状,(0.3Am一0.6Am)×(0.9m 氧,葡萄糖氧化非发酵型,氧化酶阴性,接触酶阳性,淀粉水解阳性,明胶液化阳性,牛奶解阮阳性,硝酸 盐还原阴性,Hs产生阳性,呵嗓产生阴性,尿酶阴性,脂肪酶阳性,纤维素酶阳性,酪蛋白酶阳性,果聚 糖阳性,精氨酸双水解阴性,七叶灵水解阳性;能从阿拉伯糖、甘露糖,果糖、纤维二糖,半乳糖和海藻糖 产酸 可利用D-葡萄糖,纤维二糖,麦芽糖,D-甘露醇,D-甘露糖,赤藓糖醇,棉籽糖,L-鼠李糖,D核 糖,蔗糖,海藻糖,D-木糖,卫矛醇,D-半乳糖,肌醇,菊粉,甘油,醋酸盐,柠檬酸盐,延胡索酸盐,苹果酸 盐,水杨背,淀粉;不利用D-葡萄糖醇,D-葡糖酸盐,松三糖,草酸盐,苯丙氨酸,核糖醇,酒石酸盐 对部 分重金属和抗生素敏感,在番茄上产生过敏性反应,最适生长温度28C,37C能生长,41笔不生长 芒果细菌性黑斑病菌与相近种的主要区别见表A.1
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GB/28094一2011 附 录 B 规范性附录 培养基配制和CR检测方法 B.1培养基 B.1.1NCIM3培养基 酵母粉7g,蛋白陈7g,葡萄糖7g,琼脂15g,蒸憎水1000mLpH7.2 121C湿热灭菌20minm 后,温度降至50七左有,依次加人新霉素1mg/几.头抱氨苦100mgL甲氧节氨喘院5了nmgL.,匹美西 林100mg/L.丙环哗20mg/L B.1.2KC培养基 酵母粉7g,蛋白胯7g,葡萄糖7g,琼脂15g,蒸憎水1000mL,pH7.2 121C湿热灭菌20n min 后,温度降至50C左有,依次加人头抱氨卡40mg/L春雷霉素20mk/L.,内环瞠20mg/儿. B.1.3NA培养基 蛋白陈5g,牛肉浸膏3g,琼脂15g,燕僧水1000mL 121C湿热灭菌20min. B.2分子生物学鉴定方法(PCR方法 B.2.1DNA制备 纯化后的菌株经28C培养24h后,用接种环取一环菌于含1ml无菌双燕水的离心管中,用分光 光度计调节A650=0.1,然后将该菌悬液100C水浴煮沸8nmin,一20C放置10min后待用 B.2.2gyr基因扩增 PCR扩增53yrB基因,引物为Xey SgyrconperF1(5'-AAGAGCGAGCTGTATCTGAAGGACGA3'). Xeyrconrpeil(6'cccGTccTcGATccccAccTGcA-3') 反应体系为(50pL):10×PCR缓冲液 含Mg(Cl)5AL,dNTPs(各2.5mmol/L),lAL;引物(10pmol/L)各1L;TaqDNA聚合酶0.4AL ;94C40s,50C DNA2Al 用无菌双燕水代替模板做空白对照 反应条件为94它预变性5min 50s,721min,共32个循环;72C延伸7， mIn B.2.3琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,扩增产物片段大小约为700bp 每个样品取5AL的PCR 产物加1L的6×上样缓冲液,在120V下电泳(约501 电泳结束后,放人装有0.54g/AL的化 min 乙锭(EB)溶液的容器中染色,然后在清水中清洗后,在凝胶成像系统中观察,拍照并保存 B.2.4测序 将PCR产物回收后,进行克隆、测序,或者直接测序(测序可由生物公司完成) 测序引物为Xgyr confspl(5'-GAGCTG;TATCTGAAGGACGA-3') 测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行 比对

芒果细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法GB/T28094-2011

芒果细菌性黑斑病是由细菌引起的病害，如果不及时发现和控制，会导致芒果产量和品质的下降。因此，对芒果进行检疫和鉴定至关重要。GB/T28094-2011规定了一种有效的检疫鉴定方法。

首先，对于检疫样品的采集，需要选择健康、有代表性的芒果果实进行采样。采样时要注意避开受病害侵染的部位，如病斑、软腐等。采样工具也应该对样品不产生伤害。采样完成后，将样品放入密闭袋中，标注好相应信息。

其次，检疫鉴定的样品处理需要严格按照规定进行。通常情况下，首先需要对样品进行表面消毒处理。消毒方法可以选择70%乙醇、0.1%次高氯酸钠等。接着，需要对样品进行分离培养，得到纯种菌株。这个过程中，需要注意对环境和工具的消毒，以防止污染。

最后，通过形态学观察和生理生化特性检测等方法，对分离出来的病原菌进行鉴定。例如，可以观察病原菌的菌落特征、形态特征、革兰染色结果、代谢功能等。此外，可以利用分子生物学技术进行PCR检测、基因测序等分子鉴定方法，以提高鉴定的准确性和可靠性。

综上所述，GB/T28094-2011规定的芒果细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法是一种科学、规范的方法。通过该方法，可以有效地保证芒果生产的质量和安全。希望广大农业从业者能够关注并积极应用这项技术。

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